Name: Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Caenorhabditis elegans als vielseitiges Modell für Host-Mikroben-Interaktionen dient. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pilzinfektionen, Pathogen-Virulenzfaktoren und Wirtsimmunantworten.

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Diese Arbeit wurde durchgeführt und unterstützt von Worcester Polytechnic Institute.

1. Vorbereitung der Nematode Wachstum Medium (NGM) <ol><li>für 1 L der Medien, zu kombinieren, 20 g Agar, 2,5 g organischer Stickstoff-Quelle (z.B., Bacto-Pepton) und 3 g Natrium-Chlorid in eine 2 L Flasche. 975 mL sterilem Wasser hinzugeben.
	<ol><li>Add in einer sterilen Stir Bar. Wenn eine automatische Media Ausgießer, Autoklaven Tubing und Medien für 15 min; Medien sollten Autoklaven für mehr wenn ein höheres Volumen erfolgt.</li>
	</ol></li> <li>Medien auf Platte rühren und abkühlen lassen.
	<ol><li>Sobald Medien warm an (ca. 60 ° C) aseptisch ist fügen Sie 1 mL 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 und 1 mL 0,5 % Cholesterin im Äthanol.</li>
		<li>Medien (von hand oder durch automatische Pumpe) unter Laminar-Flow in Gießen 35 mm x 10 mm sterile Petrischalen. Unter Haube für 1-2 Tage vor dem Gebrauch trocknen lassen. 
		Hinweis: Platten sollten gespeichert werden, bei 4 ° C um Kontaminationen zu vermeiden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Macht ein Wurm holen <ol><li>schneiden Sie ein 1,5 cm Stück von Aluminiumdraht. Legen Sie ca. 0,5 cm Länge in der Spitze einer Pasteurpipette.
	<ol><li>Mit einem Bunsenbrenner oder Alkohol-Lampe, schmelzen die Pipettenspitze Glas durch langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher auf die Pipette eingehalten wird, ohne die ursprüngliche Form des die Pipettenspitze.</li>
	</ol></li></ol> 3. Vorbereitung der E. Coli-Kultur <ol><li>mit einer sterilen Schleife, einzige Kolonie von E. Coli-Stamm OP50 in 200 mL Brühe Luria impfen. Inkubation über Nacht unter Schütteln bei 37 ° c</li>
	<li>Die Flüssigkultur ist bereit für den Einsatz am Folgetag und bei 4 ° C bei Nichtgebrauch gespeichert werden können. 
	Hinweis: Die E. Coli-Stamm, OP50, dient als Nahrungsquelle für C. Elegans. Dieser Kultur verwendet werden, für bis zu mehrere Monate bei 4 ° c</li>
</ol> 4. Wesentlichen C. Elegans Wartung <ol><li>Samen NGM Agarplatten mit E. Coli von Schmierblutungen etwa 50-100 µL bereit OP50 Flüssigkultur in die Mitte des Tellers vorbereitet.</li>
	<li>Abdeckplatten und bei Raumtemperatur für 24 Std. trocknen lassen. Nach dem Trocknen legen Platten bei 37 ° C über Nacht für ein schnelles Wachstum oder halten bei Raumtemperatur, wenn langsameres Wachstum gewünscht wird.</li>
	<li>Der Platte Würmer hinzufügen, indem entweder &#34; chunking, &#34; (siehe Protokoll Schritt 5 &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer &#34;), Kommissionierung Würmer einzeln oder Wurm Eiern direkt auf den Teller zu platzieren (siehe Protokoll Schritt 6 &#34; Ei Vorbereitung &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking und Kommissionierung Würmer Hinweis: &#34; Chunking, &#34; bezieht sich auf eine Praxis, die häufig in C. Elegans Wartung. Dabei schneiden einen Abschnitt der NGM-Agar-Platte, die Würmer enthält, und dieses Stück auf eine neue Platte zu übertragen, damit auch eine große Anzahl von Würmern im Prozess übertragen. Verschmutzung kann auch aus der Platte auf diese Weise geschnitten werden. Bei der Kommissionierung Würmer, ist es wichtig, die Integrität des Nährbodens zu pflegen, denn Würmer in Löcher im Agar verloren gehen können. Darüber hinaus ist es wichtig, damit die Abholung abkühlen, bevor Sie die Platte, um zu verhindern, dass der Agar schmelzen oder brennen die Würmer berühren können.
<ol><li>Um schnell große Mengen an Würmern auf neue Teller übertragen schneiden Sie ein Stück der NGM-Agar, enthält die ausgewählten Würmer mit einem Spatel. Entfernen Sie das geschnittene Stück und legen Sie es Gesicht nach unten am Rand des Rasens OP50 auf eine neue Platte.</li>
	<li>Transfer Würmer einzeln wie folgt im Protokoll Schritt 8.2, &#34; Survival Test, &#34; mit einem Wurm nehmen. Flamme des Drahtes in der Wurm holen bis es rot ist. Von der Flamme entfernen und für ein paar Sekunden abkühlen lassen.</li>
