Name: Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Generierung diskriminierender humaner monoklonaler Antikörper aus zirkulierenden B-Lymphozyten für Immuntherapie-Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung seltener antigenspezifischer B-Zellen aus Blutproben.

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Wir danken der Zytometrie Anlage "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für kompetente technische Unterstützung. Wir danken auch das gesamte Personal der Produktion rekombinanter Proteine (P2R) und der Auswirkungen Plattformen (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für ihre technische Unterstützung. Wir danken Emmanuel Scotet und Richard Breathnach für konstruktive Kritik am Manuskript. Diese Arbeit wurde von der IHU-Cesti-Projekt gefördert durch die «Investissements Avenir» französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005) finanziell unterstützt. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Programms LabEX IGO unterstützt vom nationalen Institut über die Investition des zukünftigen Programms ANR-11-LABX-0016-01 realisiert.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das vorgeschlagene Protokoll ist eine leistungsfähige Methode für die Erzeugung von menschlichen mAbs direkt vom Ag-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden. Es vereint drei wichtige Aspekte: (i) die Verwendung von ein Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung, wodurch eine ex-Vivo -Isolierung auch seltene Ag-Bindung B-Zellen; (Ii) eine gating Strategie, die drei Ag-Tetramers (zwei relevante und irrelevante eins) beschriftet mit drei verschiedenen Fluorochromes verwendet, um durch Durchflusszytometrie, nu...

