Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem Drosophila -Modell der Neurodegeneration
12. September 2017
Dieses schrittweise Protokoll analysiert Drosophila negative Geotaxis Verhalten mit einem automatisierten Multi-Zylinder-System, das beherbergt hunderte von fliegen und synchronisiert ihre Aktion durch einen Elektromotor. Bei der Synchronisation ist fliegen negative Geotaxis Verhalten untersucht, digital erfasst und analysiert mit Hilfe der selbst entworfenen RflyDetection-Software.
Das übergeordnete Ziel dieses automatisierten, schnellen iterativen negativen Geotaxis-Assays besteht darin, Kletterdefizite von Drosophila-Adulten, die mit Neurodegeneration assoziiert sind, zu analysieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie zum Beispiel den Mechanismus der lokomotorischen Defizite, die mit der Neurodegeneration assoziiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kletteraktivität der Fliegen auf eine automatisierte und professionell hochwertige Weise analysiert werden kann.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose der Neurodegeneration, da neurodegenerative Krankheiten häufig mit einem fortschreitenden Verlust der Bewegungsfähigkeit und einer verkürzten Lebensdauer sowie einer altersabhängigen Neurodegeneration assoziiert sind. Wir hatten zuerst die Idee für diese Methode. Wir wollten die lokomotorische Aktivität von Drosophila-Adulten genauer messen.
Um die Fliegensammlung durchzuführen, beginnen Sie damit, die Fliegen bei 25 Grad Celsius, 70% Luftfeuchtigkeit und einem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit auf Standard-Fliegenfutter zu halten. Sammeln Sie UAS-Dicer2 DDC-GAL4 Fliegenjungfern unter Kohlendioxid-Narkose. Kreuzen Sie die Jungfern mit zwei Tage alten männlichen Adulten, die die folgenden Genotypen tragen, mit einem Männchen/Weibchen-Verhältnis von eins zu zwei.
Sammeln Sie getrennt die frisch geschlüpften Männchen und Weibchen in drei Röhrchen für jede Gruppe pro Experiment, wobei Sie 10 Fliegen in jedes reguläre Fliegenröhrchen mit Standardfutter geben. Stellen Sie dann die Röhrchen auf 25 Grad Celsius. Um den automatisierten RING-Assay durchzuführen, übertragen Sie 10 gesammelte Unisex-Fliegen pro Genotyp in jedes Röhrchen.
Sichern Sie dann das Röhrchen mit einer Schraube. Analysieren Sie Kontrollfliegen und Fliegen mit verschiedenen Genotypen zusammen für jede Reihe von Experimenten. Schalten Sie die digitale Kamera ein, die vor dem Apparat platziert ist, und beginnen Sie mit der Aufnahme, sobald die Fliegen geladen und bereit sind.
Die Kamera sollte horizontal platziert und der Abstand zur RING-Apparatur sollte angemessen sein, um die Positionen aller Fliegen an relativ genauen Stellen zu erfassen. Nachdem Sie den Fliegen eine Minute Zeit gegeben haben, sich in den Röhrchen zu setzen, schalten Sie den Schrittcontroller ein, der den Schrittantrieb steuert. Dies treibt den kleinen Elektromotor an, um den angeschlossenen Hebel zu steuern, sodass er viermal hintereinander in zwei Sekunden das Apparat anhebt und antippt.
Beachten Sie nach dem Antippen des Apparats, dass die Fliegen beginnen, die Wand hochzuklettern. Bei eingeschalteter Aufnahme wiederholen Sie die Synchronisation, wie gerade demonstriert, in 60-Sekunden-Intervallen für drei bis fünf aufeinanderfolgende Versuche. Wiederholen Sie das Experiment für fünf, 15, 25 und 35 Tage alte Fliegen.
Führen Sie für jede Gruppe mindestens drei unabhängige Experimente für jedes Experiment durch, mit mindestens 30 gesammelten Fliegen oder drei Röhrchen. Um die Daten zu analysieren, importieren Sie das aufgenommene Video in den Computer. Für jeden Versuch machen Sie einen Schnappschuss des Videos sechs Sekunden nach dem Antippen.