	<li>Mit den Draht auf die Abholung, sanft den Rasen der OP50 Kultur angebaut auf der neuen Platte, über den Draht auf die Pick kratzen.</li>
	<li>Die Viskose Kultur über die Spitze des Drahtes macht Würmer halten Sie sich an die Spitze der Abholung, so sanft ausgewählten Würmer mit einer swiping Bewegung abholen.</li>
	<li>Nach ausgewählten Würmer versammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte durch sanft streichen Kultur auf Agar. Legen Sie den Draht in die Flamme, verbleibenden Kultur bei der Abholung zu entfernen.</li>
</ol> 6. Ei-Vorbereitung <ol><li>Ort etwa 20 ausgewachsene Tiere (ca. 2-3 Tage nach dem Schlupf, wenn gewachsen bei 20 ° C) durch entweder Abnehmen oder chunking gemäß Protokoll Schritt 5, &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer, &#34; auf einen Teller mit 50 ausgesät µL der E. Coli-Stamm, OP50.</li>
	<li>Zu die Eiern sammeln, überfluten die Platte mit 10 mL der M9 Puffer nach 1-2 Tagen. Mit Hilfe einer serologischen Glaspipette, wirbeln Sie und schütteln Sie sanft den Inhalt auf der Agarplatte freizugebende Eiern OP50 oder Erwachsene Tiere stecken. Sammeln Sie alle Flüssigkeit, die mit den Eiern und Erwachsene.</li>
	<li>Transfer M9 und OP50 Lösung in einem 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie 15 mL konische Rohr bei 2.100 x g für 2 min.</li>
	<li>Ca. 9 mL überstand ohne störende OP50 Pellet Aspirieren.</li>
	<li>Das Pellet in 2 mL sterilem Wasser, 1 mL der Bleichmittel und 1 mL von 0,25 M NaOH Aufschwemmen.</li>
	<li>Vorsichtig mischen durch umdrehen, bis die Mehrzahl (ca. 70 Prozent) der erwachsenen Tiere lysierten erscheinen, in der Regel Eiern bleiben während dieser kurzen Bleichmittel Behandlung wegen ihrer Schale. Das konische Rohr auf 990 X g für 2 min. Zentrifugieren</li>
	<li>Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Wieder aussetzen das Pellet in 10 mL Puffer M9.</li>
	<li>Zentrifuge das konische Rohr in 990 X g für 2 min. Aspirat überstand ohne störende Pellet. Wieder aussetzen Pellet mit 200 µL Puffer M9. 
	Hinweis: Ei Vorbereitung kann mehrere Versuche erforderlich. Eiern können zerstört werden, wenn sie zu lange bleichen ausgesetzt sind. Wenn nicht schlüpfen, verringern Sie die Konzentration der Bleichmittel in Lösung oder verringern die Dauer der Exposition zu bleichen.</li>
</ol> 7. Infektion Teller Set-up <ol><li>3-5 mL YPD in ein steriles Röhrchen zu verzichten und mit einer einzigen Kolonie von Candida Albicans mit einer sterilen Schleife zu impfen.
	<ol><li>Legen Sie das Rohr auf einer rotatorischen Trommel für ca. 16-18 h bei 30 ° c</li>
	</ol></li> <li>Label eine 1,5 mL Microfuge Röhre zu C. Albicans und anderen OP50 enthalten enthalten. Nehmen Sie das Gewicht jedes Leerrohr.
	<ol><li>Ort 500 µL der Übernachtungen C. Albicans Kultur in Rohr gekennzeichnet C. Albicans und 1.500 µL der Nacht OP50 Kultur (aus Schritt 3.1) in das Rohr mit der Bezeichnung OP50.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 16.100 x g. Aspirat überstand ohne störende Pellet.</li>
		<li>Wieder aussetzen jedes Pellet mit 500 µL steriles Wasser. Zentrifuge für 5 min bei 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Aufnehmen das Endgewicht von Microfuge Rohren.</li>
		<li>Bestimmen das Gewicht jedes Pellet durch Subtraktion das Ausgangsgewicht der Microfuge Rohre aus der Auswaage.</li>
	</ol></li> <li>Mit sterilem Wasser wieder auszusetzen, C. Albicans Pellet bis 10 mg/mL und die OP50 Pellet bis 200 mg/mL. Machen Sie eine master-Infektion durch die Kombination von 10 µL einer Lösung von 50 mg/mL von Streptomycin, 2,5 µL OP50 Kultur, 0,5 µL von C. Albicans Kultur und 7 µL steriles Wasser mischen.
	<ol><li>Für Steuerplatten, einen master-Mix zu schaffen, indem die Lautstärke von C. Albicans Kultur mit sterilem Wasser. Seed 20 µL der Infektion Mix oder OP50-Control-Lösung auf die Mitte der NGM-Teller mit einer Mikropipette. 
