Name: Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Lernen Sie fokale Macropatch-Aufnahmen zur Untersuchung synaptischer Ströme an der Drosophila-Larve. Diese Methode ermöglicht die präzise Analyse genetischer Mutationen auf die synaptische Übertragung.

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1. Herstellung der Aufnahme Elektroden <ol><li><ol><li>Gebrauch der folgenden ziehen die Glaselektroden Protokoll für die Mikroelektrode Puller (siehe Tabelle der Materialien): <ol><li>Linie 1: Wärme 510 ziehen - Geschwindigkeit 30 mal 250; Linie 2: Erhitzen 490 Pull - Geschwindigkeit 30 mal 250. 
			Hinweis: Zeiteinheiten entsprechen 0,5 ms pro Einheit; die anderen Geräte sind relativ. Der Wert der Wärme sollte für jedes Filament angepasst werden, nachdem die Rampe-Test durchgeführt wird.</li>
		</ol></li> <li>Mikroskop (35 X Vergrößerung) verwenden, um sicherzustellen, dass der Innendurchmesser der gezogenen Elektrode im Bereich von 7 bis 10 µm ( Abbildung 1A). Speichern Sie die Kapillaren in dicht verschlossenen Behältern, Staub zu verhindern.</li>
	</ol></li> <li>Polieren Feuer <ol><li>Fire Polnisch Kapillaren (80-90 % der maximalen Heizwert für 1-2 s) mit einer Mikro-Schmiede (siehe Tabelle der Materialien). Sicherzustellen, dass der endgültige Innendurchmesser der polierten Elektrode 5 µm ( Abbildung 1A) 27.</li>
	</ol></li> <li>Biegen Hinweis: zwei Biegungen werden vorgenommen, um die Elektrode an der Oberseite des Muskels unter einer hohen Vergrößerung Ziel zu positionieren.
	<ol><li>Verwendung der Apparat in Figur 1 b gezeigt. Korrigieren Sie die Elektrode in der Manipulator und positionieren Sie die Spitze über den Faden, nicht berühren, it.</li>
		<li>Set Erhitzen zu 60-70 % der maximalen Wert und drücken Sie das Pedal der Mikro-Schmiede für 1-2 s (siehe Tabelle der Materialien), das Filament zu heizen. Verwenden Sie eine L-förmigen Nadel vorsichtig herunterziehen der Elektrodenspitze ( Abbildung 1 b vergrößert). Die Biegemarkierung bei ca. 90 o ( Abbildung 1).</li>
		<li>Halten die Elektrode über die Flamme des Brenners von Hand mit Pinzette und machen die zweite Kurve in einem Abstand von 7-10 mm aus der ersten Kurve und in einem Winkel von ca. 120 o ( Abbildung 1).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg"> Abbildung 1. Letzte Schritte der Herstellung Mikropipette. (A) Elektrode Tipps nach ziehen und Feuer zu polieren. (B. 1) die Einrichtung für Spitze biegen. (B. 2) Box Bereich ist auf der rechten Seite vergrößert dargestellt. Die Elektrode und das Filament sind fixiert, so dass die Elektrodenspitze leicht über den Draht und nicht berührend ist. (C. 1) die Aufnahme-Elektrode. (C. 2) Box Bereich ist auf der rechten Seite vergrößert dargestellt. Die erste Kurve hat einen Winkel von etwa 90 Grad, und der Abstand zwischen der ersten Kurve und die Spitze der Elektrode ist ca. 1 mm. Maßstab bar = 3 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
 2. zusätzliche vorbereitende Schritte <ol><li>Prepare Heamolymph erinnernden (HL3) Lösung (in mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2 10 Nahco3 3, 5 Trehalose, 115 Saccharose, 5 HEPES und 1 mM CaCl 2; Einstellung des pH-Wertes auf 7,3 - 7.4. die Lösung im Kühlschrank aufbewahren und machen es jede Woche frisch.</li>
	<li>Stimulation Mehrkanalpipette die gleiche Art und Weise wie Aufnahme Glas machen Mehrkanalpipette, außer es keine Notwendigkeit gibt, sie verbiegen. 
	Hinweis: Die Vorbereitung der Stimulation Elektroden ist in 28 und 27 detailliert beschrieben. Den endgültigen Durchmesser nach Feuer polieren sollte im Bereich von 5 bis 7 µm.</li>