Verwenden Sie im R-fly-Erkennungssoftware die Datei-Menü-Option, um das Schnappschuss-Bild zu importieren. Verwenden Sie dann das Baseline-Symbol auf der Symbolleiste, um die oberen und unteren Baselines des Röhrchens genau festzulegen, und markieren Sie dann mit dem Cursor die oberen und unteren Baselines im Bild. Geben Sie in der Einstellungsleiste im Feld "Fliegen im Rechteck" die Anzahl der Fliegen pro Röhrchen ein und im Feld "Röhrchenhöhe" die Länge des Röhrchens.
Individuelle Fliegenpositionen werden für jedes Röhrchen mit Punkten auf dem Bildschirm erkannt und gekennzeichnet. Beachten Sie, dass die Software automatisch in einer Tabelle auf der rechten Seite die Kletterstrecke für jede Fliege bestimmt und die Durchschnittswerte von 10 Fliegen in jedem Röhrchen anzeigt. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert plus oder minus SEM.
Berechnen Sie die P-Werte der Signifikanz mit einer Einfaktor-ANOVA mit einem Bonferroni-Multiple-Comparison-Test. Die Analyse der Dicer2-Fliegen unter Verwendung des automatisierten RING-Assays, der in diesem Video vorgestellt wird, zeigte eine altersabhängige Abnahme der Kletterstrecke in einem Sechs-Sekunden-Zeitrahmen für sowohl männliche als auch weibliche Fliegen, was darauf hindeutet, dass die aux-Expression in dopaminergen oder DA-Neuronen entscheidend für die Lokomotoraktivität der Fliegen ist. Die Kletterfähigkeit scheint bei der Überexpression von auxGFP in DA-Neuronen und der Koexpression von auxR und auxGFP in DA-Neuronen, die vom RNAi-Phänotyp gerettet werden, nicht beeinflusst zu sein.
Sobald die Technik gemeistert wurde, kann dies in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig gemacht wird. Dieses Verfahren ist nun eine Möglichkeit für Forscher im Bereich der Neurowissenschaften, die Neurodegeneration in Drosophila melanogaster zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem elektrischen RING-Apparat extrem gefährlich sein kann und jeder Behälter sollte fest und sorgfältig überprüft werden, bevor Sie dieses Verfahren durchführen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine automatisierte Methode zur Analyse des negativen Geotaxisverhaltens von Drosophila unter besonderer Berücksichtigung von Kletterdefiziten bei erwachsenen Fliegen, die mit Neurodegeneration in Verbindung stehen. Die Technik nutzt ein Mehrzylindersystem, um die Bewegungen der Fliegen zu synchronisieren und aufzuzeichnen, und liefert so Erkenntnisse über motorische Defizite.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensanalyse
- Neurodegeneration
Hintergrund
- Drosophila dient als Modellorganismus zur Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen.
- Das negative Geotaxisverhalten ist ein Maß für die Bewegungsfähigkeit von Fliegen.
- Neurodegeneration führt häufig zu einem fortschreitenden Verlust der Bewegungsfähigkeit und der Lebensdauer.
- Automatisierte Systeme verbessern die Genauigkeit von Verhaltensanalysen.
Zweck der Studie
- Untersuchung von Kletterdefiziten bei Drosophila im Zusammenhang mit Neurodegeneration.
- Erkundung der Mechanismen, die lokomotorischen Defiziten zugrunde liegen.
- Verbesserung der Messgenauigkeit der lokomotorischen Aktivität von Fliegen.
Verwendete Methoden
- Automatisiertes Multizylindersystem zur synchronisierten Flugbewegung von Fliegen.
- Digitalaufzeichnung des negativen Geotaxisverhaltens.
- Analyse mit selbstentwickelter RflyDetection-Software.
- Schneller iterativer Assay zur Datenerhebung mit hohem Durchsatz.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Synchronisierung der Flugbewegungen für eine genaue Analyse.
- Identifizierung von Kletterdefiziten, die mit Neurodegeneration verbunden sind.
- Die automatisierte Analyse erwies sich als effizient und zuverlässig.
- Mögliche Implikationen für die Therapie und Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Der automatisierte Test bietet eine robuste Methode zur Untersuchung des lokomotorischen Verhaltens bei Drosophila.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten therapeutische Ansätze bei Neurodegeneration beeinflussen.
