Name: Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Kopienzahlbestimmung in Serum und Plasma mittels Real-Time PCR zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei kastrationsresistentem Prostatakarzinom. Diese Methode ermöglicht schnelle und sensitive Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chiara Molinari und Filippo Martignano danken wir für die Unterstützung bei der Datenanalyse.

Das Protokoll besteht aus der Isolierung der DNA aus Serum oder Plasma-Proben, Real-Time PCR für Kopie Zahlenanalyse durchzuführen. DNA-Extraktion, DNA-Menge Kontrolle (Spektralphotometer) und Real-Time PCR für spezifische Ziele wurden durchgeführt. In Abbildung 1eine Zusammenfassung der Verfahren und der Zeitleiste werden gemeldet.
Das Protokoll folgt den Richtlinien des menschlichen Forschungsethikkommission IRST.
(1) Serum Erhebung und Verarbeitung
<ol>
	<li>Sammeln Sie etwa 5 mL Vollblut in einem Serum Röhrchen ohne Antikoagulans, Serum zu erhalten. Pflegen Sie Blut Rohre bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.</li>
	<li>Zentrifuge Rohre bei 1.000 x g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie in 2 mL Röhrchen Serum sorgfältig.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Sammelrohr und sofort einfrieren des Überstands bei-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
</ol>
(2) Plasma Erhebung und Verarbeitung
<ol>
	<li>Sammeln Sie etwa 10 mL Vollblut in einer Plasma-Röhre mit EDTA Plasma zu erhalten. Die Röhrchen vollständig füllen und es dann 8 Mal zu invertieren. Pflegen Sie Blut Rohre bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.800 x g für 15 min bei Raumtemperatur mit keine Einstellung "Bremse" auf der Zentrifuge.</li>
	<li>Übertragen Sie den oberen Teil des Plasmas in 2 mL Röhrchen vorsichtig. Wiederholen Sie die Übertragung, mindestens 1 mL des Überstands oberhalb der weißen Blutkörperchen-Ebene zu verlassen. Hinweis: Übertragung den oberen Teil des Überstands reduziert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zellenrückstand.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Sammelrohr und sofort einfrieren des Überstands bei-80 ° C bis zur Verwendung.</li>
</ol>
3. DNA-Isolierung aus Serum oder Plasma
Hinweis: Isolierung der DNA aus Serum oder Plasma sollte mit dem kommerziellen Protokoll geändert in den folgenden Schritten durchgeführt werden.
<ol>
	<li>Tauen Sie eine aliquote (mit 0,5 bis 2 mL) von Serum oder Plasma bei Raumtemperatur auf.</li>
	<li>Wirbel und mischen die Probe und 0,5 mL Serum oder Plasma in ein klares 1,5 mL Röhrchen zu übertragen. Den Rest des Materials bei-80 ° c eingefroren</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Proteinase k (20 mg/mL) direkt auf die Probe.</li>
	<li>Das Beispiel 0,5 mL Lyse Puffer hinzu und mischen Sie gut durch pipettieren.</li>
	<li>Schließen Sie die Rohre und inkubieren Sie Proben bei 56 ° C für 15 min in den Heizblock.</li>
	<li>Fügen Sie den angegebenen Betrag von 100 % Ethanol in Waschpuffer 1 und 2, gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und geben Sie 0,5 mL absolutes Ethanol zu und mischen Sie gut durch pipettieren.</li>
	<li>Fügen Sie 650 µL der in Schritt 3.7 der Trennsäule und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min erhaltenen Mischung hinzu.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und legen Sie die Spalte auf eine neue saubere Sammelröhrchen. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 1, ohne den Rand der Spalte und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min Benetzung.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und ersetzen Sie ihn durch einen neuen sauberen Sammelröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Waschpuffer 2, ohne den Rand der Spalte und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 3 min Benetzung.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Röhrchen mit der Durchströmung und ersetzen Sie ihn durch einen neuen sauberen Sammelröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie auf Hochtouren (20.000 x g) für 3 min um jede verbleibende waschen-Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Spalte in eine saubere 1,5 mL-Tube. Fügen Sie 150 µL Elution Buffer und warten Sie 7 min um sicherzustellen, dass die Puffer die Spalte benetzt.</li>
