Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, vollständig humane monoklonale Antikörper gegen ein gewünschtes Antigen herzustellen, ausgehend von humanen B-Lymphozyten, die im Blut zirkulieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die zwischen hochverwandten Antigenen unterscheiden können. Für einige Anwendungen, wie z. B. die Immuntherapie, kann ein präzises Targeting eines Antigens unerlässlich sein.

Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie ausgehend vom Blut gesunder oder immunisierter Spender durchgeführt werden kann und die Isolierung auch seltener antigenbindender B-Zellen ermöglicht. Während diese Methode ausgehend von menschlichen Proben beschrieben wird, kann sie auch auf Tiere angewendet werden, die vorimmunisiert werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Verfahren tatsächlich einer recht komplexen multiplen analytischen Gating-Strategie von diskriminierten B-Lymphozyten unterliegt.

Der Eingriff wird von Melinda durchgeführt. Sie ist Assistenzingenieurin in unserem Labor. Zuerst werden 35 Milliliter verdünnte Zellsuspension auf 15 Milliliter Dichtegradient in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen pipettiert.

Legen Sie dann das konische Rohr bei ausgeschalteten Bremsen in einen Ausschwingrotor und zentrifugieren Sie es 25 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1290-facher Schwerkraft. Anschließend wird an der Grenzfläche zwischen dem Dichtegradientenmedium und der Plasmaschicht die mononukleäre Zellschicht vorsichtig abgesaugt und in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 460-facher Schwerkraft.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 2 % fötalem Rinderserum. Konjugierte Tetramere werden bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zugegeben. Gut mischen und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Laminar-Flow-Haube vor Licht geschützt inkubieren.

Geben Sie dann 10 Milliliter eiskalten Zelltrennpuffer in die Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei der 460-fachen Schwerkraft. Zu dem erhaltenen Zellpellet werden 500 Mikroliter eiskalter Zelltrennpuffer und 50 Mikroliter zwei Varianten magnetischer Mikrokügelchen hinzugefügt und die Zellsuspension 20 Minuten lang inkubiert.

Als nächstes resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem Zelltrennpuffer. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig auf eine äquilibrierte Säule und lassen Sie sie vollständig abtropfen. Spülen Sie dann das Röhrchen mit drei Millilitern Zelltrennpuffer und übertragen Sie den Puffer in die Säule.

Nachdem Sie die Säule dreimal gespült haben, nehmen Sie sie vom Magneten und legen Sie sie auf ein konisches 25-Milliliter-Auffangrohr. Nachdem Sie fünf Milliliter eiskalten Trennpuffer auf die Säule gegeben haben, spülen Sie die Zellen mit Hilfe eines Kolbens schnell aus der Säule. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einem Cocktail aus Anti-Human-Antikörpern und 7AAD in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 2% fötalem Rinderserum.

Dann inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie als Nächstes ein Zellsortierer-Zytometer, um spezifische B-Zellen auf Einzelzellebene zu sortieren, die 1.000 Ereignisse pro Sekunde nicht überschreiten dürfen. Sammeln Sie dann die einzelnen sortierten B-Zellen in 8-Streifen-PCR-Röhrchen, die zuvor mit 10 Mikrolitern 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 10 Einheiten RNAse Inhibitor gefüllt waren, und legen Sie sie auf ein Gestell für 96 Mikroröhrchen.

Frieren Sie die Röhrchen schnell bei minus 80 Grad Celsius ein. Erhitzen Sie die gefrorenen Proben fünf Minuten lang in einem trockenen Bad bei 70 Grad Celsius, um die Zellen zu lysieren. Legen Sie dann den Streifen auf Eis und beginnen Sie, den Reverse-Transkriptions-Mastermix zu bilden.

Sobald der Reverse-Transkriptions-Mastermix vorbereitet ist, weist das Programm den Thermocycler an. Führen Sie am Ende der reversen Transkription verschachtelte PCRs durch, um Immunglobulin-Gene zu amplifizieren. Identifizieren Sie die positiven Klone, indem Sie auf einem 1,5%igen Agarose-Gel die Migration eines 500-Basenpaar-PCR-Produkts für variable schwere Ketten- und kodierende Segmente und eines 350-Basenpaar-PCR-Produkts für variable Leichtketten-kodierende Segmente visualisieren.

Geben Sie einen Mikroliter des Klonierungsprodukts zu 45 Mikrolitern elektrokompetenten TOP10 E.coli-Zellen. Elektroporat. Dann schnell 500 Mikroliter 2X YT Medium zu den Zellen geben und in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Verteilen Sie die transformierten Bakterien auf einer 2X YT Ampicillinplatte.

Inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius. Richten Sie als Nächstes eine Reaktionsvormischung ein und geben Sie 25 Mikroliter davon in ein 8-Streifen-PCR-Röhrchen, das auf Eis gehalten wird. Verwenden Sie dann einen sterilen Zahnstocher, um Kolonien zu entnehmen, und streichen Sie die Kolonien auf die 2X YT-Ampicillinplatte.