- Diese Technik verbessert das Verständnis des Zusammenhangs zwischen Bewegung und neurodegenerativen Erkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser automatisierte Hochdurchsatz-Assay ermöglicht eine schnelle Quantifizierung von Bewegungsdefiziten in Drosophila-Modellen der Neurodegeneration und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien, indem er objektive und reproduzierbare Verhaltensauslesungen bereitstellt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der präklinischen Bildschirmierung, da gleichzeitig Hunderte von Fliegen verschiedener Genotypen und Altersgruppen analysiert werden können, was eine effiziente Bewertung von Wirkstoffen oder genetischen Modifikatoren erleichtert. Die Integration in Entdeckungsworkflows unterstützt die mechanistische Entschärfung neurodegenerativer Zielstrukturen durch standardisierte und skalierbare Phänotypisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung altersabhängiger Kletterdefizite, die mit Neurodegeneration in genetischen Modellen assoziiert sind.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch hochdurchsatzfähige Messung der Lokomotorik als Proxy für neuronale Integrität.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt quantitative Verhaltensdaten, die die Portfolio-Priorisierung unterstützen, indem Genotypen mit signifikanter motorischer Beeinträchtigung identifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Negativ-Geotaxis-Metriken, die für die Assay-Validierung in auf Neurodegeneration ausgerichteten Screening-Kampagnen geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die schnelle Untersuchung genetischer oder pharmakologischer Modulatoren mittels automatisierter Videoaufnahme und Analyse durch die Software RflyDetection.
- Skalierbarkeit: Verarbeitet Daten von mehreren hundert Fliegen pro Durchlauf, erhöht somit die Durchsatzkapazität und verringert die Variabilität im Vergleich zu manuellen Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Beurteilung von Lokomotionsphänotypen, die klinischen Bewegungsstörungen bei neurodegenerativen Erkrankungen entsprechen.
- Präklinische Kontinuität: Ermöglicht die longitudinale Beurteilung über verschiedene Fliegenalter (5, 15, 25, 35 Tage) hinweg, um eine fortschreitende Neurodegeneration zu modellieren.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Bewertung genetischer Rettungsexperimente (z. B. Ko-Expression von auxR/auxGFP), um die Zielgenauigkeit und Beteiligung von Signalwegen zu validieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und bietet einen quantitativen Verhaltensendpunkt, der genetische Modifikationen und phänotypische Ergebnisse in Modellen der Neurodegeneration verbindet.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Genexpression (z. B. aux in dopaminergen Neuronen) über wiederholte Messungen der negativen Geotaxis mit der motorischen Funktion verknüpft.
- Screening: Liefert standardisierte, einsatzbereite Messergebnisse (Kletterstrecke innerhalb von 6 Sekunden), die einen zuverlässigen Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt Mittelwerte mit Standardfehler des Mittels (± SEM) und statistischer Aussagekraft (einfaktorielle ANOVA, Bonferroni-Korrektur), um Vergleiche zwischen Gruppen und Signifikanztests zu unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet Verhaltensparameter mit neurodegenerativen Mechanismen und ermöglicht so eine phänotypische Bewertung, die auf Biomarkern basiert, in präklinischen Modellen.
- Unternehmenstechnische Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für langfristige Verhaltensscreenings über mehrere Genotypen, Altersgruppen und Behandlungsgruppen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unschärfen durch quantifizierbare, hochauflösende Verhaltensphänotypisierung verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch automatische Synchronisation, digitale Aufzeichnung und softwarebasierte Analyse.
- Strategischer Wert: Steigert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine schnelle Beurteilung von motorischen Defiziten anhand großer Stichproben ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen auf Grundlage robuster, altersabhängiger phänotypischer Verlaufsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, der Pflege genetischer Kreuzungen und der Einrichtung von Verhaltensassays.
- Benötigt spezialisierte Geräte, darunter die automatisierte RING-Vorrichtung, einen Schrittzähler, eine digitale Kamera und geeignete Beleuchtung.
- Setzt eine rechnergestützte Infrastruktur für den Import von Videos, die Extraktion von Einzelbildern und den Betrieb der RflyDetection-Software voraus.
- Beinhaltet die Standardisierung der Umweltbedingungen (25°C, 70 % Luftfeuchtigkeit, 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus) sowie der Reagenzglaskochprotokolle.
- Schließt Sicherheitsaspekte aufgrund elektrischer Komponenten ein; die Vorrichtung muss vor dem Betrieb gesichert und überprüft werden.
