JoVE Science Education

Advanced Biology

Eine Einführung zum Zelltod

JoVE Science Education
Cell Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Cell Biology

An Introduction to Cell Death

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

4.15: Annexin V and Propidium Iodide Labeling

52,621 Views

•

10:06 min

•

April 30, 2023

Overview

Selbstverdauende Zelltod, Nekrose und Apoptose sind alle Manieren in der Zellen sterben können, und diese Mechanismen durch verschiedene Reize, wie z. B. Zelle Verletzung, geringer Nährstoffgehalt oder Signalproteine induziert werden können. Während Nekrose eine “zufällige” oder unerwarteten Form des Zelltods gilt, gibt es Beweise, dass Apoptose Autophagie sowohl programmiert und sind “” von Zellen geplanten.

In diesem einleitenden Video zeigt Jupiter wichtige Entdeckungen im Zusammenhang mit Zelltod, einschließlich den letzten Arbeit in Worms, das half bei der Apoptose beteiligten Gene zu identifizieren. Dann erkunden wir Fragen von Wissenschaftlern studiert Zelltod, von denen einige unterschiedliche Tod Wege und deren Interaktionen betrachten. Schließlich mehrere Verfahren zur Beurteilung der Zelltod werden diskutiert, und wir stellen fest, wie Forscher diese Techniken in ihren Experimenten heute anwenden.

Procedure

Paradoxerweise hilft Absterben von Zellen eines Organismus Leben prägen. Genau wie jeder Organismus Zellen können durch Alterung, durch Unfallverletzungen, sterben oder Anschluss an eine Pathogen Infiltration einer Zelle kann Opfern selbst um die Ausbreitung der Infektion zu verhindern. Unter diesen Umständen können die Zellen unterschiedliche Tod Wege wie Apoptose, Autophagie oder Nekrose folgen. Alle diese Arten zeigen morphologische Besonderheiten. Apoptose oder programmierter Zelltod führt zu Membran “Blebbing” und nukleare Fragmentierung. Autophagie, die auch geregelt wird, führt zur Bildung von großen Vakuolen zelluläre Komponenten einschließen. Zu guter Letzt endet Nekrose, die “ungeplanten” oder zufällig ist, in Zelle Lysis.

Dieses Video wichtige Entdeckungen, die zur Identifizierung dieser Wege führte zu diskutieren, Fragen, die Forscher noch über Zelltod Fragen erkunden, Werkzeuge, die sie verwenden, um sie zu beantworten, und überprüfen Sie schließlich ein paar Beispiel-Experimente zu diskutieren.

Zuerst schauen wir uns einige wichtige Forscher, die geholfen haben, um andere Zelle Tod Wege zu entschlüsseln.

Moderne Begriffe verwendet, um diese Pfade zu beschreiben lässt, Hippokrates, ein Arzt im antiken Griechenland zurückverfolgen. Er verwendet den Begriff Apoptose, d.h. “falling off,” Knochen zu beschreiben “Schreddern” nach einer Fraktur beobachtet. Kommen bis in die Neuzeit spürbar Ersterwähnung des “Nekrose” trat im Jahr 1859, als Rudolf Virchow – in seiner Zusammenstellung genannt Zelle Pathologie— verwendet diesen Begriff um zu beschreiben, “erweiterte Gewebeabbau.”

Mit Fortschritten in der Mikroskopie und Histologie im nächsten Jahrzehnt konnten im Jahre 1877 Carl Weigert und Julius Cohnheim, Nekrose auf zellulärer Ebene zu studieren. Sie bot Einblick in die morphologischen Merkmale dieser Art des Todes, wie der Verlust der Nukleonen zugeordnet.

Fast 70 Jahre später, Christian de Duve entdeckt “Autophagie”, ein Prozess, in dem zelluläre Komponenten verschlungen und aufgeschlüsselt nach Membrane-springen Organellen genannt Autophagosom, die mit einer anderen Art von Organellen verschmelzen – Lysosomen – deren Inhalt weiter zu zerstören. Wir wissen jetzt, dass Autophagie tatsächlich spielt eine Doppelrolle in der Zelle überleben zu erleichtern oder Tod induzieren.

Im Jahr 1972 beobachtet John Kerr, A. R. Currie und Andrew Wyllie eine andere Art von Zelltod mit eigenartigen Morphologie. Seit diesem Prozess gaben beteiligten Stücke “herunterfallen” von abgestorbenen Zellen, sie es dem alten griechischen Namen Apoptose. Später wurde Apoptose als eine Form der “programmierten Zelltod” 1977, anerkannt als H. R. Horvitz und John Sulston C. Elegans Entwicklung studierten. Sie bemerkten, dass bestimmte Zellen zur gleichen Zeit in verschiedenen Würmer Apoptose würde.

