Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Trophoblasten-Zellkulturmodells ist es, die Wirkung von Adipositas-bedingten Entzündungen auf die Regulation kritischer Signalwege in Trophoblasten zu messen. Der Hauptvorteil dieses Kontrollsystems besteht darin, dass es einen Zusammenhang zwischen der TNF-alpha-vermittelten Entzündung und der Genregulation in der Plazenta im Zusammenhang mit mütterlicher Adipositas herstellt. Der Hauptvorteil dieses experimentellen Systems besteht darin, dass es Beziehungen zwischen TNF-alpha-vermittelter Entzündung und Genregulation in der Plazenta im Zusammenhang mit mütterlicher Adipositas herstellt.

Verfahren wird von Bailey Simon und Matt Bucher, Technikern aus meinem Labor, vorgeführt. Zottengewebe sollte so bald wie möglich nach der Entbindung aus der Plazenta entnommen werden, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten oder weniger. Mit der Chorionplatte nach oben schneiden Sie mit Pinzette und Schere nach dem Zufallsprinzip zwei bis drei Abschnitte in voller Dicke heraus, zwei bis drei Zentimeter von der Peripherie der Plazenta entfernt.

Vermeiden Sie Teile der Plazenta, die abnormal erscheinen. Schneiden Sie die Chorion- und Basalplatten sowie alle großen Blutgefäße ab. Legen Sie das resultierende Zottengewebe in ein warmes, vollständiges Medium.

Beginnen Sie innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme des Zottengewebes mit der Isolierung der Trophoblasten. Legen Sie jedes Stück Zottengewebe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit PBS bei Raumtemperatur gefüllt ist, und rühren Sie es vorsichtig um, um überschüssiges Blut im Gewebe freizusetzen. PBS umfüllen und durch frisches PBS ersetzen.

Wiederholen Sie die PBS-Spülung, bis der größte Teil des überschüssigen Blutes entfernt ist. Die PBS-Spülung ist hellrot oder rosa, wenn das Tuch gründlich gespült wird. Legen Sie das Zottengewebe in eine sterile Petrischale und entfernen Sie so viele Blutgefäße wie möglich, indem Sie mit einem Objektträger das weiche Zottengewebe vorsichtig von den Gefäßen abkratzen.

Das entstandene Zottengewebe mit einer Schere fein zerkleinern. Das zerkleinerte Zottengewebe wird entsprechend den berechneten Volumina auf der Grundlage der spezifischen Aktivität von Trypsin und DNase in eine sterile Flasche mit Aufschlusslösung überführt. Inkubieren Sie die Verdauungsflasche in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Schütteln bei 70 U/min für 35 Minuten.

Kippen Sie die Verdauungsflasche nach 35 Minuten auf die Seite und lassen Sie die unverdauten Gewebestücke am Boden der Flasche absetzen. Ziehen Sie den Überstand vorsichtig mit einer serologischen Pipette heraus und vermeiden Sie dabei das abgesetzte Gewebe. Geben Sie den Überstand durch ein 100-Mikron-Zellsieb gleichmäßig zwischen konischen 50-Milliliter-Röhrchen ab.

Starten Sie den zweiten Aufschluss, indem Sie dem verbleibenden abgesetzten Gewebe Aufschlusslösung hinzufügen und die Flasche im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Schichten Sie vorsichtig drei bis fünf Milliliter Neugeborenenserum (NCS) unter den gespannten Überstand aus dem ersten Aufschluss, indem Sie es langsam aus einer serologischen Pipette am Boden des Röhrchens abgeben. Zwischen dem gespannten Überstand, der Trophoblasten und NCS enthält, sollte ein Meniskus sichtbar sein.

Die Überstände werden über NCS bei 1.250 mal g bei 20 Grad Celsius 15 Minuten lang zentrifugiert. Das resultierende Pellet enthält rote Blutkörperchen in der untersten Schicht, gefolgt von einer weißen Schicht mit Trophoblastzellen. Auf die gleiche Weise den Überstand aus dem zweiten und dritten Aufschluss abseihen.

Schichten Sie NCS unter den abgeseihten Überstand und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 1.250 g bei 20 Grad Celsius. Sobald alle Überstände zentrifugiert und die NCS- und Überstandsschichten entfernt wurden, wird jedes Pellet in fünf Millilitern warmem, vollständigem Medium erneut suspendiert und dann die Suspensionen gepoolt. Die Zellsuspension gleichmäßig auf zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen verteilen und bei 1.250 mal g bei 20 Grad Celsius 15 Minuten lang zentrifugieren.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie jedes der Zellpellets wieder in sechs Millilitern warmem, vollständigem Medium. Um dieses Verfahren zu starten, teilen Sie die Zellsuspension gleichmäßig auf vier Dichtegradienten auf, indem Sie die Zellsuspension mit einer Transferpipette langsam und vorsichtig auf die Dichtegradienten schichten. Zentrifugieren Sie die Dichtegradienten bei 1.250 mal g bei 20 Grad Celsius für 20 Minuten mit minimaler Beschleunigung und Verzögerung.

