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Färbung mit Annexin V und Propidiumjodid

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Annexin V and Propidium Iodide Labeling

4.12: Detecting Reactive Oxygen Species

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09:09 min

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April 30, 2023

Overview

Färbung mit annexin V und Propidium Jodid (PI) bietet Forschern eine Möglichkeit, verschiedene Arten von Zelltod zu identifizieren – Nekrose oder Apoptose. Diese Technik beruht auf zwei Komponenten. Das erste, annexin V, ist ein Protein, das bestimmte Phospholipide, genannt Phosphatidylserines, die normalerweise auftreten, nur in der inneren, Zytoplasma gerichtete Broschüre eine Zellmembran, sondern werden “gekippt”, die äußeren Broschüre während der frühen Stadien der Apoptose bindet. Die zweite Komponente ist die DNA-Bindung Farbstoff Molekül PI, die nur Zellen eingeben können, wenn ihre Membranen gebrochen werden – ein Merkmal der Nekrose und späten Apoptose.

In diesem video Artikel beginnt mit einem Überblick über die Konzepte hinter annexin V und PI Färbung, und betont, wie unterschiedliche Muster der Färbung kann zur Unterscheidung zwischen Zellen nach unten verschiedene Tod Wege voran. Wir überprüfen dann eine generalisierte Protokoll für diese Technik, gefolgt von einer Beschreibung wie Forscher derzeit annexin V und zum besseren Verständnis Zelltod Färbung PI verwenden.

Procedure

Annexin V und Propidium Jodid (PI) Kennzeichnung von Zellen ist eine Technik verwendet, um Zelltod zu identifizieren und seine verschiedene Wege unterscheiden: Apoptose, oder programmierter Zelltod und Nekrose. Zellen durchlaufen unterschiedliche morphologische Veränderungen je nach dem Weg. Durch die Identifizierung der spezifischen Bedingungen, die eine Zelle Apoptose oder Nekrose unterziehen führen, Wissenschaftler gewinnen Einblick in die zelluläre Physiologie und Pathophysiologie der Erkrankung. Annexin V und PI Beschriftung, gefolgt von Durchflusszytometrie, entstand als eine der effizientesten Methoden, um die Art der Zelltod zu kategorisieren.

Heute beschreiben wir, wie dieser Test hilft bei der Identifizierung von Zelle Tod wegen gewusst wie: führen Sie diese Technik und einige spannende Beispiel Experimente, die diese Methode verwenden, um wichtige Fragen auf dem Gebiet der Zellbiologie zu beantworten.

Zunächst werfen wir einen Blick auf die Prinzipien hinter annexin V und PI Färbung.

Wie bereits erwähnt, weisen Apoptotic Zellen morphologische Besonderheiten. Dazu gehören Zelle Schrumpfung, Membran Blebbing, nukleare Fragmentierung und die Darstellung des apoptotischen Körper. Darüber hinaus folgende Induktion der Apoptose – d. h. Apoptotic frühzeitig – bestimmte charakteristischen Veränderungen erscheinen auf der Membran. Eine normale Zelle Membrane hat die Phosphatidylserin oder PS-Rückstände auf dem inneren Merkblatt. Jedoch im frühen Apoptotic Zellen sind einige dieser PS-Rückstände an der äußeren Oberfläche umgesiedelt – aber wie?

Um zu verstehen, dass, gehen wir einen Schritt zurück. Während der Apoptose ist es bekannt, dass cytosolische Caspasen aktiviert werden. Diese Enzyme aktivieren wiederum eine Membrane-springen-Enzym namens Scramblase. Scramblase verschlüsselt”” der Zellmembran von translocating PS Rückstände aus der zytoplasmatischen Seite zur Außenfläche. Im Gegensatz dazu während Nekrose PS bleiben Rückstände wo sie sind, aber die Membran selbst Brüche. Annexin V und PI Kennzeichnung nutzen diese Unterschiede in der Membran Veränderungen der zwei Arten von Zelltod.