Tauchen Sie dann die Zahnstocher in das PCR-Reaktionsröhrchen. Identifizieren Sie die positiven Klone, indem Sie auf einem 1,5%igen Agarosegel die Migration eines 850-Basenpaar-PCR-Produkts für den Schwerkettenvektor und eines 600-Basenpaar-PCR-Produkts für den Leichtkettenvektor visualisieren. In zwei Millilitern LB-Medium werden vier positive Kolonien inokuliert.

Inkubieren Sie das Impfen bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 200 Umdrehungen pro Minute Schütteln. Säen Sie einen Tag vor der Transfektion 15.000 humane embryonale Nierenzellen in 200 Mikrolitern Modifiziertem Eagle-Medium von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Dann wird die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Cotransfizieren Sie die Zellen mit einem linearen Transfektionsreagenz aus Polyethyleniminderivat. 0,5 Mikroliter DNA-Transfektionsreagenz mit 10 Mikrolitern 150 Millimolar Natriumchlorid verdünnen. Als nächstes verdünnen Sie 0,125 Mikrogramm jeder variablen schweren und leichten Kette exprimierenden Vektoren in 10 Mikrolitern 150 millimolar Natriumchlorid.

Alle Verdünnungen jeweils 10 Sekunden lang vortexen. Mischen Sie dann das zuvor verdünnte DNA-Transfektionsreagenz mit 10 Mikrolitern DNA-Lösung. Die DNA-Transfektionsmischung 15 Sekunden lang schnell vortexen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Geben Sie die DNA-Transfektionsmischung tropfenweise auf die Zellen und schwenken Sie dann die Platte vorsichtig. Tauschen Sie das Medium 16 Stunden nach der Transfektion aus und kultivieren Sie die Zellen fünf Tage lang in serumfreiem Medium bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um den Überstand abzusaugen, und übertragen Sie ihn in die 96-Well-Platte mit V-Boden.

Jede Vertiefung wird in einer 96-Well-ELISA-Platte mit dem relevanten Antigen bei vier Grad Celsius über Nacht in 100 Mikrolitern rekonstituiertem ELISA-Beschichtungspuffer bei einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter eingehalten. Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter eines transfizierten Zellüberstands in die Vertiefungen einer 96-Well-ELISA-Platte und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 100 Mikroliter Antihuman-Immunglobulin-G-Antikörper hinzu, der an das Meerrettichperoxidase-Enzym in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter konjugiert ist, und inkubieren Sie die Vertiefung eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Zum Schluss gibst du 50 Mikroliter chromogenes Substrat in die Vertiefung und inkubierst weitere 20 Minuten. Am Ende der Inkubation wird die optische Dichte bei 450 Nanometern auf einem Spektralphotometer abgelesen. Um die spezifischen B-Zellen zu isolieren, wurde eine Gating-Strategie verwendet, die die B-Zellen, die Rezeptoren exprimieren, gegen den HLA-A2/Pp65-Komplex unterscheidet.

Anfangs waren die Zellen CD19-positiv, CD3-negativ gated. Schließlich wurden die Zellen sowohl mit HLA-A2/Pp65PE als auch mit HLA-A2/Pp65APC, aber nicht mit HLA-A2/MelABV421-Tetrameren gefärbt, um die hochspezifischen B-Zellen zu erhalten. Mit dieser Gating-Strategie können selektive B-Zellen isoliert werden, die zwischen HLA-A2/Pp65 und anderen verwandten HLA-A2-Peptidkomplexen unterscheiden können.

Als nächstes wurde zur Untersuchung des Vorhandenseins von PC1.02-Antikörpern gegen HLA-A2/Pp65-Tetramer ein ELISA-Assay durchgeführt. Im erhaltenen Balkendiagramm entspricht die y-Achse den optimalen Dichtewerten und die x-Achse den HLA-A2-Peptiden. Aus dem Assay geht hervor, dass ein monoklonaler Antikörper an das HLA-A2/Pp65-Tetramer in Abhängigkeit vom Peptid- und Haupthistokompatibilitätskomplex bindet.

Als nächstes wurde die Oberflächenplasmin-Residenz verwendet, um die Bindungsaffinität des PC1.02-Antikörpers zu untersuchen. Anschließend wurden tabellarische Daten zur Analyse der HLA-A2/Pp65-spezifischen B-Zellen erhalten. Es wurde gezeigt, wie sich die Ausschlussstrategie unspezifischer B-Zellen, die Ausbeute der Immunglobulin-Genamplifikation und die Produktion monoklonaler Antikörper aus HLA-A2/Pp65-spezifischen B-Zellen auswirkt.

Einmal gemeistert, kann die Technik, die von der Isolierung antigenspezifischer B-Zellen aus menschlichem Blut bis zur Herstellung monoklonaler Antikörper reicht, in nur einem Monat durchgeführt werden. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens daran, ohne Pause direkt von der Sortierung der B-Zellen zur RT-PCR zu wechseln.