Da dies schon früh während der Entwicklung geschah, es angedeutet, dass Gene Apoptose führen können. Diese Hypothese wurde durch Horvitz Gruppe in den 1980er Jahren bestätigt wenn sie beobachtet, dass Zellen mit Mutationen in bestimmten ced oder“C. Elegans Tod” Gene bei der Entwicklung dieser Würmer sterben nicht. Horvitz zeigte später, dass die ced-3 gen ein Protein-abbauenden Enzyms namens ein Caspase kodiert. Nun, wir wissen, dass es mehrere Caspasen, und sie spielen eine große Rolle im Zelltod.

Diese Fortschritte im Feld Zelle Tod eröffnet neue Wege für Forscher zu erkunden. Schauen wir uns einige davon.

Seit jeher interessiert, herauszufinden, welche Faktoren Zelltod auslösen. Um sie zu identifizieren, Forscher derzeit Zellen Strahlung, Chemikalien, Freilegung und Signalmoleküle, und dann auf der Suche nach Veränderungen in Grad oder Art des Todes.

Andere Wissenschaftler interessieren sich für die Aufklärung der biochemischen Bahnen in jeder Zelle Tod Mechanismus beteiligt. Derzeit wissen wir, dass die Apoptose folgt einen Weg wo sind Caspasen Schlüsselenzyme, während Autophagie umfasst Proteine, die für Autophagosome Bildung notwendig sind. Allerdings gibt es Komponenten in diesen Bahnen, die unbekannt sind, und Forscher versuchen herauszufinden, Möglichkeiten, sie zu erklären. Darüber hinaus untersuchen Forscher auch, ob irgendwelche “Übersprechen” zwischen Zelle Tod wegen auftritt. Wenn Übersprechen vorhanden ist, kann das gleiche Signal in Apoptose sowie Autophagie Faktor.

Zu guter Letzt ein beliebtes Gebiet der Forschung befasst sich mit verstehen, warum bestimmte Zellen — wie Krebszellen – unsterblich geworden. Wissenschaftler sind ständig auf der Suche nach Mutationen in Krebszellen und der Beurteilung, ob eine davon Gene Kodierung Faktoren bei Tod Wege beeinflussen.

Das sind alles komplizierte Fragen, aber zum Glück haben die Forscher eine Vielzahl von Werkzeugen zur Verfügung, um sie zu beantworten.

Die Trypan blau-Assay ist eine häufig verwendete Screening-Instrument zur Beurteilung der Wirkung einer Substanz auf Zelltod. Der Test beruht auf einem Fleck, der kann keine lebenden Zellen, wie sie besitzen “selektiven Membranen” eingeben, sondern kann einfach abgestorbene Zellen eingeben, da ihre Membranen “gebrochen.” Dieser Assay Zelltod identifiziert, aber nicht zu bestimmten Zelle Tod Weg zu lokalisieren.

Daher haben Wissenschaftler Techniken wie Caspase-Aktivität-Assays entwickelt. Da während der Apoptose Caspasen aktiviert werden, können Wissenschaftler Substrate für diese Enzyme hinzufügen, die fluoreszieren, wenn sie von Caspasen aktiviert sind. Dies hilft bei der Identifizierung von apoptotischen Zellen.

Ebenso kann mit der TUNEL-Test, die stützt sich auf Reagenzien, die Tag “geklaut” Enden des beschädigten DNA DNA-Fragmentierung, die während der Apoptose passiert leicht identifiziert werden. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, ist es ein verwendeten Assay im Feld.

Wenn Wissenschaftler die Zelle Tod Mechanismus, die in ihrer Bevölkerung bestimmen möchten, können sie koppeln, annexin V und Propidium Jodid (PI) Flecken mit Flow-Zytometrie-Analyse. Annexin V bindet an Phosphatidylserin Rückstände in der Membran, während PI durch die beschädigte Membranen DNA zuzuordnende betritt. Durch das Studium der resultierenden Daten, können Wissenschaftler Zellen durchlaufen verschiedene Tod Wege trennen.