Annexin V konjugiert mit fluoreszierenden Farbstoff wie Fluorescein erfolgt – gemeinhin als FITC – ist eine Membran undurchlässig, natürlichen Liganden für PS, und daher leicht identifiziert frühen Apoptotic Zellen durch die Bindung an die externalisierte PS. Anschluss an Membran-Bruch, die während der Nekrose und auch in späteren Phasen der Apoptose, Knochenoder auftritt kann jedoch auch binden an PS auf der Innenseite und falsch positive Ergebnisse liefern.

Um dies zu vermeiden, verwenden Wissenschaftler PI. Dieses DNA-bindenden Farbstoff Molekül ist wieder Membran undurchlässig, und kann nur eine Zelle eingeben, wenn die Membran gebrochen ist. Wenn eine Zelle ist, dass nur Knochenoder es gefärbt also frühen Apoptotic während eine Zelle PI und annexin gebeizt nekrotische oder späten Apoptotic sein könnte.

Nun, da Sie die grundlegenden Prinzipien hinter dieser Assay gelernt haben, gehen Sie wir durch das Verfahren der Färbung und Zelltod zu analysieren.

Erstens sind Zellen geerntet und zentrifugiert bei niedriger Drehzahl, morphologische Störungen zu verhindern und Nukleinsäuretablette in physiologischen waschen Puffer wie Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, auch bekannt als PBS. Im Anschluss an ein weiterer Zentrifugationsschritt Zellen sind Nukleinsäuretablette in annexin V Bindung Puffer, enthält Kalzium, was notwendig für Knochenoder Bindung an PS. Annexin V mit FITC konjugiert ist dann die Lösung, die bei Raumtemperatur im Dunkeln Knochenoder und PS-Vereinigung ermöglichen ausgebrütet wird hinzugefügt. PI ist im nächsten Schritt direkt hinzugefügt, um die annexin Zelle Färbelösung und im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation sind Zellen durch Zentrifugation mit PBS-Puffer gewaschen, Nukleinsäuretablette im Puffer waschen und auf Eis gehalten. Jetzt sind sie bereit für die Analyse.

Fluoreszenz-Aktivität der Zellen ist durch Durchflusszytometrie, eine Laser-basierte Technik analysiert, die Fluoreszenz-Daten von einzelnen Zellen in einem Strom von Flüssigkeit suspendiert erfasst. Nach der Fluoreszenz-Kalibrierung mit Zellen, die separat mit jeder Farbstoff gefärbt werden Daten aus dual gefärbten Zellen erworben. Fluoreszenz-Signale von der Zellpopulation werden verwendet, um einen Plot erstellen, wo annexin-gebundenen FITC Intensität auf der logarithmischen X-Achse und PI auf der logarithmischen Y-Achse aufgetragen. Zellen, die annexin-FITC-positiv und negativ PI wird auf der rechten unteren Seite des Grundstücks, cluster repräsentieren die frühen Apoptotic Zellen und Zellen doppelt positiv für annexin-FITC und PI wird rechts oben, Vertreter der späten Apoptotic oder nekrotischen Zellen auftreten. Live sind die Zellen, die ungefärbten oder unwesentlich gebeizt für Knochenoder und PI bleiben.

Da Sie nun wissen, warum Zellbiologen verlassen sich auf diese Technik, um Zelltod zu untersuchen, warum nicht wir einige seiner Anwendungen überprüfen.

Mit diesem Verfahren können Wissenschaftler verfolgen welche intrazelluläre Proteine bei der Apoptose beteiligt sind. In diesem Video haben die Forscher die Wirkung von Cisplatin, eine Anti-Krebs-Medikament, auf normal Nierenzellen zu sehen, ob es Apoptose induziert analysiert. Eine Gruppe von Zellen um eine aktive Form der das Enzym Proteinkinase C oder PKC overexpress ausgestrahlt wurde, und die andere Gruppe wurde mit einer nicht-funktionale Form ausgestrahlt – dominant negativen PKC. Zellen mit dem Ausdruck PKC und mit Cisplatin behandelt unterzog sich Apoptose im Laufe der Zeit, aber mit dem Ausdruck der inaktiven dominant negativen PKC Zellen waren resistent gegen Apoptose, darauf hinweist, dass das Enzym ein wichtiger Akteur in der Cisplatin-induzierten Apoptose-Signalweg ist.