	<li>Insert eine Stimulation-Pipette in einer Mikroelektrode Halterung mit einer Spritze verbunden.</li>
	<li>Herstellung Dissektion Platten aus kleinen Petrischalen (35 x 10 mm) mit Silikon-Kautschuk-Epoxid beschichtet (siehe Tabelle der Materialien), wie unter 28. 
	Hinweis: Silikon-Kautschuk sollte vor Gebrauch vollständig ausgehärteten.</li>
	<li>Wählen Sie einen wandernden Larven dritte Instar und sezieren, wie beschrieben in 27 , 28 , 29 , 30. 
	Hinweis: Um Boutons visualisieren, verwenden die Fliege Belastung CD8-GLP (siehe Tabelle der Materialien) <ol><li>mit Zange (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie die 3 rd Instar Larven aus einem Fläschchen.</li>
		<li>Pin die Larven, die Platzierung des ersten Pins posterior und anderen pin anterior (Nähe Mund Haken).</li>
		<li>Lösung hinzufügen HL3.</li>
		<li>Machen Sie einen Schnitt mit Feder Schere (siehe Tabelle der Materialien) ganz aus den oberen Bolzen an der Unterseite eines an der dorsalen Seite der Larven.</li>
		<li>Pin-Larven-Filet, platzieren 2 zusätzliche Pins auf der linken und rechten Seiten der Larven.</li>
		<li>Die Eingeweide und Tracheas mit Pinzette entfernen.</li>
		<li>Die Nerven direkt vor den ventralen Nervenstrang mit Feder Schere geschnitten.</li>
	</ol></li></ol> 3. Elektrische Aufnahmen von EJCs <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg"> Abbildung 2. Die Recording-Setup. Die Probe NMJ angeheftet, das Silizium beschichteten Petrischale (Pfeil) über die bewegliche Bühne des aufrechten Verbindung Mikroskops ausgestattet mit Epifluoreszenz Fähigkeiten, eine hohe Vergrößerung Objektive und zwei Mikromanipulatoren positioniert ist. Das Mikroskop ist auf eine Anti-Vibrationstisch stationiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol><li>Aufnahme <ol><li>Ort der Petrischale mit der Vorbereitung auf den Mikroskoptisch ( Abbildung 2). Legen Sie die Bezugselektrode in der Badewanne.</li>
		<li>Füllen Sie die Aufnahme-Elektrode mit HL3 Lösung. Unter dem Objektiv 10 X (siehe Tabelle der Materialien), die Elektrode in die Wanne Tauchen und legen Sie es über Muskeln 6 und 7 der Abdominalsegmente 2, 3 oder 4 verwenden der Mikromanipulator () (siehe Tabelle der Materialien) Abbildung 3 A. 1 und a. 2).</li>
		<li>Schalten Sie das Ziel auf 60 X (siehe Tabelle der Materialien). Konzentrieren Sie sich auf den gewünschten Bereich mit Epi-Fluoreszenz oder DIC Optik. Setzen Sie die Spitze der Elektrode auf synaptische Bouton ( Abbildung 3 b. 1-3).</li>
		<li>Drücken Sie die Elektrode sehr sanft auf den Muskel. Übermäßiger Druck kann den NMJ beschädigen oder induzieren eine Erhöhung in spontane synaptische Aktivität. Sicherstellen, dass die Spitze der Elektrode ist nicht verstopft - wenn es it. ersetzen,</li>
		<li>Schalten Sie den Verstärker, A/D-Board und dem Computer.</li>
		<li>Klemme Spannungsmodus am Verstärker wählen.</li>
		<li>Software zur Datenerfassung starten und wählen Sie die ' spaltfreie ' Modus.</li>
		<li>Das Aussehen der mEJCs auf dem Computerbildschirm zu beobachten.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, das ist die Amplitude der mEJCs im Bereich von 0,2 - 0,7 na 
