Methoden zur Analyse der Auswirkungen des natürlichen Urans auf In-vitro- Osteoclastogenesis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der natürlichen Uranexposition auf die Lebensfähigkeit, Differenzierung und Funktion von Osteoklasten zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Umwelttoxizität über die Auswirkungen der Uranexposition auf die Knochenphysiologie und den Stoffwechsel zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein interessantes neues Werkzeug für das Screening von Uranoriginatoren darstellt.

Wenn die RAW 264.7-Zellkultur eine Konfluenz von 85 bis 90 % erreicht hat, heben Sie die Zellen mit einem Zellschaber mechanisch vom Boden des Zellkulturkolbens ab und überführen Sie die Zellen in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie die Zelllösung einige Male, um die Klumpen aufzubrechen und die resultierende einzellige Suspension zu zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von einmal 10 bis 1/4 Zellen pro Milliliter in alpha-modifiziertem Minimum Essential Medium, ergänzt mit L-Glutamin und 5 % fötalem Rinderserum, und geben Sie einen Milliliter Zellen pro Well für eine sechsstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius in eine 24-Well-Zellkulturplatte.

Ein wichtiger Parameter für die Reproduzierbarkeit des Osteoklasten-Differenzierungs- und Reabsorptionsassays ist die Zellaussaatdichte. Achten Sie besonders auf die Zellzählung, die Vorbereitung der Zellsuspension und deren Homogenität, bevor Sie die Zellen plattieren. Zur Herstellung der Urinalsalzlösung wird ausgehend von einer sterilen, in Zellkulturen getesteten wässrigen 7,5%igen Natriumbikarbonatlösung zunächst 100 millimolare Bikarbonat in Wasser auf Eis hergestellt und abgekühlt und ein Volumen 100 millimolare Urinalacetatlösung tropfenweise Tropfen für Tropfen in neun Volumina der eiskalten Bikarbonatlösung unter leichtem Schütteln gegeben.

Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur äquilibrieren. Nach drei Stunden wird das entsprechende Volumen der Urinallösung Tropfen für Tropfen in ein Differenzierungsmedium mit einem Gehalt von 50 Nanogramm pro Milliliter RANKL verdünnt, bis die gewünschte Urinal-Arbeitskonzentration erreicht ist, und weitere drei Stunden Äquilibrierung bei Raumtemperatur zugelassen. Die langen Inkubationsschritte nach jeder Verdünnung des Urinalsalzes sind essentiell für die Stabilisierung der Urinalkomplexe in den Lösungen.

Am Ende der zweiten Gleichgewichtsperiode wird das Medium in jeder Vertiefung vorsichtig durch einen Milliliter mit urinalbehandeltem Urinal oder Kontrollmedium ersetzt und die Zellen wieder in den Inkubator eingesetzt. Mehrkernige Osteoklasten sollten zwischen dem dritten und vierten Kulturtag auftreten. Um die Größe und Morphologie der neu differenzierten Osteoklasten zu beurteilen, färben Sie die Zellen mit tartratresistenter saurer Phosphatase gemäß den Anweisungen des Herstellers und bilden Sie die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung mit einer Auflösung ab, die für die Unterscheidung der Zellkerne ausreicht

Wenn alle Wells abgebildet wurden, öffnen Sie ein Image eines Wells mit der Open-Source-Software ImageJ, und überprüfen Sie die Skalierungseinheiten. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Global im Popup-Fenster, um die neuen Maßstabseinheiten auf alle späteren Bilder anzuwenden. Wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen aus, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Bereich und Anzeigebeschriftung.

Deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen. Öffnen Sie im Menü "Analysieren" die Extras, dann den "Region of Interest"-Manager und wählen Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug im Hauptfenster von ImageJ aus. Skizzieren Sie einen Interessenbereich von etwa 1.000 x 1.000 Mikrometern, und klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, um die Auswahl dem Interessenbereichs-Manager hinzuzufügen.

Klicken Sie dann auf Mehr, Speichern, um die Region zu speichern. Um eine Kopie einer der fünf zu analysierenden Regionen zu erstellen, wählen Sie den Interessenbereich im Manager für Interessenbereich aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste in den ausgewählten Bereich, um den Bereich zu duplizieren. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Alle anzeigen und Beschriftungen, und wählen Sie das Polygonauswahlwerkzeug aus, um einen der Osteoklasten im duplizierten Interessenbereich manuell zu umranden.