Forscher verwenden auch diese Flecken der zytotoxische Potenzial der spezifischen T-Zellen zu testen. Zytotoxischen T-Zellen können bestimmte Membranproteine auf die Zielzelle zu erkennen und seinen Tod auf Bindung an es zu induzieren. Hier Forscher Antigen-spezifische T-Zellen mit Ziel Tumorzellen und annexin V, inkubiert und dann beobachtet Induktion der Tumor Zelle Apoptose durch T-Zell-Engagement. Flow Cytometry Daten offenbart den Prozentsatz der Ziel Zelltod in an- und Abwesenheit von zytotoxischen T-Zellen.

Zu guter Letzt verwenden Wissenschaftler diese Methode, um Zellviabilität nach gen Lieferung zu bewerten. In diesem Fall wollten Forscher Zelle Überleben nach Nucleofection zu beurteilen – eine Methode, die eine Kombination von Chemikalien und einem angewandten elektrischen Feld verwendet, um vorübergehende erstellen Poren in zellulären und nukleare Membranen, wodurch gen Lieferung. Mithilfe von annexin V plus ein Farbstoff namens 7-Aminoactinomycin D oder 7-AAD, die, ähnlich wie PI an DNA bindet, sie zeigten, dass Nucleofection verursacht geringe Zelltod durch Apoptose oder Nekrose.

Sie haben nur Jupiters Video auf annexin V und PI Kennzeichnung angesehen. In diesem Video wir kurz diskutiert die charakteristischen Merkmale der Apoptose und nekrotischen Zellen, überprüft die Prinzipien, die hinter dieser Methode, beobachtete eine verallgemeinerte Verfahren dafür häufig benutzte Technik, und einige Anwendungen in der Vorschau angezeigt. Angesichts der Bedeutung zu verstehen, wie verschiedene Zellen dient sterben unter verschiedenen Bedingungen, annexin V und PI Kennzeichnung als ein wichtiges Instrument für Zellbiologen dieses Phänomen interessiert. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Annexin V and propidium iodide (PI) labeling of cells is a technique used to identify cell death, and distinguish between its different pathways: apoptosis, or programmed cell death, and necrosis. Cells undergo distinct morphological changes depending on the pathway. By identifying the specific conditions that lead a cell to undergo apoptosis or necrosis, scientists gain insight into cellular physiology and the pathophysiology of disease. Annexin V and PI labeling, followed by flow cytometry, has been established as one of the most efficient methods to categorize the type of cell death.

Today, we’ll describe how this assay helps in identification of cell death pathways, how to perform this technique, and some exciting example experiments that use this method to answer important questions in the field of cell biology.

First, let’s take a look at the principles behind annexin V and PI staining.

As mentioned earlier, apoptotic cells exhibit distinctive morphological features. These include cell shrinkage, membrane blebbing, nuclear fragmentation, and the appearance of apoptotic bodies. In addition, following induction of apoptosis—that is, at the early apoptotic stage—certain characteristic changes appear on the membrane. A normal cell membrane has all the phosphatidylserine or PS residues on the inner leaflet. However, in early apoptotic cells some of these PS residues are translocated to the outer surface—but how?

To understand that, let’s take a step back. During apoptosis, it is well known that cytosolic caspases are activated. These enzymes in turn activate a membrane-bound enzyme called scramblase. Scramblase “scrambles” the cell membrane by translocating PS residues from the cytoplasmic side to the outer surface. In contrast, during necrosis PS residues remain where they are, but the membrane itself ruptures. Annexin V and PI labeling capitalize on these differences in membrane alterations of the two types of cell death.