		Hinweis: Kleinere EJCs anzugeben, dass die Aufnahme Elektrode Mängel hat oder es nicht richtig positioniert ist.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg"> Abbildung 3. Visualisierung der synaptischen Boutons. (A) A Hellfeld Bild eines Hemi-Segments unter 10 x Vergrößerung (a. 1) und den erweiterten Box Bereich zeigt Muskeln 6 und 7 (a. 2, der Pfeil markiert die Aufnahme-Elektrode). Maßstabsleiste = 50 µm. (B) synaptischen Boutons sind in eine Drosophila-Linie mit einem genetisch codierte neuronalen Marker (CD8-GFP) visualisiert mit Epi-Fluoreszenz-Bildgebung (b. 1) oder DIC Optik (b. 2). Bilder sind mit 60 x Objektive und Filter-Cube für die GFP Bildgebung genommen (siehe Tabelle der Materialien). SynaptiC Boutons sind mit Pfeilen gekennzeichnet, und eine Überlagerung von Leuchtstofflampen und DIC Bildern zeigt sich in b. 3. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"> <li>Stimulation <ol><li>mit einem Mikromanipulator unter Sichtkontrolle, legen Sie die Stimulationselektrode in der Nähe der Axon innervieren Abdominalsegmente 2-4.</li>
		<li>Anwenden Unterdruck durch ziehen den Kolben der Spritze, Elektrodenhalter, verbunden, so dass das Axon, im Inneren der Elektrode ( Abbildung 2 gezogen wird).</li>
		<li>Schalten Sie den Stimulator. Drehen Sie den Knopf am Gerät isoliert (siehe Tabelle der Materialien) einen Null Strom festlegen und dann vorsichtig erhöhen, bis EJCs erscheinen (oder der Schwellenwert erreicht ist).</li>
		<li>Führen die Stimulation in einem überschwelligen Regime, mit dem Reizstrom ca. zweimal erhöht, im Vergleich zu den Schwellenwert für die Beobachtung der EJCs. 
		Hinweis: Nach unserer Erfahrung ist solche Reizintensität optimal zur Vermeidung von Aktionspotential Ausfälle und Aktionspotential ausgelöst. Zum Beispiel, wenn EJCs erscheinen bei der Stimulation Strom von 0,2 mA, verwenden Sie einen Strom von 0,4 mA während des Experiments.</li>
	</ol></li> <li>Dichtung Widerstand <ol><li>messen Sie den Siegel-Widerstand der Aufnahme Macropatch Elektrode durch Drehen des Elektrode Widerstand Schalters des Verstärkers zu " Dichtung Test " Position. Beachten Sie, dass der Dichtung Widerstandswert in GΩ in angezeigt wird die " aktueller " Fenster.</li>
		<li>Sicherstellen, dass die Dichtung Widerstand ist im Bereich von 0,5 - 2 M Ω. Werte außerhalb dieses Bereichs zeigen, dass die Elektrode nicht richtig poliert oder nicht richtig positioniert ist.</li>
		<li>Dichtung Widerstand während der Aufnahme zu überwachen, damit es während des Experiments konstant bleibt.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse <ol><li>Analyze Aufnahmen beschäftigt maßgeschneiderte Software für die Analyse (siehe Tabelle der Werkstoffe). 
	Hinweis: Unser Labor verwendet eigenen Software Quantan 31, die für die Erkennung von EJCs und mEJCs fokal aufgenommen ( Abbildung 4) angepasst ist. Diese Software beinhaltet eine Gaußsche Digitalfilter und ermöglicht die Erkennung von Quanten Gipfeln in überlappenden Multi-Quanten Ereignisse ( Abb. 4A). Andere Ansätze sind beschrieben im 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg"> Abbildung 4. Quanten-Analyse. Erkennung von mEJCs (A) und (B) EJCs von Quantan Software. Das Veranstaltungsgelände ist grün markiert, und Spitzen zeichnen sich durch roten Pfeilspitzen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Drosophila ist eine vorteilhafte Modellorganismus synaptische Übertragung zu studieren. Mehrere Aufnahme Konfigurationen wurden bei den Larven NMJ, einschließlich intrazelluläre Aufnahmen der synaptischen Potentiale, Aufnahmen der synaptischen Ströme mit zwei Elektroden Spannung Klemme33,34und fokale Macropatch verwendet Aufnahmen der synaptischen Ströme, die hier beschrieben. Diese Technik ermöglicht die präzise Quantifizierung der synaptischen Übertrag...

