Question 1

Wie unterscheidet die Phosphatidylserin-Translokation apoptotische Zellen von nekrotischen Zellen?

Accepted Answer

Während der Apoptose aktivieren cytosolische Caspasen Scramblase, ein Enzym, das Phosphatidylserin (PS)-Reste von der inneren Zellmembran zur äußeren Oberfläche transloziert. Bei der Nekrose bleibt PS intern, aber die Membran reißt auf. Annexin V bindet externalisiertes PS in frühen apoptotischen Zellen, während Propidiumiodid nur eindringt, wenn die Membranen reißen, was es Forschern ermöglicht, zwischen diesen Todeswegen zu unterscheiden.

Question 2

Warum wird Propidiumiodid neben Annexin V in Zelltod-Assays verwendet?

Accepted Answer

Propidiumiodid (PI) ist ein membran-undurchlässiger DNA-bindender Farbstoff, der nur dann in die Zellen gelangt, wenn Membranen reißen. Da Annexin V allein keine Unterscheidung zwischen früher Apoptose und später Apoptose oder Nekrose treffen kann, bietet PI eine wichtige Differenzierung. Zellen, die positiv auf Annexin V, aber negativ auf PI sind, deuten auf frühe Apoptose hin, während doppelpositive Zellen späte apoptotische oder nekrotische Zellen darstellen.

Question 3

Was sind die wichtigsten Schritte bei der Vorbereitung von Zellen für die Annexin-V- und Propidiumiodid-Färbung?

Accepted Answer

Zellen werden geerntet und bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, dann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in Annexin-V-Bindungspuffer mit Calcium resuspendiert, das für die Annexin-Bindung an Phosphatidylserin notwendig ist. Annexin V, konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC), wird hinzugefügt und im Dunkeln inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Propidiumiodid und einer weiteren Dunkelinkubation.

Question 4

Wie interpretiert die Durchflusszytometrie Anexin-V- und Propidiumiodid-Färbungsmuster?

Accepted Answer

Durchflusszytometrie stellt die Annexin-FITC-Intensität auf der logarithmischen X-Achse und PI auf der Y-Achse dar. Zellen, die positiv auf Annexin-FITC, aber negativ auf PI sind, gruppieren sich im unteren rechten Quadranten und repräsentieren frühe apoptotische Zellen. Doppel-positive Zellen erscheinen im oberen rechten Quadranten und deuten auf späte apoptotische oder nekrotische Zellen hin. Ungefärbte oder unbedeutend gefärbte Zellen im unteren linken Quadranten repräsentieren lebende Zellen.

Question 5

Wie haben Forscher Annexin V und PI-Markierung verwendet, um Proteinkinase C bei der durch Cisplatin induzierten Apoptose zu untersuchen?

Accepted Answer

Forscher verglichen Nierenzellen, die aktive Proteinkinase C (PKC) überexprimierten, mit Zellen, die inaktive dominant-negative PKC exprimierten. Bei Behandlung mit Cisplatin unterzogen sich Zellen mit aktivem PKC im Laufe der Zeit der Apoptose, während Zellen mit dominant-negativer PKC der Apoptose widerstanden. Dies zeigte, dass PKC ein Schlüsselspieler im cisplatin-induzierten Apoptoseweg ist und wichtige Mechanismen von eine Einführung in den Zelltod aufdeckt.

Question 6

Was zeigen Anexin-V- und PI-Färbungen über die Funktion von zytotoxischen T-Zellen?

Accepted Answer

Forscher inkubieren antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen mit Ziel-Tumorzellen in Gegenwart von Annexin V und PI. Durchflusszytometrie-Daten zeigen den Prozentsatz des durch T-Zell-Bindung induzierten Zielzelltodes. Diese Methode zeigt, wie zytotoxische T-Zellen spezifische Membranproteine auf Zielzellen erkennen und nach der Bindung eine Apoptose induzieren.

Question 7

Wie wird die Anexin-V- und PI-Färbung verwendet, um die Zelllebensfähigkeit nach der Nukleofektion zu bewerten?

Accepted Answer

Nucleofection verwendet Chemikalien und elektrische Felder, um vorübergehende Poren in Zellmembranen für die Genübertragung zu erzeugen. Forscher nutzen Annexin V plus 7-Aminoactinomycin D (7-AAD), einen DNA-bindenden Farbstoff ähnlich wie PI, um das Zellüberleben nach der Nucleofection zu bewerten. Dieser Färbeansatz quantifiziert den Zelltod durch Apoptose oder Nekrose und zeigt die Auswirkungen der Nucleofection auf die Zelllebensfähigkeit.

Färbung mit Annexin V und Propidiumjodid - Bewertungsquiz