Um diese Gliederung zum Manager für Interessenregion hinzuzufügen, klicken Sie im Fenster Manager für Interessenregion auf Hinzufügen. Wenn alle Osteoklasten hinzugefügt wurden, markieren Sie alle Umrisse und klicken Sie auf Messen, um ihre Oberflächen zu messen. Übertragen Sie dann die Messungen, die im Ergebnisfenster angezeigt werden, in eine Tabelle.

Um die Funktion von urinalbehandelten Osteoklasten zu beurteilen, wird einen Tag vor der Zugabe des Differenzierungsmediums RAW-Zellen aus einer 85 bis 90%igen konfluenten Zellkultur auf eine 24-Well-Osteo-Assay-Platte in Wachstumsmedium aufgefüllt, wie gerade gezeigt. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand vorsichtig durch ein Differenzierungsurinal, das Medium enthält, und lassen Sie die RAW-Zellen sich zu Osteoklasten differenzieren, wie gerade gezeigt. Ersetzen Sie am fünften Tag der Osteoklastogenese das urinalhaltige Medium durch eine 10%ige Bleichlösung, um die Zellen von der mimetischen Oberfläche des Knochens zu entfernen.

Waschen Sie die Vertiefungen nach fünf Minuten bei Raumtemperatur zweimal mit entionisiertem Wasser und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Färben Sie anschließend die Calciumsalze in den nicht resorbierten Bereichen jeder Vertiefung mit einer 1%igen Alizarinrot S-Natriumsalzlösung. Entfernen Sie nach 10 bis 15 Sekunden die Alizarinlösung und waschen Sie die Vertiefungen drei- bis viermal vorsichtig mit Wasser.

Um ein RGB-Bild der mit Alizarin gefärbten Wells in ein 8-Bit-Graustufenformat zu konvertieren, wählen Sie im Menü Bild die Option Typ und 8-Bit aus. Umreißen Sie dann mit dem ovalen Auswahlwerkzeug die gesamte Oberfläche des Bohrlochs, das auf Resorption analysiert werden soll, und speichern Sie den interessierenden Bereich, wie gerade gezeigt. Um die Auswahl des Schwellenwerts zu erleichtern, wählen Sie Bearbeiten und außerhalb löschen aus, um alle Features außerhalb des definierten Interessenbereichs zu löschen.

Duplizieren Sie den interessierenden Bereich, wie gerade gezeigt, und wählen Sie im Menü Bild die Option Schwellenwert anpassen aus, und passen Sie den Schieberegler an, um einen geeigneten Schwellenwert auszuwählen. Alle resorbierten Bereiche sollten über dem Schwellenwert liegen und weiß erscheinen, während alle nicht resorbierten Bereiche unter dem Schwellenwert liegen und rot erscheinen sollten. Um die Auswahl des Schwellenwerts abzuschließen, klicken Sie im Fenster Schwellenwert auf Anwenden und speichern Sie das endgültige Binärbild im entsprechenden Format.

Um die Messungen zu definieren, die innerhalb des Interessenbereichs durchgeführt werden sollen, wählen Sie im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen aus, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Fläche, Flächenbruch und Auf Schwellenwert begrenzen und deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen. Um dann den Anteil der resorbierten Fläche direkt im Ergebnisfenster zu erhalten, invertieren Sie das duplizierte Binärbild, indem Sie im Menü Bearbeiten die Option Invertieren auswählen und darauf achten, dass der Hauptbereich von Interesse auf dem endgültigen Binärbild ausgewählt ist, und messen Sie den Anteil der resorbierten Fläche. Die Veränderungen in Anzahl und Größe der neu differenzierten Osteoklasten als Reaktion auf Uran sind in zusammengesetzten Bildern ganzer Vertiefungen sowie in vergrößerten Bildern ausgewählter Regionen von Interesse gut sichtbar.

Die Größe der Osteoklasten, die unter verschiedenen Kulturbedingungen gezüchtet wurden, kann analysiert werden, wie gerade gezeigt wird, indem alle Osteoklasten innerhalb jeder Region skizziert und die Fläche jeder umrissenen Zelle gemessen wird. Um den Einfluss von Uran auf die Resorptionsaktivität von Osteoklasten zu untersuchen, werden RAW 264.7-Zellen plattiert und auf osteomimetischen Oberflächenplatten differenziert. Am Ende des Assays werden die Osteoklasten entfernt und die nicht resorbierten Bereiche wie demonstriert gefärbt und abgebildet.

Die Bilder werden dann in 8-Bit-Graustufen konvertiert und mit einem Schwellenwert versehen, um die Berechnung der resorbierten Bereiche zu erleichtern. Dieses Verfahren kann auch auf die Untersuchung des Einflusses anderer Schwermetalle auf die Osteoklastogenese angewendet werden.