		Hinweis: Rund 100 Würmer sind erforderlich, um statistische Signifikanz bei der Analyse bestimmen. Dieser Test ist in der Regel in dreifacher Ausführung ausgeführt. Somit erfolgt eine 3,2 x Infektion Mischung sowie eine 3,2 x Kontrolllösung. Diese Mischungen sind gemacht, um etwas mehr als 3 x das Original um sicherzustellen, dass eine volle 20 µL auf jede Platte, so dass Raum für Fehler ausgesät wird. Dieses master-Mix entsteht, weil der Rachen des Wurms im ersten Larvenstadium (L1-L3), C. Albicans konsumieren zu klein ist. Für die Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen wie Fluconazol ( Abb. 3 b) wird der Agent auf die Infektion Mischung eingeführt. Die Konzentration des Agenten wird empirisch bestimmt. Zum Beispiel in Abbildung 3 b, 50 µM Fluconazol vertreten ist, jedoch 0, 12.5, 25, 50 und 100 µM Fluconazol waren auch mit dem gleichen Protokoll getestet.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analyse der Analbereich verformt (Dar) Phänotyp und Survival Test <ol><li>visualisieren den Dar-Phänotyp Hinweis: Dar ist am besten visualisiert, in die L3-Stadium und darüber hinaus. Dar präsentiert sich als eine kleine Vorwölbung im Analbereich Post des Wurms ( Abbildung 2A), die im Laufe der Zeit stärker wird.
	<ol><li>Bestätigen, falls ein Tier Dar, indem man schnell die Platte auf der Bühne des Mikroskops Dissektion; Tiere ohne Dar Willen rückwärts sofort bewegen, während Tiere mit Dar entweder werden wiederholt runden klopfen, oder sie ihre Richtung umkehren wird das auch gar nicht tun.</li>
	</ol></li> <li>Überleben Assay <ol><li>komplette Ei Vorbereitung wie oben beschrieben im Protokoll Schritt 6, &#34; Ei Vorbereitung &#34;. Zählen Sie die Eizellen im Rahmen der Dissektion und verdünnen Sie die Ei-Lösung mit M9 zu, bis eine Konzentration von ca. 5-6 gesunden Eizellen pro Mikroliter erreicht ist. Mit einer Pipette 20 µL Probe mit ca. 30 Eiern auf vorbereiteten NGM-Teller, im Bereich zwischen der bakteriellen Kultur und der Seite der Platte zu verzichten (Eiern und Wurm Essen, OP50, sind in zwei unterschiedlichen Spots).</li>
		<li>Platten Inkubation bei 20 ° C für 48 h. Zählen Sie unter dem Mikroskop Dissektion die Anzahl der Leben und tot Erwachsene Würmer auf jeder Platte, sowie die Anzahl der Würmer mit Dar. Aufzeichnen der Prozent mit Dar.</li>
		<li>Ein Tier tot betrachten, wenn es nicht antwortet, wird auf den Kopf von einem Aluminiumdraht oder durch Tippen auf die Platte angezapft.</li>
		<li>Jeden zweiten Tag transfer restlichen Erwachsenen Würmer mit Kommissionierung, wie im Protokoll Schritt 5 beschrieben &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer, &#34; auf eine neue Infektion oder Kontrolle. An dieser Stelle bei Bedarf einen Überlebens-Assay durch tracking-Nummer live, Tote und vermisste Würmer pro Tag durchführen. 
		Hinweis: Dieser Test kann für zwei Wochen laufen beginnend mit Ei-Vorbereitung. Darüber hinaus sollte die Ei-Lösung auf die Bakterienkultur nicht verzichtet werden, da die Lösung kann Spuren von Bleichmittel enthalten, die die OP50 töten kann. Die Lösung sollte ca. 0,5 cm vom Rand der Platte verzichtet, wie Eiern zwischen den Seiten der Platte und der Agar geklebt werden können. Darüber hinaus aufgrund der schnellen Verbreitung von Würmern, Übertragung von Erwachsenen auf neue Teller ist entscheidend für die sie von ihren Nachkommen zu trennen.</li>
	</ol></li> <li>Analysieren überleben <ol><li>Ergebnisse mit überleben Kurve Analysesoftware zu analysieren (siehe Materialliste).</li>
		<li>Vergleichen Überleben Kurven mit der Grehan Breslow Wilcoxon-Methode (unter der Annahme, dass die Daten vom frühen Überlebenszeiten genauer als die späteren Zeiten, Gewicht die Daten entsprechend) sowie Form Statistikwerkzeugen 45. 
		Hinweis: Zum Beispiel in Abbildung 4 b -C, das Überleben der Würmer mit Mutant C. Albicans behandelt ist im Vergleich zu den behandelten mit isogenen Wildtyp Steuerelemente oder Complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Infektion und das Überleben Lebensdauer Überbelichtung zu C. Albicans , die wir beschrieben haben können geändert werden, um eine andere Erreger zu testen. Flüssige Kulturen anderer Bakterien oder Pilze können gemacht und C. Elegans in ähnlicher Weise zugeführt. Darüber hinaus können serielle Infektionen untersucht werden durch die Larve zu einem Erreger zunächst auszusetzen, wie beschrieben, und dann die Übertragung der Tiere auf eine neue Platte mi...

