Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die synaptische Aktivität der visualisierten synaptischen Boutons an der neuromuskulären Verbindung der Drosophilalarven zu überwachen. Ein hervorragendes Modellsystem, das leicht an genetische Manipulationen angepasst werden kann. Diese Technik kann Schlüsselfragen in Ihrer Wissenschaft beantworten.

Zum Beispiel, wie Mutationen von synaptischen Proteinen die synaptische Übertragung regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Aktivität einer begrenzten Anzahl von Freisetzungsstellen überwacht und aufgezeichnet werden kann, Ströme schneller Kinetik und leicht aufgelöst werden können. Um das Experiment zu beginnen:Bereiten Sie den Mikroelektrodenabzieher vor.

Verwenden Sie ein Mikroskop mit 35-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass der Innendurchmesser der gezogenen Elektrode im Bereich von sieben bis zehn Mikrometern liegt. Lagern Sie die Kapillaren in dicht verschlossenen Behältern, um Staubansammlungen zu vermeiden. Anschließend werden die Kapillaren mit einer Mikroschmiede feuerpoliert.

Stellen Sie sicher, dass der endgültige Innendurchmesser der polierten Elektrode fünf Mikrometer beträgt. Gehen Sie dann zum Biegen über. Fixieren Sie die Elektrode im Manipulator und positionieren Sie die Spitze über dem Filament, ohne es zu berühren.

Stellen Sie den Heizwert auf 60-70% des Maximums ein und drücken Sie das Pedal der Mikroschmiede für ein bis zwei Sekunden, um das Filament zu erhitzen. Ziehe die Spitze der Elektrode mit einer L-förmigen Nadel vorsichtig nach unten und biege sie um etwa 90 Grad. Halten Sie die Elektrode mit der Hand über die Flamme des Brenners und machen Sie die zweite Biegung sieben bis zehn Millimeter von der ersten Biegung entfernt und in einem Winkel von etwa 120 Grad.

Bereiten Sie eine hämolymphähnliche oder HL3-Lösung vor. Bewahren Sie die Lösung im Kühlschrank auf und machen Sie sie jede Woche frisch. Bereiten Sie Stimulationspipetten auf die gleiche Weise vor wie die Aufnahme von Glaspipetten, ohne sie zu verbiegen.

Führen Sie anschließend eine Stimulationspipette in einen Mikroelektrodenhalter ein, der mit einer Spritze verbunden ist. Hergestellte Sezierplatten aus kleinen Petrischale, die mit Silikonkautschuk-Epoxidharz beschichtet sind. Dann entnehmen Sie mit einer Pinzette eine wandernde Larve des dritten Stadiums aus einem Fläschchen.

Stecke die Larven fest, indem du die erste Nadel in den hinteren Bereich und die weitere vordere Nadel in der Nähe der Maulhaken legst. Fügen Sie eine HL3-Lösung hinzu. Machen Sie auf der Rückenseite der Larven mit einer Federschere einen Schnitt vom oberen zum unteren Stift.

Stecke das Larvenfilet fest, indem du zwei weitere Stecknadeln links und rechts der Larven ansteckst. Entferne die Eingeweide und die Luftröhre mit einer Pinzette. Schneide die Nerven knapp außerhalb des ventralen Nervenstrangs mit einer Federschere durch.

Stellen Sie die Petrischale mit dem Präparat auf den Mikroskoptisch. Führen Sie die Referenzelektrode in das Bad ein. Füllen Sie die Aufzeichnungselektrode mit HL3-Lösung.

Tauchen Sie die Elektrode unter dem 10X-Objektiv in das Bad und platzieren Sie sie mit dem Mikromanipulator über den Muskeln sechs und sieben der Bauchmuskeln von zwei, drei oder vier. Schalten Sie dann das Objektiv auf 60X und fokussieren Sie sich auf den interessierenden Bereich, indem Sie entweder Epi-Fluoreszenz- oder DIC-Optik verwenden. Legen Sie die Spitze der Elektrode auf den synaptischen Bouton und drücken Sie die Elektrode dann sehr vorsichtig auf den Muskel, da übermäßiger Druck den NMJ schädigen oder eine Zunahme der spontanen synaptischen Aktivität induzieren kann.

Schalten Sie als Nächstes den Verstärker, die AD-Platine und den Computer ein. Wählen Sie dann den Spannungsklemmmodus am Verstärker. Starten Sie die Erfassungssoftware, wählen Sie den lückenlosen Modus und beobachten Sie das Erscheinungsbild von MEJCs auf dem Computerbildschirm.

Stellen Sie sicher, dass die Amplitude der MEJCs im Bereich von 0,2 bis 0,7 Nanoampere liegt. Platzieren Sie die Stimulationselektrode mit einem Mikromanipulator unter visueller Kontrolle in der Nähe des Axons, das die Bauchsegmente zwei bis vier innerviert. Üben Sie Unterdruck aus, indem Sie den Kolben der Spritze, die mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, so ziehen, dass das Axon in die Elektrode hineingezogen wird.

Schalten Sie als Nächstes den Stimulator ein. Drehen Sie den Knopf an der Isolationseinheit, um einen Nullstrom einzustellen, und erhöhen Sie ihn dann vorsichtig, bis die EJCs erscheinen oder der Schwellenwert erreicht ist. Führen Sie die Stimulation in einem überschwelligen Regime durch.

Mit dem Stimulationsstrom steigt der Strom etwa doppelt so hoch wie die Schwelle für die Beobachtung von EJCs. Messen Sie den Siegelwiderstand der aufzeichnenden Makro-Patch-Elektrode, indem Sie den Elektrodenwiderstandsschalter des Verstärkers in die Dichtheitstestposition drehen. Beachten Sie den Wert des Dichtungswiderstands in Giga Ohm, der im aktuellen Fenster angezeigt wird.

Fokale Makro-Patch-Aufzeichnungen ermöglichen die Überwachung der synaptischen Aktivität von ausgewählten synaptischen Boutons. Wenn die Elektrode auf einem synaptischen Bouton positioniert wird, weisen die aufgezeichneten MEJCs Amplituden auf, die den Rauschpegel deutlich übertreffen, und scharfe Anstiegsphasen im Bereich von unter einer Millisekunde. Wenn die Aufzeichnungselektrode um mehrere Mikrometer vom synaptischen Bouton weg bewegt wird, sinken die Amplituden der Recorder-MEJCs fast auf den Rauschpegel ab.

Die aufgezeichneten EJCs sind kaum vom Rauschen zu unterscheiden und weisen verlängerte Anstiegsphasen auf. Fokale Aufzeichnungen ermöglichen einen genauen Nachweis von MEJCs in der Komplex- und Gnom-Mutante. Während die interzellulären Aufzeichnungen dieser Mutante Freisetzungsereignisse aufweisen, die sich überlappen und nicht zuverlässig nachgewiesen werden können.

Die Einstellung der Winkel des Elektrochips ist entscheidend für die Positionierung der Elektrode. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Überprüfung der Abbildung einzelner Freisetzungsereignisse, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Integration der Aktivität einzelner aktiver Zonen zu beantworten.