Zu guter Letzt können Wissenschaftler live Cell imaging den Zelle Todesprozess in Echtzeit anzeigen. Dies ist eine allumfassende Technik, die verwendet werden kann, zu identifizieren, selbstverdauende, nekrotische oder Apoptotic Zellen basierend auf morphologische Besonderheiten.

Wie Sie gesehen haben, gibt es mehrere Methoden, um Zelltod, erkennen, die, die einige davon nicht spezifisch sind, andere, die helfen können apoptotische Zellen zu identifizieren, und einige, verschiedene Wege unterscheiden.

Nun, mal sehen, wie Wissenschaftler diese Techniken einsetzen, um mehr über Zelltod zu studieren.

Ernährung spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Zelltod in verschiedenen Geweben zu beeinträchtigen. In dieser in-vitro- Assay Forscher ausgesetzt Maus Neuronen, Palmitinsäure, eine gesättigte Fettsäuren in Milchprodukten und Fleisch, und dann einen Caspase-Assay zur Apoptose zu bewerten. Sie entdeckten, daß Palmitinsäure-behandelten Zellen erhöhte Caspase-Aktivität und Zelle Tod bewiesen.

Andere Forscher sind diese Tests verwenden, um festzustellen, wie Drogen anders Tod Mechanismen induzieren. Hier wurden transgene Mäuse mit Gewebekulturen beschrifteten Krebszellen mit Doxorubicin, eine Anti-Krebs-Medikament injiziert. Wissenschaftler dann abgebildet Zellen in lebenden Tieren und von der Suche nach Veränderungen der Zellmorphologie Krebs, festgestellt, dass medikamentöse Behandlung Apoptose und Nekrose ausgelöst.

Zu guter Letzt untersuchen einige Wissenschaftler, ob Zelltod rückgängig gemacht werden kann. In diesem Experiment Forscher ausgesetzt menschlichen Krebszellen zu Ethanol und bestätigt durch eine Vielzahl von Tests, dass diese Behandlung zu begeben Sie sich auf die Apoptose-Signalweg verursacht. Betroffene Zellen konnten sich auf das Ethanol abwaschen, zur Wiederherstellung der Apoptose durch einen Prozess namens “Anastasis.” Dies bot Einblick in wie Krebserkrankungen nach medikamentöse Behandlung zurückkehren können.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die Zelle Tod wegen beobachtet. Dieses Video überprüft die reiche Geschichte der Zellforschung Tod – von der Antike bis ins 20. Jahrhundert – und dann ein paar aktuelle Fragen diskutiert. Wir auch beliebte Methoden um Zelltod assay erklärt und gezeigt, wie diese Techniken verwendet werden, um besser zu verstehen, die Verbindung zwischen Umwelt, Krankheit und Tod der Zelle. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Paradoxically, cell death helps shape an organism’s life. Just like any whole organism, cells can die as a result of aging, due to accidental injury, or following a pathogen infiltration a cell can sacrifice itself to prevent the spread of infection. Under these circumstances, cells can follow different death pathways like apoptosis, autophagy, or necrosis. All these types display specific morphological characteristics. Apoptosis or programmed cell death leads to membrane “blebbing” and nuclear fragmentation. Autophagy, which is also regulated, leads to formation of large vacuoles enclosing cellular components. Lastly, necrosis, which is “unplanned” or accidental, ends in cell lysis.

This video will discuss important discoveries that led to the identification of these pathways, explore questions that researchers are still asking about cell death, discuss tools they use to answer them, and finally review a few example experiments.

First, let’s review some key researchers who helped to decipher different cell death pathways.

Modern terms used to describe these paths can be traced back to Hippocrates, a physician in ancient Greece. He used the term apoptosis, meaning “falling off,” to describe bone “shredding” observed following a fracture. Coming to the modern era, the first noticeable mention of “necrosis” occurred in 1859, when Rudolf Virchow—in his compilation called Cell Pathology—used this term to describe “advanced tissue breakdown.”

With advances in microscopy and histology over the next decade, in 1877 Carl Weigert and Julius Cohnheim were able to study necrosis at the cellular level. They provided insight into the morphological features associated with this type of death, like the loss of nuclei.

Almost 70 years later, Christian de Duve discovered “autophagy,” a process in which cellular components are engulfed and broken down by membrane-bound organelles called autophagosomes, which fuse with another type of organelle—lysosomes—to further destroy their contents. We now know that autophagy actually plays a dual role in the cell, either facilitating survival or inducing death.