C. Elegans hat seit mehr als 50 Jahren als leistungsstarke Modellorganismus eingesetzt. In den 1960er Jahren Pionier südafrikanischer Biologe Sydney Brenner im Einsatz von C. Elegans , neuronale Entwicklung zu studieren ebnet den Weg für eine lange Linie von Wissenschaftlern, verschiedene Aspekte der Zell- und Biologie in Nematoden zu studieren. Diese Linie umfasst Nobelpreisträger Craig Mello und Andrew Fire für ihre RNAi Arbeit1, Robert Horvitz und John Sulston für ihre Arbeit über die Organentwicklung und Apoptose2,3,4, und Martin Chalfie für seine Arbeiten über grün fluoreszierendes Protein5. Obwohl diese Modellorganismus traditionell verwendet wurde, um Entwicklungsstörungen Molekularbiologie, in den vergangenen 15 Jahren zu studieren, haben Forscher damit begonnen, C. Elegans zu verwenden, um die Biologie der verschiedenen menschlichen Krankheitserreger einschließlich Pseudomonas untersuchen Aeruginosa, Staphylococcus Aureus, Salmonellen Entericaund Serratia Marcescens6,7,8,9,10. Diese Studien zeigten, dass viele der Mechanismen der Interaktion Mensch-Erreger beteiligt sind konserviert in Nematoden, aber auch das gibt es einige Immunität-Mechanismen, die einzigartig für dieses Modell Organismus11,12. In der Natur C. Elegans Begegnungen einer Vielzahl von Bedrohungen aus aufgenommenen Krankheitserreger im Boden vorhanden, und dies hat einen starken Selektionsdruck zu entwickeln und zu pflegen eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem in seiner Darmlumen zur Verfügung gestellt. Viele der Gene und Mechanismen, die im Bereich des Darmlumens werden durch hoch konserviert Elemente orchestriert, die gibt es auch in höheren Säugetiere11,13. C. Elegans stellt daher ein großes Modell, Magen-Darm-Erreger wie Salmonella Enterica14, Shigella Boydii15oder Vibrio Cholera16zu studieren.
Hier heben wir die bemerkenswerte Vielseitigkeit von C. Elegans als Modell Host Infektionserreger wie C. Albicanszu studieren. C. Elegans als Modell Host ermöglicht Hochdurchsatz-Screening für Virulenz, das ist weniger teuer und zeitaufwändig als ein Mausmodell, das häufig verwendet wird, um Candidiasis42zu studieren.
In dieser Studie zeigen wir, dass dieses Modell und ihre überleben Assay zuverlässig genutzt werden können, für das Studium Host angeborenen Immunsystem Effektoren wichtig gegen Infektionen, Erreger Determinanten, die Virulenz, fahren und pharmakologischen Verbindungen können in Pathogenese eingreifen. Ähnlich wie zuvor beschriebenen Tests diese Methode bietet eine Möglichkeit des Studiums Exposition gegenüber einem Krankheitserreger über die gesamte Lebensdauer des Tieres, vom Larvenstadium bis ins Erwachsenenalter, anstatt nur Erwachsenenalter bis Tod43,44. Zusammenfassend unsere C. Elegans - ist C. Albicans -Modell ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet werden kann, nicht nur die genetischen Grundlagen zu studieren, die Infektion und Immunität zu fahren, sondern auch neue Verbindungen für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Agar (granuliert, bakterilogische Qualität)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumdraht (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverses Mikroskop</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Stamm Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin, Sigma Grade, mindestens 99</td>%<td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Kulturröhrchen (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Software zur Analyse der Überlebenskurve)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon (Miller's)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petrischalen (35 x 10 mm)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtyp C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtyp C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

