Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Morphologie gereinigter extrazellulärer Vesikel zu beobachten und eine spezifische Proteinlokalisierung innerhalb extrazellulärer Vesikel mittels Elektronenmikroskopie durchzuführen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Forschungsphase der extrazellulären Vesikel zu beantworten, wie z. B. die Kategorisierung des Exosoms und spezifischer Proteine, die sich darin befinden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um den Anteil spezifischer Proteine zu beobachten, der sich sowohl innerhalb als auch außerhalb des Exosoms befindet.

Die Implikation dieser Technik besteht darin, die Diagnose verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs und Bakterieninfektionen, sicherzustellen. Obwohl diese Methode Einblicke in das Exosom geben kann, kann sie auch auf andere biologische Proben, die mikrozelluläre Inkubation und die spezifische Proteinlokalisierung angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da es zu einer Kontamination kommt, während die Immungoldpartikel unspezifisch gebunden sind.

Bereiten Sie Exosomen mit Standardtechniken in Kultur vor. Dann ultrazentrifugieren Sie den Kulturüberstand der HCT116-Zellen, um die Exosomen aus dem Medium zu pelletieren. Entfernen Sie nach dem Pelletieren vorsichtig den Kulturüberstand.

Um das gereinigte Exosomenpellet zu fixieren, fügen Sie einen Milliliter 2,5 % Glutaraldehyd in eine 0,1 molare Soldiumcacodylatlösung bei einem pH-Wert von 7,0 hinzu. Inkubieren Sie die Lipid-Bylayer-Vesikel eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend das Fixiermittel und spülen Sie die Pellets 10 Minuten lang mit einem Milliliter einer 0,1 molaren Natriumcacodylat-Pufferlösung bei Raumtemperatur aus.

Anschließend fixieren Sie die Proben mit einem Milliliter 2%Osmiumtetroxid für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie das Exosomenpellet dreimal mit dem 0,1-molaren Natriumcacodylatpuffer aus, wobei Sie den Puffer alle zehn Minuten wechseln. Dehydrieren Sie dann die Probe, indem Sie sie jeweils 10 Minuten lang in einer Reihe von abgestuften Acetonkonzentrationen schütteln.

Mischen Sie als nächstes eine Lösung aus drei Teilen Aceton und einem Teil niedrigviskoser Einbettungsmischung. Ersetzen Sie das Aceton durch diese Mischung und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang. Erhöhen Sie das Verhältnis des niedrigviskosen Einbettmediums weiter und inkubieren Sie bei jedem Schritt 30 Minuten lang.

Zum Schluss wird das Exosomenpellet über Nacht bei Raumtemperatur in 100 % des niedrigviskosen Einbettungsgemisches inkubiert. Am nächsten Tag betten Sie die Probe mit einer Einbettform in eine reine niedrigviskose Einbettmischung ein und backen Sie sie 24 Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Bereiten Sie mit einem Ultramikrotom Schnitte mit einer Dicke von 60 Nanometern vor.

Legen Sie die Abschnitte auf ein Nickelgitter und färben Sie einige von ihnen 20 Minuten lang doppelt mit 2%Uranylacetat, gefolgt von Bleicitrat für 10 Minuten. Legen Sie dann den gefärbten Schnitt in ein Transmissionselektronenmikroskop und betrachten Sie die Probe mit 80 Kilovolt und befolgen Sie die automatischen Einstellungen für die Belichtungszeit. Wenn Sie ein Exosomenbild vor Augen haben, erfassen und speichern Sie das Bild mit der Mikroskopsoftware.

Zu Beginn inkubieren Sie Gitter mit 60 Nanometer dicken, ungefärbten Abschnitten in 50 Mikrolitern Tropfen von 0,02 molar Glycin für 10 Minuten, um die freien Aldehydgruppen zu löschen. Spülen Sie dann die Abschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 100 Mikrolitern destilliertem Wasser ab. Nach dem letzten Spülen werden die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS mit 1 %BSA inkubiert.

Inkubieren Sie dann die Gitter eine Stunde lang in 50 bis 100 Mikrolitern Tropfen eines Anti-KRS-Antikörpers. Waschen Sie anschließend die Gitter fünfmal für jeweils 10 Minuten in einem Tropfen PBS mit 0,1 % BSA. Übertragen Sie dann die Gitter auf einen Tropfen eines geeigneten Sekundärantikörpers und inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie nun die Gitter fünfmal für 10 Minuten, jeweils mit einem separaten Tropfen PBS mit 0,1 % BSA. Färben Sie die Abschnitte 20 Minuten lang im Dunkeln doppelt mit 2%Uranylacetat, gefolgt von Reynolds-Bleicitrat für 10 Minuten. Legen Sie den gefärbten Schnitt in ein Transmissionselektronenmikroskop und betrachten Sie die Probe mit 80 Kilovolt und bilden Sie sie wie zuvor gezeigt ab.