In 1972, John Kerr, A. R. Currie, and Andrew Wyllie observed another type of cell death with peculiar morphology. Since this process involved pieces “falling off” of dead cells, they gave it the ancient Greek name apoptosis. Later, apoptosis was recognized as a form of “programmed cell death” in 1977, when H. R. Horvitz and John Sulston were studying C. elegans development. They noticed that specific cells would undergo apoptosis at the same time in different worms.

Since this was happening early on during development, it hinted that genes may guide apoptosis. This hypothesis was confirmed by Horvitz’s group in the 1980’s, when they observed that cells with mutations in certain ced or “C. elegans death” genes didn’t die during the development of these worms. Later, Horvitz showed that the ced-3 gene encodes a protein-degrading enzyme called a caspase. Now, we know that there are several caspases, and they play major roles in cell death.

These advances in the cell death field opened new roads for researchers to explore. Let’s look at some of them.

There has always been interest in finding out what factors trigger cell death. To identify them, researchers are currently exposing cells to radiation, chemicals, and signaling molecules, and then searching for changes in the degree or type of death.

Other scientists are interested in elucidating the biochemical pathways involved in each cell death mechanism. Currently, we know that apoptosis follows a pathway where caspases are the key enzymes, whereas autophagy involves proteins that are necessary for autophagosome formation. However, there are components in these pathways that are unknown, and researchers are trying to figure out ways to explain them. In addition, researchers are also studying whether any “crosstalk” occurs between cell death pathways. If crosstalk is present, then the same signal can factor in apoptosis, as well as autophagy.

Lastly, a popular area of research deals with understanding why certain cells—like cancer cells—become immortal. Scientists are constantly looking for mutations in cancer cells, and assessing whether any of them affect genes encoding factors involved in death pathways.

These are all complicated questions, but luckily researchers have a variety of tools at their disposal to answer them.

The trypan blue assay is a commonly used screening tool to assess the effect of a compound on cell death. The assay relies on a stain that cannot enter live cells, as they posses “selective membranes,” but can easily enter dead cells as their membranes are “ruptured.” This assay identifies cell death, but fails to pinpoint the specific cell death pathway.

Therefore, scientists have designed techniques like caspase activity assays. Since caspases are activated during apoptosis, scientists can add substrates for these enzymes that fluoresce when they’re activated by caspases. This helps in the identification of apoptotic cells.

Similarly, DNA fragmentation that happens during apoptosis can be easily identified using the TUNEL assay, which relies on reagents that tag the “nicked” ends of damaged DNA. As this method is relatively easy to perform, it is a commonly employed assay in the field.

When scientists want to determine the cell death mechanism occurring in their population, they can pair annexin V and propidium iodide (PI) stains with flow cytometry analysis. Annexin V binds to phosphatidylserine residues in the membrane, whereas PI enters through the damaged membranes to associate with DNA. By studying the resulting data, scientists can separate cells undergoing different death pathways.

Lastly, scientists can use live cell imaging to view the cell death process in real time. This is an all-encompassing technique that can be used to identify autophagic, necrotic, or apoptotic cells based on unique morphological features.

As you’ve seen, there are several methods to detect cell death, some of which are not specific, others that can help identify apoptotic cells, and some that distinguish between different pathways.

Now, let’s see how scientists are using these techniques to study more about cell death.

Diet plays an important role in health, and may affect cell death in different tissues. In this in vitro assay, researchers exposed mouse neurons to palmitic acid, a saturated fatty acid present in both dairy products and meat, and then used a caspase assay to evaluate apoptosis. They discovered that palmitic acid-treated cells demonstrated increased caspase activity and cell death.

Other researchers are using these assays to determine how drugs induce different death mechanisms. Here, transgenic mice with fluorescently labeled cancer cells were injected with doxorubicin, an anti-cancer drug. Scientists then imaged cells in live animals, and by looking for changes in cancer cell morphology, determined that drug treatment triggered both apoptosis and necrosis.

Finally, some scientists are investigating whether cell death can be reversed. In this experiment, researchers exposed human cancer cells to ethanol, and confirmed through a variety of assays that this treatment caused them to embark on the apoptosis pathway. Upon washing off the ethanol, affected cells were able to recover from apoptosis through a process called “anastasis.” This provided insight into how cancers can return following drug treatment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cell death pathways. This video reviewed the rich history of cell death research—from ancient times to the 20th century—and then discussed a few current questions. We also explained popular methods to assay cell death, and demonstrated how these techniques are being used to better understand the connection between environment, disease, and cell death. As always, thanks for watching!

Tags

Leerer Wert Problem