Annexin V conjugated with fluorescent dye, such as fluorescein isothiocyanate—commonly known as FITC—is a membrane impermeable, natural ligand for PS, and therefore easily identifies early apoptotic cells by binding to the externalized PS. However, following membrane rupture, which occurs during necrosis and also during later stages of apoptosis, annexin can also bind to PS on the inner face and yield false positives.

To avoid this, scientists use PI. This DNA binding dye molecule is again membrane impermeable, and can only enter a cell when the membrane is ruptured. Therefore, if a cell is only annexin stained it is early apoptotic, whereas a cell that is both PI and annexin stained could be either necrotic or late apoptotic.

Now that you’ve learned the basic principles behind this assay, let’s go through the procedure of staining and analyzing cell death.

First, cells are harvested and centrifuged at low speed to prevent any morphological disruption, and resuspended in physiological washing buffer such as phosphate buffered saline, also known as PBS. Following another centrifugation step, cells are resuspended in annexin V binding buffer containing calcium, which is necessary for annexin binding to PS. Annexin V conjugated with FITC is then added to the solution, which is incubated at room temperature in the dark to allow annexin and PS association. In the next step, PI is directly added to the annexin staining cell solution and incubated in the dark. After incubation, cells are washed in PBS by centrifugation, resuspended in washing buffer, and kept on ice. Now they are ready for analysis.

Fluorescence activity of cells is analyzed by flow cytometry, a laser-based technique that captures fluorescence data from single cells suspended in a stream of fluid. After fluorescence calibration using cells separately stained with each dye, data from dual stained cells are acquired. Fluorescence signals from the cell population are used to create a plot where annexin-bound FITC intensity is plotted on the logarithmic X-axis, and PI on the logarithmic Y-axis. Cells that are annexin-FITC positive and PI negative will cluster on the lower right side of the plot, representing the early apoptotic cells, and cells double positive for annexin-FITC and PI will occur on the upper right, representing the late apoptotic or necrotic cells. The cells that remain unstained or insignificantly stained for both annexin and PI are live cells.

Since you now know why cell biologists rely on this technique to study cell death, why don’t we review some of its applications.

Using this procedure, scientists can follow which intracellular proteins are involved in apoptosis. In this video, researchers analyzed the effect of cisplatin, an anti-cancer drug, on normal kidney cells to see if it induces apoptosis. One set of cells was transduced to overexpress an active form of the enzyme protein kinase C, or PKC, and the other set was transduced with a non-functional form—dominant negative PKC. Cells expressing PKC and treated with cisplatin underwent apoptosis over time, but cells expressing the inactive dominant negative PKC were resistant to apoptosis, indicating that the enzyme is a key player in the cisplatin-induced apoptosis pathway.

Researchers also use these stains to test the cytotoxic potential of specific T cells. Cytotoxic T cells can recognize specific membrane proteins on its target cell, and induce its death upon binding to it. Here, researchers incubated antigen-specific T cells with target tumor cells and annexin V, and then observed induction of tumor cell apoptosis by T cell engagement. Flow cytometry data revealed the percentage of target cell death in the presence and absence of cytotoxic T cells.

Lastly, scientists use this method to evaluate cell viability following gene delivery. In this case, researchers wanted to assess cell survival after nucleofection—a method that uses a combination of chemicals and an applied electric field to create transient pores in cellular and nuclear membranes, thereby facilitating gene delivery. By using annexin V plus a dye called 7-aminoactinomycin D or 7-AAD, which, similar to PI binds to DNA, they showed that nucleofection caused low cell death by either apoptosis or necrosis.

You’ve just watched JoVE’s video on annexin V and PI labeling. In this video, we briefly discussed the distinguishing features of apoptotic and necrotic cells, reviewed the principles behind this method, watched a generalized procedure for this commonly used technique, and previewed some applications. Given the importance of understanding how different cells die under different conditions, annexin V and PI labeling serves as an important tool for cell biologists interested in this phenomenon. As always, thanks for watching!

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