der fadenwurm caenorhabditis elegans - ein vielseitig in vivo modell zur host-mikroben-interaktionen

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Wir zeigen eine Methode mit Caenorhabditis Elegans als Modell Host, um mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Mikroben sind über die Ernährung machen dem Darm den primären Speicherort für die Krankheit eingeführt. Die Nematoden Darm strukturell und funktionell imitiert Säugetier-Darm und ist transparent macht es zugänglich für mikroskopische Untersuchung von Besiedlung. Hier zeigen wir, dass Krankheitserreger Krankheit und zum Tod führen können. Wir sind in der Lage, mikrobielle Mutanten zu identifizieren, die veränderten Virulenz zu zeigen. Seine erhaltenen angeborene Reaktion auf biotische betont macht C. Elegans ein ausgezeichnetes System Facetten des angeborenen Immunsystems Wirt Interaktionen zu untersuchen. Wir zeigen, dass Hosts mit Mutationen im gen duale Oxidase nicht reaktiven Sauerstoffspezies produzieren und sind nicht in der Lage, mikrobielle Beleidigung zu widerstehen. Weiter zeigen wir die Vielseitigkeit des vorgestellten überleben Tests zeigen, dass es zur Untersuchung der Auswirkungen von Inhibitoren des mikrobiellen Wachstums verwendet werden kann. Dieser Test kann auch verwendet werden, entdecken Pilz Virulenzfaktoren als Ziele für die Entwicklung von neuartigen Antimykotika, sowie bieten die Möglichkeit, weitere Host-Mikroben-Interaktionen aufzudecken. Das Design dieser Assay eignet sich gut für hohen Durchsatz Vollständiggenom Bildschirme, während die Fähigkeit, Cryo-Konserve Würmer für zukünftigen Gebrauch es eine kostengünstige und attraktive ganze Tiermodell macht zu studieren.

Eine Pathogenese-Assay (Abb. 1) mit C. Albicans und C. Elegans wurde zuvor von unserem Labor17,18 und andere Labors19,20beschrieben. Wir zeigen die Bereitschaft der Verwendung von C. Elegans , um C. Albicans Virulenz zeigen, dass C. Albicans Zellen von den Würmern schnell aufgenommen werden und reic...