Drosophila ist ein ausgezeichnetes Modell, die molekularen Mechanismen, die Kontrolle der synaptischen Übertragung zu studieren. Das neuromuskuläre System in Drosophila ist glutamatergen und die Drosophila neuromuskuläre Synapse (NMJ) kann daher verwendet werden, um die konservierten Funktionen des glutamatergen Release zu studieren. Seit Jan und Jan Studie1die dritte Instar Larven weitgehend genutzt, evozierte und spontane synaptische Übertragung durch die Überwachung der exzitatorischen Kreuzung Potentiale (EJPs) oder Strömungen (EJCs) zu studieren. EJPs werden häufig mit einem scharfen Mikro-Glaselektrode intrazellulär aufgezeichnet, und sie reflektieren die Aktivität der gesamten NMJ, einschließlich alle Boutons Synapsen bei der gegebenen Muskelfaser machen.
Im Gegensatz dazu kann die Aktivität von einer begrenzten Anzahl von Standorten der Veröffentlichung fokal durch die Positionierung eines Mikropipette Tipp in der Nähe von neuronalen Terminals oder synaptischen Krampfadern aufgezeichnet werden. Diese Technik wurde ursprünglich von Katz und Miledi2eingesetzt und fokale extrazelluläre Aufnahmen haben erfolgreich an mehreren NMJ Vorbereitungen, einschließlich Frosch3,4,5, Maus6 eingesetzte , 7 , 8, Krustentier9,10,11,12,13,14,15,16und Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Dieser Ansatz wurde von Dudel, weiterentwickelt, die Umkodierung Elektroden24,25Macropatch optimiert. Diese Technik abgestimmt Dudel Umsetzung eng locker-Patch-Clamp-Methode26.
Die Drosophila Larven NMJ hat klar definierte synaptischen Boutons und transgene Linien mit genetisch codierte neuronalen fluoreszierende Tags (siehe Tabelle der Materialien) sind leicht zugänglich. Diese Vorteile konnten wir EJCs und mEJCs aus einer ausgewählten synaptische Bouton20,21,22aufnehmen. Hier beschreiben wir diese Technik im Detail.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Mikroelektrodenabzieher</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Glaskapilare</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Glaskapilare</td></tr><tr><td>Microtorch 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td>Microtorch</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>Silikon zur Vorbereitung von Sezierplatten</td></tr><tr><td>Präpariernadeln</td><td>Amazon</td><td>B00J5PMPJA</td><td>Stifte zum Positionieren von Larven</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>Pinzette zum Platzieren von Stecknadeln, Entfernen von Eingeweiden und Luftröhren.</td></tr><tr><td>Schere</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>Schere zum Schneiden der Nagelhaut der Larven und Nerven.</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>Aufrechtes Mikroskop</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>Mikroskop Objektiv 60X</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>Mikroskop Objektiv 10X</td></tr><tr><td>Narishige Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>Dreiachsiger Wasser Hydraulischer Mikromanipulator</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>Elektrophysiologischer Verstärker</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>Elektrischer Stimulator</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Stimulus-Isolator</td></tr><tr><td>TMC Antivibrationstisch</td><td>TMC</td><td>63-9090</td><td>Antivibrationstisch</td></tr><tr><td>TMC Faradayscher Käfig</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>Faradayscher Käfig</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td>Digidata</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Dell Dimension 5150</td><td>Computer mit Win XP OS</td></tr><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>Elektrodenhalter</td></tr><tr><td>Optischer Filter</td><td>Omega optisch</td><td>XF 115-2</td><td>Filterwürfel für die Detektion von grün fluoreszierendem Protein (GFP)</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>Software zur Signalaufzeichnung</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>Hauseigene</td> <td>Software-Software</td> <td>zur Signalverarbeitung</td></tr><tr><td>Canton-S (Wildtype)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Control Fliegenschnur</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>Großzügiges Geschenk von J.T. Littleton-Complexin</td><td></td> <td>Knock-out-Fliegenschnur mit erhöhter spontaner Exozytose</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>Fliegenschnur mit neuronaler Fluoreszenz (GFP) Tag</td></tr></tbody></table>