Dadurch sollten unterscheidbare Bänder aus sedimentierten Zellen entstehen. Entfernen Sie langsam und vorsichtig die oberste Schicht des Dichtegradientenmediums, bis die undurchsichtige Bande mit den Trophoblastzellen erreicht ist. Übertragen Sie die Trophoblast-Banden in zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie sie mit warmem, vollständigem Medium.

Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig drei- bis sechsmal um, um sie zu mischen, und zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei 1.250 g bei 20 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie jedes Zellpellet wieder in fünf Millilitern warmem, vollständigem Medium. Kombinieren Sie die Zellsuspensionen und zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau.

Der nächste Schritt nach der Zellzählung ist die Platte der Zellen. Platte drei Millionen Zellen pro Well in jeder Sechs-Well-Platte. Bewegen Sie die Platte vorsichtig hin und her und von einer Seite zur anderen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Lassen Sie die plattierten Zellen etwa 30 Minuten lang in der Laminar-Flow-Entlüftung, damit sich die Zellen gleichmäßig verteilen, absetzen und am Boden der Vertiefungen haften können. Stellen Sie die Platten nach 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit. Untersuchen Sie die Trophoblasten nach 24-stündiger Kultur unter einem Mikroskop, um die Anhaftung und die korrekte Trophoblastenmorphologie zu bestätigen.

Die Zellen können nach 24 Stunden Kultur behandelt werden. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter TNF-alpha-ergänztes Medium pro Well. Stellen Sie die Platten wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Ersetzen Sie nach 24 Stunden TNF-alpha-Exposition das mit TNF alpha ergänzte Medium durch das vollständige Medium. Inkubieren Sie weitere 24 Stunden. 24 Stunden nach der Entfernung von TNF alpha das Medium aspirieren und die Zellen vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur spülen.

Geben Sie direkt in jede Vertiefung 80 Mikroliter eiskalten Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer, der frisch zugegebene Protease- und Phosphatasehemmer enthält. Entfernen Sie die Zellen mit einem Zellschaber von der Platte. Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und poolen Sie die Vertiefungen innerhalb der Behandlungsgruppen.

Eisieren Sie die Zellen, indem Sie die Röhren mindestens drei Intervalle von 15 Sekunden lang auf hoher Stufe vortexen. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius und wiegen Sie sie 15 Minuten lang. Wirbeln Sie die Röhren wieder auf hoher Stufe.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 10.000 g Celsius, um Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Lagern Sie die zellulären Proteinproben bei 80 Grad Celsius bis zur Analyse durch Western-Blotting für das gewünschte Protein.

Nach 72 Stunden Kultur bestätigte die immunzytochemische Analyse von Cytokeratin 7, rot dargestellt, in primären Trophoblasten, dass die Zellen einer Synzytialisierung unterzogen wurden, was durch das Vorhandensein von mehrkernigen Zellmassen belegt wird. Darüber hinaus ergab die immunzytochemische Analyse von Vimentin, ebenfalls in rot, nur sehr wenige kontaminierende Fibroblasten. Die nukleare Gegenfärbung ist in beiden Bildern blau dargestellt.

Behandlung mit TNF alpha bis zu 250 Pikogramm pro Milliliter hochregulierte Rubikonexpression. Bei TNF-alpha-Konzentrationen von mehr als 250 Pikogramm pro Milliliter sanken die Rubicon-Expressionsniveaus wieder in Richtung Ausgangswert und sogar darunter. Ebenso ist Rubicon in schockgefrorenen Zottenbiopsien aus Plazenten aus adipösen Schwangerschaften mit weiblichen Föten im Vergleich zu schlanken Kontrollen signifikant hochreguliert.

Einmal gemeistert, kann die Isolierung von Trophoblasten aus Zottengewebe in sechs bis sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, Materialien und Reagenzien im Voraus vorzubereiten, damit Sie bewusst und effizient arbeiten können. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Assays, z. B. zur Messung der zellulären Bioenergetik, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. beeinflusst eine Entzündung in der adipösen intrauterinen Umgebung die metabolische Kapazität von Trophoblasten?

Nach dieser Entwicklung ebnete die Methode den Weg für die Plazentaforscher, um den Einfluss der mütterlichen Umgebung auf die Funktion der Trophoblasten zu ermitteln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Trophoblasten aus Zottengewebe für Ihr Zellkulturexperiment isolieren und wie Sie die Wirkung der TNF-alpha-vermittelten Entzündung bei der Regulation kritischer Signalwege in den Trophoblasten bestimmen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe, kultivierten Zellen, DMSO, Acrylamid und Reduktionsreagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen geeigneter PSA und die Verwendung aseptischer Techniken.