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die Auswirkungen einer Pilzinfektion im Modellorganismus C.Elegans zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige mechanistische Fragen auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu beantworten, wie z. B. Virulenzfaktoren für Krankheitserreger, Immuneffektoren des Wirts sowie die Wirkstoffforschung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein experimentell handhabbares System handelt, um Wirt-Erreger-Interaktionen aus beiden Blickwinkeln zu untersuchen.Es ist ein schnelles, einfaches und kostengünstiges System. Obwohl diese spezielle Methode Einblicke in pilzliche Krankheitserreger geben kann, kann sie auch auf andere Infektionserreger wie Bakterien oder sogar mehrere Organismen angewendet werden, um mikrobielle Wechselwirkungen in einem lebenden Wirt zu untersuchen. Um einen Wurmstocher herzustellen, schneiden Sie ein 1,5 Zentimeter langes Stück Aluminiumdraht ab und führen Sie dann vorsichtig etwa 0,5 Zentimeter des Drahtes in die Spitze einer Pasteurpipette ein.Schmelzen Sie die Pipettenspitze aus Glas mit einem Bunsenbrenner oder einer Alkohollampe, indem Sie sie langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher mit der Pipette verbunden ist, ohne die ursprüngliche Form der Pipettenspitze zu beeinträchtigen. Zum Schluss biegst du das Ende des Drahtes vorsichtig mit einer Pinzette, um eine kleine Schlaufe zu erzeugen. Um große Mengen an Würmern schnell auf neue Platten zu übertragen, schneiden Sie mit einem Spatel ein Stück NGM-Agar, das die ausgewählten Würmer enthält.Entfernen Sie dann das abgeschnittene Stück und legen Sie es mit der Vorderseite nach unten auf den Rand des Flickens von OP50 auf eine neue Platte. Um Würmer einzeln zu übertragen, flammen Sie den Draht im Wurmpickel, bis er rot ist, nehmen Sie ihn dann von der Flamme und lassen Sie ihn einige Sekunden abkühlen. Kratzen Sie mit dem Draht am Plektrum vorsichtig das Pflaster der OP50-Kultur ab, das auf der neuen Platte gewachsen ist, und bedecken Sie dabei den Draht auf dem Plektrum.Die viskose Kultur, die die Spitze des Drahtes bedeckt, sorgt dafür, dass Würmer an der Spitze der Grube haften bleiben. Verwende also eine Wischbewegung, um ausgewählte Würmer sanft aufzuheben. Sobald die ausgewählten Würmer gesammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte, indem Sie die Kultur vorsichtig über den Agar streichen.Legen Sie dann den Draht in die Flamme, um die verbleibende Kultur auf dem Plektrum zu entfernen. Platzieren Sie etwa 20 erwachsene Tiere, indem Sie sie entweder aufpicken oder in Stücke schneiden, auf einen Teller mit 50 Mikrolitern E.coli-Stamm OP50 setzen. Um die Eier nach ein bis zwei Tagen zu sammeln, fluten Sie die Platte mit 10 Millilitern M9-Puffer.Schwenken und rühren Sie dann mit einer serologischen Glaspipette den Inhalt auf der Agarplatte vorsichtig um, um erwachsene Tiere oder Eier freizusetzen, die an OP50 haften. Sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit, die die Eier und erwachsenen Tiere enthält. Die M9- und OP50-Lösung wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.Das Röhrchen bei 2.100 x g zwei Minuten lang zentrifugieren. Aspirieren Sie dann etwa neun Milliliter Überstand, ohne das Pellet zu stören. Verwenden Sie anschließend zwei Milliliter steriles Wasser, einen Milliliter Bleiche und einen Milliliter 0,25 molares Natriumhydroxid, um das Pellet zu resuspendieren.Vorsichtig durch Inversion mischen, bis etwa 70 % der erwachsenen Tiere lysiert erscheinen. In der Regel bleiben die Eier während dieser kurzen Bleichbehandlung aufgrund ihrer Schale intakt. Es ist wichtig, dass die Exposition gegenüber Bleichmittel in diesem Schritt begrenzt wird.Längerer Kontakt mit Bleichmittel zerstört die Eier. Wenn die Zubereitung der Eier fehlschlägt, begrenzen Sie entweder die Dauer der Exposition gegenüber Bleichmittel oder verdünnen Sie die Lösung. Das konische Röhrchen wird bei 990 x g zwei Minuten lang zentrifugiert.Saugen Sie den Überstand an, ohne das Pellet zu stören. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern M9-Puffer. Nach dem erneuten Schleudern und Entfernen des Überstands, ohne das Pellet zu stören, verwenden Sie 200 Mikroliter M9-Puffer, um das Pellet wieder zu suspendieren.Geben Sie drei bis fünf Milliliter YPD in ein steriles Reagenzglas und verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um es mit einer einzigen Kolonie von Candida albicans zu impfen. Legen Sie das Rohr für etwa 16 bis 18 Stunden bei 30 Grad Celsius auf eine Drehtrommel. Beschriften Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen mit C.albicans und ein anderes mit OP50 und notieren Sie dann das Gewicht jedes leeren Röhrchens.Übertragen Sie 500 Mikroliter der C.albicans-Kultur über Nacht in das Röhrchen mit der Aufschrift C.Albicans. Und 1500 Mikroliter der OP50-Kultur über Nacht in das mit OP50 beschriftete Röhrchen. Die Röhrchen werden 10 Minuten lang bei 16, 100 x g zentrifugiert, dann wird der Überstand abgesaugt, ohne die Pellets zu stören.Verwenden Sie 500 Mikroliter steriles Wasser, um jedes Pellet zu resuspendieren. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 16.100 x g für fünf Minuten. Saugen Sie den Überstand an, ohne die Pellets zu stören.Notieren Sie dann das Endgewicht der Mikrofugenröhrchen. Bestimmen Sie das Gewicht jedes Pellets, indem Sie das Anfangsgewicht der Mikrofugenröhrchen vom Endgewicht abziehen. Resuspendieren Sie das C.albicans-Pellet unter Verwendung von sterilem Wasser auf 10 Milligramm pro Milliliter und das OP50-Pellet auf 20 Milligramm pro Milliliter.Stellen Sie dann eine Masterinfektionsmischung her, indem Sie 10 Mikroliter einer 50-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung von Streptomycin, 2,5 Mikroliter OP50-Kultur, 0,5 Mikroliter C.Albicans-Kultur und 7 Mikroliter steriles Wasser kombinieren.Für Kontrollplatten erstellen Sie einen Mastermix, indem Sie das Volumen der C.albicans-Kultur durch steriles Wasser ersetzen. Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um 20 Mikroliter Infektionsmischung oder OP50-Kontrolllösung auf die Mitte der NGM-Platten zu säen. Nachdem Sie die Eier vorbereitet haben, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, zählen Sie die Eier unter dem Sezierbereich.Und verwenden Sie M9, um die Eilösung zu verdünnen, bis eine Konzentration von etwa fünf bis sechs gesunden Eiern pro Mikroliter erreicht ist. Geben Sie mit einer Pipette eine 20-Mikroliter-Probe mit etwa 30 Eiern auf eine vorbereitete NGM-Platte im Bereich zwischen der Bakterienkultur und der Seite der Platte. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei 20 Grad Celsius.Zählen Sie dann unter einem Präpariermikroskop die Anzahl der lebenden und toten adulten Würmer auf jeder Platte. Betrachten Sie das Tier als tot, wenn es nicht darauf reagiert, mit einem Aluminiumdraht auf den Kopf geklopft zu werden oder auf die Platte zu klopfen. Zählen Sie auch die Anzahl der Würmer mit Dar und bestätigen Sie, ob ein Tier Dar hat, indem Sie schnell auf die Platte auf dem Tisch des Seziermikroskops klopfen.Tiere ohne Dar bewegen sich sofort rückwärts, während Tiere mit Dar entweder wiederholte Tipprunden benötigen, um ihre Richtung umzukehren, oder sie tun dies überhaupt nicht. Übertragen Sie alle verbleibenden adulten Würmer jeden zweiten Tag durch Pflücken von Würmern auf eine neue Infektions- oder Kontrollplatte. Führen Sie zu diesem Zeitpunkt bei Bedarf einen Überlebenstest durch, indem Sie jeden Tag die Anzahl der lebenden, toten und fehlenden Würmer verfolgen.Es ist wichtig, die Würmer mindestens jeden zweiten Tag zu übertragen. Dies stellt sicher, dass die adulten Würmer, die in diesem Assay bewertet werden, nicht mit ihren Nachkommen verwechselt werden. C.elegans wurden über einen Zeitraum von sechs Tagen C.albicans ausgesetzt und auf Anzeichen einer Infektion, eines Fortschreitens der Krankheit und des Todes beobachtet.Der Dar-Phänotyp ist am vierten Tag des Überlebenstests am deutlichsten sichtbar, was sich in einer hervorstehenden Analregion zeigt, die bei dem nicht infizierten Tier nicht sichtbar ist. Es ist auch bekannt, dass Würmer, die mit C.albicans infiziert sind, Schwellungen in der Vulvaregion aufweisen. In beiden Fällen ist der Wurm nicht in der Lage, die Infektion nach Erreichen dieses Stadiums zu beseitigen.Um die Besiedlung von C.albicans im Darmlumen sichtbar zu machen, wurden Würmer mit Wildtyp-C.albicans gefüttert, die mit RFP markiert waren und die Besiedlungsbereiche rot fluoreszieren lassen. C.albicans besiedeln das Darmlumen am dritten Tag des Assays. Wie hier gezeigt, zeigten infizierte Würmer eine stärkere Darmblähung als bei der nicht infizierten Kontrolle.In diesem Experiment wurde die Fähigkeit der Würmer getestet, eine Infektion durch die virulente C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 Doppelmutante zu überleben. Würmer, die mit der Doppelmutante infiziert sind, leben statistisch signifikant länger als Kontrollen. Dies deutet darauf hin, dass diese beiden Gene für die Virulenz von C. albicans gegen C. Elegans erforderlich sind.Einmal gemeistert, kann jeder Teil dieser Technik in ein bis zwei Stunden pro Tag während der Lebensdauer des Wurms durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass man möglicherweise Infektionserreger verwendet. Daher sollten geeignete Biosicherheitsvorkehrungen getroffen werden.Kleinere Modifikationen können an diesem grundlegenden Verfahren vorgenommen werden, wie z.B. die Einführung zusätzlicher mikrobieller Wirkstoffe, um mikrobielle Interaktionen im Kontext eines lebenden Wirts zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten, um die mikrobielle Virulenz, die Mechanismen der angeborenen Immunantwort des Wirts sowie die Entdeckung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man C.Elegans erhält und manipuliert und den Organismus verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Wirtsmikroben auf molekularer Ebene zu untersuchen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit mikrobiellen Krankheitserregern und chemischen Reagenzien wie Natriumazid gefährlich sein kann und geeignete Sicherheitsvorkehrungen wie PSA und Abfallentsorgungsmethoden getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

