Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die Auswirkungen einer Pilzinfektion im Modellorganismus C.Elegans zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige mechanistische Fragen auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu beantworten, wie z. B. Virulenzfaktoren für Krankheitserreger, Immuneffektoren des Wirts sowie die Wirkstoffforschung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein experimentell handhabbares System handelt, um Wirt-Erreger-Interaktionen aus beiden Blickwinkeln zu untersuchen.

Es ist ein schnelles, einfaches und kostengünstiges System. Obwohl diese spezielle Methode Einblicke in pilzliche Krankheitserreger geben kann, kann sie auch auf andere Infektionserreger wie Bakterien oder sogar mehrere Organismen angewendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in einem lebenden Wirt zu untersuchen. Um einen Wurmstocher herzustellen, schneiden Sie ein 1,5 Zentimeter langes Stück Aluminiumdraht ab und führen Sie dann vorsichtig etwa 0,5 Zentimeter des Drahtes in die Spitze einer Pasteurpipette ein.

Schmelzen Sie die Pipettenspitze aus Glas mit einem Bunsenbrenner oder einer Alkohollampe, indem Sie sie langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher mit der Pipette verbunden ist, ohne die ursprüngliche Form der Pipettenspitze zu beeinträchtigen. Zum Schluss biegst du das Ende des Drahtes vorsichtig mit einer Pinzette, um eine kleine Schlaufe zu erzeugen. Um große Mengen an Würmern schnell auf neue Platten zu übertragen, schneiden Sie mit einem Spatel ein Stück NGM-Agar, das die ausgewählten Würmer enthält.

Entfernen Sie dann das abgeschnittene Stück und legen Sie es mit der Vorderseite nach unten auf den Rand des Flickens von OP50 auf eine neue Platte. Um Würmer einzeln zu übertragen, flammen Sie den Draht im Wurmpickel, bis er rot ist, nehmen Sie ihn dann von der Flamme und lassen Sie ihn einige Sekunden abkühlen. Kratzen Sie mit dem Draht am Plektrum vorsichtig das Pflaster der OP50-Kultur ab, das auf der neuen Platte gewachsen ist, und bedecken Sie dabei den Draht auf dem Plektrum.

Die viskose Kultur, die die Spitze des Drahtes bedeckt, sorgt dafür, dass Würmer an der Spitze der Grube haften bleiben. Verwende also eine Wischbewegung, um ausgewählte Würmer sanft aufzuheben. Sobald die ausgewählten Würmer gesammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte, indem Sie die Kultur vorsichtig über den Agar streichen.

Legen Sie dann den Draht in die Flamme, um die verbleibende Kultur auf dem Plektrum zu entfernen. Platzieren Sie etwa 20 erwachsene Tiere, indem Sie sie entweder aufpicken oder in Stücke schneiden, auf einen Teller mit 50 Mikrolitern E.coli-Stamm OP50 setzen. Um die Eier nach ein bis zwei Tagen zu sammeln, fluten Sie die Platte mit 10 Millilitern M9-Puffer

Schwenken und rühren Sie dann mit einer serologischen Glaspipette den Inhalt auf der Agarplatte vorsichtig um, um erwachsene Tiere oder Eier freizusetzen, die an OP50 haften. Sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit, die die Eier und erwachsenen Tiere enthält. Die M9- und OP50-Lösung wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Das Röhrchen bei 2.100 x g zwei Minuten lang zentrifugieren. Aspirieren Sie dann etwa neun Milliliter Überstand, ohne das Pellet zu stören. Verwenden Sie anschließend zwei Milliliter steriles Wasser, einen Milliliter Bleiche und einen Milliliter 0,25 molares Natriumhydroxid, um das Pellet zu resuspendieren.

Vorsichtig durch Inversion mischen, bis etwa 70 % der erwachsenen Tiere lysiert erscheinen. In der Regel bleiben die Eier während dieser kurzen Bleichbehandlung aufgrund ihrer Schale intakt. Es ist wichtig, dass die Exposition gegenüber Bleichmittel in diesem Schritt begrenzt wird.

Längerer Kontakt mit Bleichmittel zerstört die Eier. Wenn die Zubereitung der Eier fehlschlägt, begrenzen Sie entweder die Dauer der Exposition gegenüber Bleichmittel oder verdünnen Sie die Lösung. Das konische Röhrchen wird bei 990 x g zwei Minuten lang zentrifugiert.

Saugen Sie den Überstand an, ohne das Pellet zu stören. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern M9-Puffer. Nach dem erneuten Schleudern und Entfernen des Überstands, ohne das Pellet zu stören, verwenden Sie 200 Mikroliter M9-Puffer, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Geben Sie drei bis fünf Milliliter YPD in ein steriles Reagenzglas und verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um es mit einer einzigen Kolonie von Candida albicans zu impfen. Legen Sie das Rohr für etwa 16 bis 18 Stunden bei 30 Grad Celsius auf eine Drehtrommel. Beschriften Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen mit C.albicans und ein anderes mit OP50 und notieren Sie dann das Gewicht jedes leeren Röhrchens.

Übertragen Sie 500 Mikroliter der C.albicans-Kultur über Nacht in das Röhrchen mit der Aufschrift C.Albicans. Und 1500 Mikroliter der OP50-Kultur über Nacht in das mit OP50 beschriftete Röhrchen. Die Röhrchen werden 10 Minuten lang bei 16, 100 x g zentrifugiert, dann wird der Überstand abgesaugt, ohne die Pellets zu stören.