Um eine negative Färbung durchzuführen, fixieren Sie die gereinigten Exosomen nach der Isolierung fünf Minuten lang mit einem Milliliter 2%Paraformaldehyd. Dünne, mit Formvar/Kohlenstofffilm beschichtete Kupfer-EM-Gitter mit 200 Mesh werden eine Minute lang mit Glimmentladung behandelt, dann fünf bis sieben Mikroliter der Exosom-Suspensionslösung auf ein Gitter geladen und eine Minute lang inkubiert. Wenn die Konzentration des Exosoms zu hoch ist, verdünnen Sie die Konzentration auf ein geeignetes Niveau.

Färben Sie die Exosomen sofort mit etwa 20 Tropfen einer gefilterten 1%igen Uranylacetatlösung auf der Oberfläche des EM-Gitters. Entfernen Sie die überschüssige Uranylacetatlösung vom Gitter, indem Sie den Gitterrand mit Filterpapier berühren, und spülen Sie das Gitter dann schnell mit einem Tropfen Wasser ab. Lege den Rost mit einer Pinzette auf den Tisch und bedecke den Rost teilweise mit einer Kulturschale.

Lassen Sie das Gitter 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen und bilden Sie dann das Gitter ab oder lagern Sie es in einer elektronenmikroskopischen Gitterbox für die zukünftige Beobachtung. Beginnen Sie mit der Behandlung der dünnen, mit Formvar/Kohlenstofffilm beschichteten, 200-Mesh-Kupfer-EM-Gitter mit Glimmentladung für 30 Sekunden. Laden Sie dann fünf bis sieben Mikroliter der in 2%iger Paraformaldehydlösung fixierten Exosomen auf das Gitter und inkubieren Sie sie dort fünf Minuten lang.

Spülen Sie anschließend die Exosomen mit 100 Mikrolitern PBS, dreimal für jeweils 10 Minuten. Behandeln Sie das Exosom, das Gitter enthält, 10 Minuten lang mit 50 Mikrolitern einer 0,5-molaren Glycinlösung, um die freien Aldehydgruppen zu löschen. Übertragen Sie dann die Gitter in einen Tropfen PBS mit 1 % BSA und blockieren Sie sie 30 Minuten lang.

Inkubieren Sie nun die Gitter mit 50 bis 100 Mikrolitern Anti-PD-L1-Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie das Gitter 10 Minuten lang mit fünf separaten Tropfen PBS mit 0,1 % BSA und übertragen Sie das Gitter dann eine Stunde lang auf einen Tropfen des Sekundärantikörpers. Waschen Sie dann den Rost 10 Minuten lang mit fünf separaten Tropfen PBS mit 0,1 % BSA und waschen Sie dann den Rost mit zwei separaten Tropfen destilliertem Wasser.

Wenn Sie fertig sind, führen Sie eine negative Färbung mit 2 %Uranylacetat durch, wie zuvor gezeigt, und bebildern Sie die Proben oder bewahren Sie sie für zukünftige Beobachtungen in einer EM-Gitterbox auf. Die hier beobachtete Exosomenmorphologie ist das Produkt negativer Färbung. Diese Exosomen weisen eine typische becherförmige Morphologie auf, die ein Artefakt ist, das während des Trocknungsprozesses auftreten kann.

Zusätzliche Informationen können durch die Färbung von Whole-Mount-Immunogold gewonnen werden, wie z. B. die Position bestimmter Proteine im Exosom. Hier zeigen die weißen Pfeile die Position von PD-L1 an. In geschnittenen Bildern zeigten die Vesikel eine Lumenstruktur, die als strukturelles Merkmal von Exosomen bekannt ist.

Auch diese können mit Immungold gefärbt werden, um bestimmte Proteine in den Exosomen zu identifizieren. Sobald die Immunogold-Färbetechnik gemeistert ist, kann sie nach einfacher Vorbereitung und Sektion in fibrösen Zellen durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die doppelte Immunfärbung durchgeführt werden, um gleichzeitig die Position von zwei verschiedenen Proteinen zu identifizieren.

Nach jeder Entwicklung kann diese Technik im Bereich der extrazellulären Vesikel eingesetzt werden, um Krankheitsdiagnosen in Biopsien zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine spezifische Proteinlokalisierung innerhalb des Exosoms identifizieren können. Vergessen Sie nicht, dass sie mit Fixierlösungen wie Chlorhydrat, Paraformaldehyd und Osmiumtetroxid arbeiten, die extrem gefährlich sein können, und Vorsichtsmaßnahmen wie belüftete Abzüge und Latexhandschuhe sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.