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Genetik

Die Einfachheit in der Pflege und Verbreitung des...

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Wilde Caenorhabditis-Nematoden sind mit vielen Mikroben assoziiert, oft im Darmlumen oder im Darm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Anreicherung von nicht kultivierbaren Mikroben, die den Darm besiedeln, unter Ausnutzung der Widerstandsfähigkeit der Dauerkutikula.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Kompost-Mikrokosmen bringen die mikrobielle Vielfalt der Natur ins Labor, um die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans zu erleichtern. Hier sind Protokolle für den Aufbau von Mikrokosmos-Experimenten, wobei die Experimente die Fähigkeit demonstrieren, die mikrobielle Vielfalt der Umwelt zu modulieren, um die Beziehungen zwischen der mikrobiellen Vielfalt der Umwelt und der Zusammensetzung des Mikrobioms des Wurmdarms zu untersuchen.

Kompostmikrokosmen als mikrobiell vielfältige, naturähnliche Umgebungen für die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.

Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

Hier finden Sie eine Anleitung zur effektiven Nutzung von SegElegans, einem von uns entwickelten Deep-Learning-System zur automatisierten Segmentierung einzelner Würmer in Weitfeldmikroskopiebildern, für die anschließende Verwendung in Bildanalysesoftware wie ImageJ. Wir bieten Möglichkeiten, das System sowohl online als auch offline zu nutzen.

Automatisierte Analyse von C. elegans-Fluoreszenzbildern mit SegElegans

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Erfahren Sie, wie Caenorhabditis elegans als vielseitiges Modell für Host-Mikroben-Interaktionen dient. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pilzinfektionen, Pathogen-Virulenzfaktoren und Wirtsimmunantworten.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

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