	<li>8.000 x g für 1 min zentrifugieren.</li>
	<li>Pipette Elute von 3.16 Schritt wieder in der gleichen Spalte und Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit (20.000 x g) für 1 min um maximale Erholung von DNA zu gewährleisten.</li>
</ol>
4. DNA-Quantifizierung und Verdünnung
<ol>
	<li>Durchführen Sie Quantifizierung der DNA mit einem Spektralphotometer. Verwenden Sie 2 µL Probe auf einem Benchtop-Spektralphotometer gemäß den Herstellerangaben. Hinweis: Wenn die DNA-Menge mit Real-Time PCR Verfahren nicht ausreicht (mindestens 120 ng), führen Sie einen neuen DNA-Isolierung Prozess.</li>
	<li>Verdünnen Sie DNA aus Serum oder Plasma zu 2,5 ng/µL in einem Endvolumen ausreichend für alle Echtzeit-PCR (ca. 50 µL).</li>
</ol>
(5) Real-Time PCR
<ol>
	<li>Tauen Sie Exemplar Nummer Assays, Referenz-gen-Test, DNA verdünnt Proben und Kalibratoren gebündelt im Eis auf. Equilibrate bei Raumtemperatur den master-Mix, der bei 4 ° c gelagert ist</li>
	<li>Bereiten Sie eine Mischung von 1 µL des Ziel-Assay, 1 µL des Referenz-Gen-Tests und 10 µL des master-Mix für 3 Wiederholungen für jede Probe und Kalibratoren gebündelt. Bereiten Sie die Mischung unter anderem eine Negativkontrolle (Wasser) und 2 zusätzliche Proben.</li>
	<li>In einem 96 well-Platte, aliquoten 12 µL des Mixes in jede Vertiefung. Tun Sie nicht Pipette oder Spin Röhren.</li>
	<li>Fügen Sie 8 µL (Konzentration von 2,5 ng/µL) der einzelnen DNA-Probe und Kalibratoren gebündelt in jede Vertiefung. Tun Sie nicht Pipette oder Spin Röhren. Die Tipp für jede Vertiefung zu ändern. Hinweis: 30 DNA-Proben können verarbeitet werden, für jede Echtzeit-Experiment mit der 96-Well-Platte: 30 x 3 Proben + 1 x 3-Kalibratoren gepoolten + negative Kontrolle = 94.</li>
	<li>Kurz spin-down der Platte bei 1.000 x g.</li>
	<li>Führen Sie die Platte über das folgende Protokoll: halten Bühne bei 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min.</li>
</ol>
6. Daten-Analyse und Interpretation
<ol>
	<li>Setzen Sie im Abschnitt "Option", unterhalb der Verstärkung Plot Ergebnisse den Ct-Schwellenwert bei 0,2 für das erste Zielgen analysiert. Wiederholen Sie den Satz für jedes Ziel oder Referenz-Gene. Wenn die Echtzeit-PCR-Datei in Erweiterung .txt exportieren möchten, drücken Sie "Export" in Symbolleiste. Markieren Sie nur "Ergebnisse" in der SELECT-Anweisung Daten → exportieren wählen Sie als Dateityp der Erweiterung .txt → Presse "Export starten" → schließen das Export-Tool.</li>
	<li>Öffnen Sie die Analysesoftware und importieren Sie die Datei .txt (Symbolleiste → Import).</li>
	<li>Wählen Sie den Namen der Datei zu analysieren und wählen die Analyse-Einstellung durch die Toolbar (Play-Symbol).</li>
	<li>Geben Sie der Kalibrator Probe und die bekannte Anzahl der Kopien des Ziels (z. B. 1 Kopie für AR -gen). Klicken Sie auf "anwenden".</li>
	<li>Lassen Sie für jede Probe einen Brunnen mit verschiedenen Delta Ct (ΔCt) im Vergleich zu anderen Brunnen.</li>
	<li>Das Experiment (Press Play-Symbol) zu diagnostizieren.</li>
	<li>Werten Sie die Ergebnisse durch die Kopienzahl bar Plot oder die Tabelle. Hinweis: Die Ergebnistabelle enthält zahlreiche Parameter wie Vertrauen, Z-Score und Wiederholungen analysiert, die für die Interpretation der Ergebnisse nützlich sein könnte.</li>
</ol>