Verwenden Sie 500 Mikroliter steriles Wasser, um jedes Pellet zu resuspendieren. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 16.100 x g für fünf Minuten. Saugen Sie den Überstand an, ohne die Pellets zu stören.

Notieren Sie dann das Endgewicht der Mikrofugenröhrchen. Bestimmen Sie das Gewicht jedes Pellets, indem Sie das Anfangsgewicht der Mikrofugenröhrchen vom Endgewicht abziehen. Resuspendieren Sie das C.albicans-Pellet unter Verwendung von sterilem Wasser auf 10 Milligramm pro Milliliter und das OP50-Pellet auf 20 Milligramm pro Milliliter.

Stellen Sie dann eine Masterinfektionsmischung her, indem Sie 10 Mikroliter einer 50-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung von Streptomycin, 2,5 Mikroliter OP50-Kultur, 0,5 Mikroliter C.Albicans-Kultur und 7 Mikroliter steriles Wasser kombinieren.

Für Kontrollplatten erstellen Sie einen Mastermix, indem Sie das Volumen der C.albicans-Kultur durch steriles Wasser ersetzen. Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um 20 Mikroliter Infektionsmischung oder OP50-Kontrolllösung auf die Mitte der NGM-Platten zu säen. Nachdem Sie die Eier vorbereitet haben, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, zählen Sie die Eier unter dem Sezierbereich.

Und verwenden Sie M9, um die Eilösung zu verdünnen, bis eine Konzentration von etwa fünf bis sechs gesunden Eiern pro Mikroliter erreicht ist. Geben Sie mit einer Pipette eine 20-Mikroliter-Probe mit etwa 30 Eiern auf eine vorbereitete NGM-Platte im Bereich zwischen der Bakterienkultur und der Seite der Platte. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei 20 Grad Celsius.

Zählen Sie dann unter einem Präpariermikroskop die Anzahl der lebenden und toten adulten Würmer auf jeder Platte. Betrachten Sie das Tier als tot, wenn es nicht darauf reagiert, mit einem Aluminiumdraht auf den Kopf geklopft zu werden oder auf die Platte zu klopfen. Zählen Sie auch die Anzahl der Würmer mit Dar und bestätigen Sie, ob ein Tier Dar hat, indem Sie schnell auf die Platte auf dem Tisch des Seziermikroskops klopfen.

Tiere ohne Dar bewegen sich sofort rückwärts, während Tiere mit Dar entweder wiederholte Tipprunden benötigen, um ihre Richtung umzukehren, oder sie tun dies überhaupt nicht. Übertragen Sie alle verbleibenden adulten Würmer jeden zweiten Tag durch Pflücken von Würmern auf eine neue Infektions- oder Kontrollplatte. Führen Sie zu diesem Zeitpunkt bei Bedarf einen Überlebenstest durch, indem Sie jeden Tag die Anzahl der lebenden, toten und fehlenden Würmer verfolgen.

Es ist wichtig, die Würmer mindestens jeden zweiten Tag zu übertragen. Dies stellt sicher, dass die adulten Würmer, die in diesem Assay bewertet werden, nicht mit ihren Nachkommen verwechselt werden. C.elegans wurden über einen Zeitraum von sechs Tagen C.albicans ausgesetzt und auf Anzeichen einer Infektion, eines Fortschreitens der Krankheit und des Todes beobachtet.

Der Dar-Phänotyp ist am vierten Tag des Überlebenstests am deutlichsten sichtbar, was sich in einer hervorstehenden Analregion zeigt, die bei dem nicht infizierten Tier nicht sichtbar ist. Es ist auch bekannt, dass Würmer, die mit C.albicans infiziert sind, Schwellungen in der Vulvaregion aufweisen. In beiden Fällen ist der Wurm nicht in der Lage, die Infektion nach Erreichen dieses Stadiums zu beseitigen.

Um die Besiedlung von C.albicans im Darmlumen sichtbar zu machen, wurden Würmer mit Wildtyp-C.albicans gefüttert, die mit RFP markiert waren und die Besiedlungsbereiche rot fluoreszieren lassen. C.albicans besiedeln das Darmlumen am dritten Tag des Assays. Wie hier gezeigt, zeigten infizierte Würmer eine stärkere Darmblähung als bei der nicht infizierten Kontrolle.

In diesem Experiment wurde die Fähigkeit der Würmer getestet, eine Infektion durch die virulente C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 Doppelmutante zu überleben. Würmer, die mit der Doppelmutante infiziert sind, leben statistisch signifikant länger als Kontrollen. Dies deutet darauf hin, dass diese beiden Gene für die Virulenz von C. albicans gegen C. Elegans erforderlich sind.

Einmal gemeistert, kann jeder Teil dieser Technik in ein bis zwei Stunden pro Tag während der Lebensdauer des Wurms durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass man möglicherweise Infektionserreger verwendet. Daher sollten geeignete Biosicherheitsvorkehrungen getroffen werden.

Kleinere Modifikationen können an diesem grundlegenden Verfahren vorgenommen werden, wie z.B. die Einführung zusätzlicher mikrobieller Wirkstoffe, um mikrobielle Interaktionen im Kontext eines lebenden Wirts zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten, um die mikrobielle Virulenz, die Mechanismen der angeborenen Immunantwort des Wirts sowie die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C.Elegans erhält und manipuliert und den Organismus verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Wirtsmikroben auf molekularer Ebene zu untersuchen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit mikrobiellen Krankheitserregern und chemischen Reagenzien wie Natriumazid gefährlich sein kann und geeignete Sicherheitsvorkehrungen wie PSA und Abfallentsorgungsmethoden getroffen werden sollten.