fokale macropatch aufnahmen der synaptischen ströme aus der drosophila larvalen neuromuskulären synapse

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell, glutamatergen synaptische Übertragung zu studieren. Wir beschreiben die Technik der fokalen Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme von visualisierten Boutons bei der Drosophila Larven NMJ. Diese Technik erfordert maßgeschneiderte Herstellung von Aufnahme Mikropipetten sowie ausgestattet mit einer hohen Vergrößerung, Fernverkehr Wasser eintauchen Ziel, differential Interferenz Kontrast (DIC) Optik und eine fluoreszierende Verbindung Mikroskop Anlage. Die Aufnahme-Elektrode befindet sich auf der Oberseite eine ausgewählte synaptische Bouton visualisiert mit DIC Optik, Epi-Fluoreszenz oder beides. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es ermöglicht die Überwachung der synaptischen Aktivität von einer begrenzten Anzahl von Standorten der Veröffentlichung. Die Aufnahme-Elektrode hat einen Durchmesser von mehreren Mikrometern und die Freigabe-Websites außerhalb der Elektrode Felge beeinflussen nicht signifikant die aufgezeichneten Strömungen. Die aufgezeichneten synaptische Ströme haben schnelle Kinetik und können leicht gelöst werden. Diese Vorteile sind besonders wichtig für das Studium der mutierten Fliegenschnüre mit verstärkten spontan oder asynchronen synaptische Aktivität.

Fokale Macropatch Aufnahmen ermöglichen Überwachung synaptische Aktivität von ausgewählten synaptischen Boutons (Abbildung 5). Wenn die Elektrode an der Oberseite eine synaptische Bouton (Abbildung 5A, Seite 1) positioniert ist, die aufgenommenen mEJCs (Abbildung 5, Seite 1) haben eine Amplituden, die deutlich über den Geräuschpegel und scharf steigende Phasen (bei einer Sub-Millisekunden-Bereich). W...