<ol><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer%3A+current+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li>
<li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li>
<li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer%3A+a+multi-institution+correlative+biomarker+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li>
<li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer%3A+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li>
<li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples%3A+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li>
<li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

AR CN-Analyse in Serum und Plasma Probe stellt eine neue, nicht-invasive Ansatz für die Stratifizierung von Patienten mit Kastration resistenten Prostatakrebs (CRPC). Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass AR CN Ergebnisse in CRPC Patienten mit Abiraterone und Enzalutamid, vor und nach der Chemotherapie7,8,9,10vorhersagen kann.
Der Hauptvorteil unsere...

Zirkulierenden Zelle freie DNA (Blut) im Blut nachgewiesen wurde eine optimale Quelle für Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Prognose der Behandlung Widerstand1,2. Viele Studien zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen DNA-Veränderungen (Mutationen, Kopie Nummer Variationen, epigenetische Veränderungen im Gewebe) und denen in entsprechenden Plasma Proben1, bestätigt, dass im Umlauf Tumor-DNA (CtDNA) informativ für Primär- und metastasiertem Tumor Gewebe Veränderungen3. Die Möglichkeit des Studiums CtDNA ermöglicht somit für den Wiederaufbau der genomic Rearrangements und Kopie Nummer Variationen (CNV) bei bestimmten Onkogene4Identifizierung potentiell metastasierendem klonale und subclonal Zellen. CtDNA hat sich gezeigt, zu klinisch nützlich vor allem für Krebs Behandlung überwachen, wie es bestimmte Mutationen und CNV, bezogen auf spezifische gezielte Therapien5,6birgt. Es überwindet die Notwendigkeit Gewebebiopsien und kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten während einer bestimmten Krebs-Behandlung in einer nicht-invasive Weise erzielten Ergebnisse.
In Bezug auf Prostata-Krebs, eine signifikante Korrelation zwischen zirkulierenden zellfreie Androgen Rezeptor (AR) CNV und Behandlung Antwort auf Abiraterone und Enzalutamid ist gezeigt worden, Anzeige AR gen Kopienzahl (CN) im Blut kann ein vielversprechender Biomarker zur Vorhersage Behandlung Widerstand7,8,9,10,11. CNV bestimmter Gene in CtDNA mit verschiedenen Vorgehensweisen mit unterschiedlicher Empfindlichkeit, Kosten und Geschwindigkeit ausgewertet werden können (zB. in Echtzeit, digitale PCR und Next Generation Sequencing).
Hier beschreiben wir einen einfachen und schnellen Ansatz, basierend auf duplex-Assays in Echtzeit-PCR-Technologie für die Bewertung der AR CN in Blut, Serum und Plasma Proben7,8. Wir hielten zwei verschiedenen PCR-Assays entwickelt, auf zwei verschiedenen genomischen Regionen in Intron 5 AR (Xq12) und zwei andere Gene als interner standard Referenz Gene bekannt, um eine normale Nummer Kopierstatus bei Prostatakrebs (RNaseP, haben Das Hotel liegt auf 14q11; Vor1, befindet sich auf 1 s. 34). Wir haben zwei Referenz-Gene, anstatt ein, um die Präzision und Sensitivität der Ergebnisse zu erhöhen. Ein DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination (kombinierte Assay für AR-assay_1 + RNaseP und AR-assay_2 + AGO1) verstärkt. Drei Serum oder Plasma DNA-Proben von gesunden Männern wurden gebündelt und als ein Kalibrator verwendet. Wir hielten Abschaltungen von &#62; 1,5 für AR Gewinn und &#60; 0,5 für die Löschung. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Methode ist, dass es flexibel ist und dass auch andere Gene ausgewertet werden können, die internen Standardwerk Gene auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften ändern.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Serum Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>Vollblutröhrchen für Serum</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>Vollblutröhrchen für Plasma</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td></td><td>der Benutzer könnte auch andere Unternehmen</td></tr><tr><td>verwenden TaqMan Copy Number Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>Vorgefertigte und validierte Assays mit FAM-Farbstoff. Wir haben den folgenden Assay verwendet: AR_assay1: hs04107225 und AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Assay (modifiziert)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>Vorgefertigter Assay, modifiziert mit VIC-Farbstoff: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master</td><td>Mix Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Mastermix für Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA-Extraktionskit</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well Platten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>Platten für reale PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific-der</td><td></td> <td>Benutzer kann auch andere spektrophotometrische Methoden zur Quantifizierung von DNA</td></tr><tr><td>verwenden 7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System</td><td>Angewandtes Biosystem</td> <td>-</td> <td>Der Benutzer kann auch andere Echtzeit-Instrumenten-CopyCaller-Software verwenden</td></tr><tr><td></td><td>Angewandte Biosystem-Software</td><td></td> <td>für die Analyse der Kopienzahl</td></tr></tbody></table>