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The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die schnelle und vielseitige Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen eine gewünschte Antigen (Ag). mAbs sind unverzichtbare Werkzeuge in vielen Grundlagenforschung Anwendungen in Vitro und in Vivo: flow Cytometry, Histologie, Western-Blot und blockierende Experimente zum Beispiel. Darüber hinaus werden mAbs mehr und mehr in der Medizin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Transplantation Ablehnung1Steuern eingesetzt. Anti-CTLA-4 und Anti-PD-1 (oder Anti-PD-L1) mAbs dienten zum Beispiel kürzlich als immun Checkpoint-Hemmern bei Krebs-Behandlungen2.
Der erste mAbs stammen von Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Hybridome aus der Milz Zellen der immunisierten Mäusen oder Ratten gewonnen. Allerdings behindert die starke Immunantwort gegen Murine oder Ratte mAbs ihre therapeutische Anwendung beim Menschen, durch ihre schnelle Abfertigung und die wahrscheinlich Induktion von Überempfindlichkeit Reaktionen3. Um dieses Problem anzugehen, haben teilweise tierisches Eiweiß-Sequenzen von mAbs menschlich, so genannte Chimäre Maus-Mensch oder humanisierte Antikörper erzeugen abgelöst. Diese Strategie verringert sich jedoch nur teilweise Immunogenität, während deutlich erhöht, die Kosten und die Zeit-Skala der Produktion. Eine bessere Lösung besteht darin, menschliche mAbs direkt aus humanen B-Zellen zu generieren und mehrere Strategien hierfür zur Verfügung. Eine davon ist die Verwendung von Phagen oder Hefe Display. Dies umfasst Anzeigen Variable Domänen aus einer kombinatorischen Bibliothek von zufälligen menschlichen Ig schwere und Licht Ketten auf Phagen oder Hefen und Durchführung einer Auswahlschritt mit den spezifischen Antigen des Interesses. Ein großer Nachteil dieser Strategie ist, dass schwere und leichte Kette nach dem Zufallsprinzip verbunden, was zu einer sehr großen Zunahme in der Vielfalt der erzeugten Antikörper sind. Antikörper, die erhalten sind voraussichtlich nicht denen entsprechen, die durch eine natürliche Immunantwort gegen ein bestimmtes Ag entstehen würde. Darüber hinaus sind menschliche Protein-Falte und post-translationalen Modifikationen nicht systematisch in Prokaryoten oder sogar in Hefen reproduziert. Eine zweite menschliche mAb-Produktions-Methode ist die Verewigung der natürlichen menschlichen B-Zellen durch Epstein - Barr-Virus-Infektion oder Ausdruck der Anti-apoptotische Faktoren BCL-6 und BCL-XL4. Allerdings ist diese Methode gilt nur für B-Gedächtniszellen und ist ineffizient, dass Screening von zahlreichen mAb-produzierenden verewigt B-Zellen, die nur wenige (wenn überhaupt) mAb-Klone mit der gewünschten Antigen-Spezifität zu identifizieren. Die Methode ist so teuer und zeitaufwändig.
Vor kurzem wurde ein neues Protokoll für die Produktion von menschlichen mAbs von isolierten einzelnen B Zellen5beschrieben. Es stützt sich auf eine optimierte einzellige Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Verstärkung der beiden die Heavy - und Lichterkette Codierung Segmente aus einer einzigen sortierten B-Zelle. Darauf folgt das Klonieren und die Expression dieser Segmente in einer eukaryotischen Expressionssystems, wodurch Wiederaufbau vollständig humaner MAB. Dieses Protokoll wurde erfolgreich ausgehend von B-Zellen von geimpften Spendern verwendet. Zellen wurden mehrere Wochen nach der Impfung zu höhere Frequenzen der B-Zellen gerichtet gegen die gewünschte Ag erhalten, und den Zeitaufwand für das screening von6geerntet. Anderen vollständig humaner mAbs wurden auch von+ (Human Immunodeficiency Virus) HIV-infizierten Patienten7 und Melanom Patienten8produziert. Trotz dieser Fortschritte gibt es noch keine Verfahren zur Verfügung, die die Isolation der Ag-spezifische B-Zellen unabhängig von ihrer Erinnerung Phänotyp oder Frequenz ermöglicht.
Hier beschriebenen Verfahrens führt zu effizienten ex Vivo Isolation der menschlichen zirkulierenden B-Zellen basierend auf ihre BCR Spezifität, gefolgt von der Produktion von vollständig humaner antigenspezifischen mAbs in hoher Ausbeute und mit einer niedrigen Screening-Zeit. Die Methode ist nicht zu B-Gedächtniszellen oder Antikörper-sezernierenden B-Zellen nach einer Immunantwort induziert beschränkt, sondern kann auch auf das menschliche naive B-Zelle Repertoire angewendet werden. Es funktioniert sogar ab Ag-spezifische B-Zellen bei sehr tiefen Frequenzen ist ein guter Indikator für die Effizienz. Das Prinzip der Methode ist wie folgt: periphere Blut mononukleären Zellen (PBMC) sind mit zwei Tetramers präsentiert das Antigen des Interesses befleckt, jeder gekennzeichnet mit einem unterschiedlichen Fluorochrom (z. B.Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC)), und eine dritte Tetramer präsentiert eine eng verwandte Antigen konjugiert mit einem dritten Fluorochrom (z. B.Brillant violett 421 (BV421)). Um für Antigen-bindenen Zellen anzureichern, Zellen werden dann mit Perlen mit Anti-PE beschichtet inkubiert und Anti-APC Abs, und in Zelle Trennung Spalten sortiert. Die APC PE+ + Zelle Bruchteil ausgewählt ist, gebeizt mit einer Vielzahl von mAbs spezifisch für verschiedene PBMC Zelltypen zur Identifizierung von B-Zellen und unterworfenen Zytometrie Zellsortierung fließen. B-Zellen sind PE+ und APC+, aber brillant violett-, sind isoliert. Dieser Schritt wählt gegen Zellen, die nicht B-Zellen oder binden Sie nicht an die tetramerized Antigen, sondern binden PE oder APC (diese Zellen werden PE+ APC– oder PE– APC+) oder zum Teil nicht-Antigen der Tetramers verwendet (diese Zellen werden BV421+). B-Zellen nicht hochspezifisch für das Epitop von Interesse sind auch Counter bei diesem Schritt ausgewählt (diese Zellen werden auch BV421+). Somit kann diese Methode hochspezifische B-Zellen, B-Zell-Rezeptoren (BCR) in der Lage ist zu unterscheiden zwischen zwei eng verwandte Antigene ausdrücken reinigen. Einzelne spezifische B-Zellen sind in Tuben gesammelt und ihre PCR verstärkt Ig cDNAs (ergänzende Deoxyribonucleic Säuren) geklont und durch eine menschliche Zelllinie als sekretierten IgG mAbs ausgedrückt.
Diese Studie beschreibt, wie ein Proof of Concept, die effiziente Erzeugung von menschlichen mAbs, die erkennen, eine Peptid mit einem großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül und kann unterscheiden dieses Peptid und anderen Peptiden beladen auf dem gleichen MHC-ich Allel. Obwohl der Grad der Komplexität dieser AG wichtig ist, können mit dieser Methode (i) high-Yield-Rückgewinnung von Ag-spezifische mAbs; (Ii) Produktion von mAbs in der Lage, zwischen zwei strukturell enger Ags zu unterscheiden. Dieser Ansatz zu geimpften oder infizierten Patienten ohne jegliche Änderung Protokoll erweitert werden und hat auch bereits in einem humanisierten Ratte System9erfolgreich umgesetzt. Diese Studie beschreibt also, eine vielseitige und effiziente Vorgehensweise um vollständig humaner mAbs, die verwendet werden können in Grundlagenforschung und Immuntherapie zu generieren.