Synaptische Ströme können fokal aus visualisierten synaptischen Boutons bei der Drosophila dritte Instar Larven neuromuskulären Synapse aufgenommen werden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Tätigkeit von einem einzigen synaptische Bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die synaptische Aktivität der visualisierten synaptischen Boutons an der neuromuskulären Verbindung der Drosophilalarven zu überwachen. Ein hervorragendes Modellsystem, das leicht an genetische Manipulationen angepasst werden kann. Diese Technik kann Schlüsselfragen in Ihrer Wissenschaft beantworten.Zum Beispiel, wie Mutationen von synaptischen Proteinen die synaptische Übertragung regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Aktivität einer begrenzten Anzahl von Freisetzungsstellen überwacht und aufgezeichnet werden kann, Ströme schneller Kinetik und leicht aufgelöst werden können. Um das Experiment zu beginnen:Bereiten Sie den Mikroelektrodenabzieher vor.Verwenden Sie ein Mikroskop mit 35-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass der Innendurchmesser der gezogenen Elektrode im Bereich von sieben bis zehn Mikrometern liegt. Lagern Sie die Kapillaren in dicht verschlossenen Behältern, um Staubansammlungen zu vermeiden. Anschließend werden die Kapillaren mit einer Mikroschmiede feuerpoliert.Stellen Sie sicher, dass der endgültige Innendurchmesser der polierten Elektrode fünf Mikrometer beträgt. Gehen Sie dann zum Biegen über. Fixieren Sie die Elektrode im Manipulator und positionieren Sie die Spitze über dem Filament, ohne es zu berühren.Stellen Sie den Heizwert auf 60-70% des Maximums ein und drücken Sie das Pedal der Mikroschmiede für ein bis zwei Sekunden, um das Filament zu erhitzen. Ziehe die Spitze der Elektrode mit einer L-förmigen Nadel vorsichtig nach unten und biege sie um etwa 90 Grad. Halten Sie die Elektrode mit der Hand über die Flamme des Brenners und machen Sie die zweite Biegung sieben bis zehn Millimeter von der ersten Biegung entfernt und in einem Winkel von etwa 120 Grad.Bereiten Sie eine hämolymphähnliche oder HL3-Lösung vor. Bewahren Sie die Lösung im Kühlschrank auf und machen Sie sie jede Woche frisch. Bereiten Sie Stimulationspipetten auf die gleiche Weise vor wie die Aufnahme von Glaspipetten, ohne sie zu verbiegen.Führen Sie anschließend eine Stimulationspipette in einen Mikroelektrodenhalter ein, der mit einer Spritze verbunden ist. Hergestellte Sezierplatten aus kleinen Petrischale, die mit Silikonkautschuk-Epoxidharz beschichtet sind. Dann entnehmen Sie mit einer Pinzette eine wandernde Larve des dritten Stadiums aus einem Fläschchen.Stecke die Larven fest, indem du die erste Nadel in den hinteren Bereich und die weitere vordere Nadel in der Nähe der Maulhaken legst. Fügen Sie eine HL3-Lösung hinzu. Machen Sie auf der Rückenseite der Larven mit einer Federschere einen Schnitt vom oberen zum unteren Stift.Stecke das Larvenfilet fest, indem du zwei weitere Stecknadeln links und rechts der Larven ansteckst. Entferne die Eingeweide und die Luftröhre mit einer Pinzette. Schneide die Nerven knapp außerhalb des ventralen Nervenstrangs mit einer Federschere durch.Stellen Sie die Petrischale mit dem Präparat auf den Mikroskoptisch. Führen Sie die Referenzelektrode in das Bad ein. Füllen Sie die Aufzeichnungselektrode mit HL3-Lösung.Tauchen Sie die Elektrode unter dem 10X-Objektiv in das Bad und platzieren Sie sie mit dem Mikromanipulator über den Muskeln sechs und sieben der Bauchmuskeln von zwei, drei oder vier. Schalten Sie dann das Objektiv auf 60X und fokussieren Sie sich auf den interessierenden Bereich, indem Sie entweder Epi-Fluoreszenz- oder DIC-Optik verwenden. Legen Sie die Spitze der Elektrode auf den synaptischen Bouton und drücken Sie die Elektrode dann sehr vorsichtig auf den Muskel, da übermäßiger Druck den NMJ schädigen oder eine Zunahme der spontanen synaptischen Aktivität induzieren kann.Schalten Sie als Nächstes den Verstärker, die AD-Platine und den Computer ein. Wählen Sie dann den Spannungsklemmmodus am Verstärker. Starten Sie die Erfassungssoftware, wählen Sie den lückenlosen Modus und beobachten Sie das Erscheinungsbild von MEJCs auf dem Computerbildschirm.Stellen Sie sicher, dass die Amplitude der MEJCs im Bereich von 0,2 bis 0,7 Nanoampere liegt. Platzieren Sie die Stimulationselektrode mit einem Mikromanipulator unter visueller Kontrolle in der Nähe des Axons, das die Bauchsegmente zwei bis vier innerviert. Üben Sie Unterdruck aus, indem Sie den Kolben der Spritze, die mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, so ziehen, dass das Axon in die Elektrode hineingezogen wird.Schalten Sie als Nächstes den Stimulator ein. Drehen Sie den Knopf an der Isolationseinheit, um einen Nullstrom einzustellen, und erhöhen Sie ihn dann vorsichtig, bis die EJCs erscheinen oder der Schwellenwert erreicht ist. Führen Sie die Stimulation in einem überschwelligen Regime durch.Mit dem Stimulationsstrom steigt der Strom etwa doppelt so hoch wie die Schwelle für die Beobachtung von EJCs. Messen Sie den Siegelwiderstand der aufzeichnenden Makro-Patch-Elektrode, indem Sie den Elektrodenwiderstandsschalter des Verstärkers in die Dichtheitstestposition drehen. Beachten Sie den Wert des Dichtungswiderstands in Giga Ohm, der im aktuellen Fenster angezeigt wird.Fokale Makro-Patch-Aufzeichnungen ermöglichen die Überwachung der synaptischen Aktivität von ausgewählten synaptischen Boutons. Wenn die Elektrode auf einem synaptischen Bouton positioniert wird, weisen die aufgezeichneten MEJCs Amplituden auf, die den Rauschpegel deutlich übertreffen, und scharfe Anstiegsphasen im Bereich von unter einer Millisekunde. Wenn die Aufzeichnungselektrode um mehrere Mikrometer vom synaptischen Bouton weg bewegt wird, sinken die Amplituden der Recorder-MEJCs fast auf den Rauschpegel ab.Die aufgezeichneten EJCs sind kaum vom Rauschen zu unterscheiden und weisen verlängerte Anstiegsphasen auf. Fokale Aufzeichnungen ermöglichen einen genauen Nachweis von MEJCs in der Komplex- und Gnom-Mutante. Während die interzellulären Aufzeichnungen dieser Mutante Freisetzungsereignisse aufweisen, die sich überlappen und nicht zuverlässig nachgewiesen werden können.Die Einstellung der Winkel des Elektrochips ist entscheidend für die Positionierung der Elektrode. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Überprüfung der Abbildung einzelner Freisetzungsereignisse, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Integration der Aktivität einzelner aktiver Zonen zu beantworten.