serum und plasma kopie nummer erkennung mittels real-time pcr

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum und Plasma Zelle freie DNA (Blut) wurde als informativen, nicht-invasive Quelle Biomarker für Krebs-Diagnose, Prognose, Überwachung und Vorhersage von Therapieresistenz gezeigt. Ausgehend von der Hypothese, dass die Androgen-Rezeptor (AR) gen Kopienzahl (CN) zu gewinnen ist ein häufiges Ereignis bei metastasiertem Kastration Widerstand Prostatakrebs (mCRPC), schlagen wir vor, dieses Ereignis im Blut als potenzielle prädiktive Biomarker zu analysieren.
Wir evaluierten AR CN im Blut mit 2 verschiedenen Echtzeit-PCR-Assays und 2 Referenz-Gene (RNaseP und AGO1). DNA-Menge von 60 ng wurde für jedes Assay-Kombination verwendet. AR CN Gewinn wurde mit digitalen PCR als eine genauere Methode bestätigt. CN Variation Analyse bereits nachgewiesen, dass für die Vorhersage von Therapieresistenz in der Umgebung des mCRPC informativ sein, aber es könnte nützlich sein, auch für andere Zwecke in verschiedenen Patienten. CN-Analyse auf Blut hat mehrere Vorteile: Es ist nicht-invasiv, schnell und einfach durchzuführen, und es beginnt mit einem kleinen Volumen von Serum oder Plasma Material.

Insgesamt Blut Konzentration wurde durch Spektralphotometrie für alle Proben analysiert, mit einem Median von 6,12 ng/µL quantifizierbare (Bereich: 2,00-23,71 ng/µL) für Serumproben und einem Median von 3,21 ng/µL (Bereich: 2,31-8,49 ng/µL) für Plasma-Proben. Wir haben insgesamt 115 Proben von Real-Time PCR Experimente analysiert.
Testsensitivität wurde bewertet mit gemischten Serum DNA von Patienten mit hohen oder niedrigen Gew...

Dieses Manuskript beschreibt die Kopie Variation Zahlenanalyse in Serum oder Plasma DNA mit Echtzeit-PCR-Ansatz durchgeführt. Diese Methode eignet sich für die Vorhersage von Resistenzen in Kastration resistenten Prostatakrebs-Patienten, aber es könnte auch für andere Krankheiten informativ sein.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Variation der Genkopienzahl in Serum- oder Plasmaproben zu detektieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms zu beantworten, wie z. B. den Nachweis von Markern, die zur Vorhersage oder Überwachung der Sporenreduktion nützlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach und schnell durchzuführen ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von fortgeschrittenem Prostatakrebs, da die Variation der Kopienzahl der Androgenrezeptoren ein häufiges Ereignis ist. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Konzentration und die Qualität der zellfreien DNA oft niedriger ist als erwartet. Für die Serumentnahme gehen Sie von fünf Millilitern Vollblut und Serum ohne Antikoagulanzien heran, die bei vier Grad Celsius gehalten werden.Beginnen Sie damit, die Proben 15 Minuten lang bei 1.000 g zu zentrifugieren.Der Überstand ist das Serum. Füllen Sie es in Zwei-Milliliter-Röhrchen um und entsorgen Sie das Pellet. Wenn das Serum nicht sofort verarbeitet wird, frieren Sie die Proben bei 80 ein.

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Hier beschreiben wir eine Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Exzisionskreisen (TRECs) und K-löschenden Rekombinations-Exzisionskreisen (KRECs). Der TREC/KREC-Assay kann als Marker für die Thymus- und Knochenmarkausscheidung verwendet werden.

Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

Das Manuskript beschreibt einen Chip-basierte digitale PCR-Assay zu erkennen, eine seltene CDH1 Transkript Variante (CDH1a) in Tiefkühlfrische normalen und Tumorgewebe von Patienten mit Magenkrebs erhalten.

Erkennung einer CDH1 selten Transkript Variante in Tiefkühlfrische Magenkrebs Geweben durch Chip-basierte digitale PCR

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Zytotoxizität von pre-activated CD8 untersuchen+ T-Zellen gegen Krebszellen durch das Erkennen von apoptotischen Krebs Zellen über Echtzeit-Mikroskopie. Dieses Protokoll kann Mechanismen hinter myeloische Zellen-induzierte T-Zell-Unterdrückung untersuchen und zu bewerten Verbindungen auffüllen T Zellen durch Blockade von Immunzellen suppressive myeloische abzielen.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Erfahren Sie die Kopienzahlbestimmung in Serum und Plasma mittels Real-Time PCR zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei kastrationsresistentem Prostatakarzinom. Diese Methode ermöglicht schnelle und sensitive Analysen.

Serum und Plasma Kopie Nummer Erkennung mittels Real-Time PCR

Weitere Videos entdecken