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von...

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

In situ Patch Clamp Messungen sind für elektrophysiologische Charakterisierung von Neuronen im intakten Schaltung verwendet. In der Drosophila genetische Modell Patch-Clamp ist schwierig, weil das ZNS ist klein und umgeben von einer robusten Hülle. Dieser Artikel beschreibt die Vorgehensweise, um die Scheide und sauber Neuronen für nachfolgende Patch Clamp Messungen entfernen.

Herstellung<em&gt; Drosophila</em&gt; Central Neuronen<em&gt; In situ</em&gt; Patch Clamping

Die Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) wird als Modell verwendet, um die Morphologie und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Dieses Video beschreibt wichtige Merkmale, die Forscher quantifizieren, um das NMJ zu charakterisieren. Das Beispielprotokoll demonstriert eine Software, die in der Lage ist, die Quantifizierung automatisch durchzuführen.

Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Verbindung (NMJ): Eine Methode zur Beurteilung der synaptischen Morphologie und Funktion

Dieses Video demonstriert die Technik zur Aufzeichnung synaptischer Ströme von einem synaptischen Bouton an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Aktivität eines einzelnen synaptischen Boutons, was für die Untersuchung mutierter Fliegenlinien mit erhöhter spontaner oder asynchroner synaptischer Aktivität wichtig ist.

Aufzeichnung synaptischer Ströme an der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Die Aufzeichnung von Ca2+-Strömen an der präsynaptischen Freisetzungsgesichtsmembran ist der Schlüssel zu einem präzisen Verständnis des Ca2+-Eintritts und der Neurotransmitterfreisetzung. Wir präsentieren eine akute Dissoziation des Neunauge-Rückenmarks, die funktionelle isolierte retikulospinale Axone liefert, die eine Aufzeichnung direkt von der Freisetzungsgesichtsmembran einzelner präsynaptischer Endungen ermöglichen.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Die neuromuskuläre Verbindung der Zebrafischlarve ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie. Es ist für viele experimentelle Techniken zugänglich, einschließlich Elektrophysiologie und optischer Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Abbildung der synaptischen Übertragung mit einer pHluorin-basierten Sonde unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Lernen Sie fokale Macropatch-Aufnahmen zur Untersuchung synaptischer Ströme an der Drosophila-Larve. Diese Methode ermöglicht die präzise Analyse genetischer Mutationen auf die synaptische Übertragung.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

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