<table><tbody><tr><td>HEK 293A Zelllinie</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco von life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Natriumpyruvat (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI Medium1640 (1X)</td><td>Gibco von life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen von Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - Trennung von Lymphozyten mittel</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>Dichte 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>Streptavidin R-Phycoerythrin Konjugat</td><td>Invitrogen von Life Technologies</td><td>S21388</td><td>Premium-Qualität 1mg/ml enthält 5 mM Natriumazid</td></tr><tr><td>Streptavidin, Allophycocyanin-Konjugat</td><td>Invitrogen von thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1 mg/ml 2 mM Azid Premium-Brillantviolett</td></tr><tr><td>421 Streptavidin</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>Konz : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-PE konjugierte magnetische MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC konjugierte magnetische MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs oder QuadroMACS Separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Gebrauchte Verdünnung 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Gebrauchte Verdünnung 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Gebrauchte Verdünnung 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Gebrauchte Verdünnung 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Verwendete Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Zytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Streifen PCR Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks für 96 Mikroröhrchen</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Ribonuklease-Inhibitor (rekombinant)</td><td>Invitrogen von thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>Menge:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser Dnase/RNASE-frei</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Zufällige Hexamere</td><td>Invitrogen von thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>Menge: 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen von thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>Menge : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA-Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, Molekularbiologie</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von Schwerketten - Äußere Primer - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Reverse Primer für humanes Ig - Bakterien PCR-Screening</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Reverse Primer für humanes Ig</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärts-Primer</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT Zweite</td><td>PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGAGGGTGACCGTG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer -Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Äußere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTCTG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer -Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer - Reverse Primer - Bakterien-PCR-Screening</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT Zweite</td><td>PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer -Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer -Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC Zweite</td><td>PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACCAGTCT</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärts-Primer</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Forward Primer</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTC Zweite</td><td>Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Forward Primers</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Äußere Primer -Forward Primer</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Äußere Primer - Forward Primer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Innere Primer - Forward Primer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Innere Primer - Forward Primer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten &lambda; - Innere Primer - Forward Primer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten &lambda; - Innere Primer - Forward Primer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Innere Primer - Vorwärtsprimer</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten &lambda; - Innere Primer - Reverse Primer - Bakterien-PCR-Screening</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Bakterien-PCR-Screening</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Molekularbiologie MP</td><td>Bio AGAH0500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR-Platte</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzym Alter I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzym SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzym Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzym BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Genbank-Zugangsnummer FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Genbank-Zugangsnummer FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Genbank-Beitritt Anzahl FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>Invitrogen von thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Bouillon (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nukleospin Plasmid DNA, RNA und Proteinaufreinigung</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI DNA-Transfektionsreagenz</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit V-Boden</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 Kolben</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT Beschichtungspuffer</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Maxisorp mit flachem Boden 96 Well ELISA-Platten</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>hohe Proteinbindung</td></tr><tr><td>Anti-Human-IgG Ab konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP)</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>TMB-Substrat</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap-Protein A HP-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus Chromatographie System</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen antikörpern aus seltenen antigen-spezifische b-zellen im blut zirkulierenden

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind mächtige Werkzeuge nützlich für beide Grundlagenforschung und in der Biomedizin. Ihre hohe Spezifität ist unverzichtbar, wenn der Antikörper sehr ähnliche Strukturen (z.B., ein normales Protein und eine mutierte Version davon) unterscheiden muss. Der aktuelle Weg erzeugen solche diskriminierenden mAbs beinhaltet umfangreiche Screening von mehreren Ab-produzierenden B-Zellen, ist kostspielig und zeitaufwendig. Wir schlagen hier eine schnelle und kostengünstige Methode zur Erzeugung von diskriminierendem, vollständig humaner mAbs ausgehend von menschlichem Blut zirkulierenden B-Lymphozyten. Die Originalität dieser Strategie ist durch die Auswahl der spezifischen Antigen Bindung B Zellen kombiniert mit dem Counter Auswahl aller anderen Zellen, mit leicht verfügbaren peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC). Sobald bestimmte B-Zellen isoliert sind, stammen cDNA (ergänzende Desoxyribonukleinsäure) Sequenzen Codierung für die entsprechenden mAb Einzelzelle Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und anschließend ausgedrückt in der Human- Zellen. Innerhalb von weniger als 1 Monat ist es möglich, Milligramm hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs gegen nahezu jede gewünschte Antigen natürlich erkannt durch die B-Zell-Repertoires zu produzieren.

Ausgehend von PBMC von gesunden Spendern dieses Projekt stellt die Erzeugung von menschlichen mAbs, die das Peptid Pp65495 erkennen (Pp65, von menschlichen Zytomegalievirus) durch die großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Diese mAbs können zwischen diesem Komplex und aus anderen Peptiden verladen der gleichen MHC-komplexe unterscheiden-ich Molekül.
PBM...

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, vollständig humane monoklonale Antikörper gegen ein gewünschtes Antigen herzustellen, ausgehend von humanen B-Lymphozyten, die im Blut zirkulieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die zwischen hochverwandten Antigenen unterscheiden können. Für einige Anwendungen, wie z. B. die Immuntherapie, kann ein präzises Targeting eines Antigens unerlässlich sein.Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie ausgehend vom Blut gesunder oder immunisierter Spender durchgeführt werden kann und die Isolierung auch seltener antigenbindender B-Zellen ermöglicht. Während diese Methode ausgehend von menschlichen Proben beschrieben wird, kann sie auch auf Tiere angewendet werden, die vorimmunisiert werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Verfahren tatsächlich einer recht komplexen multiplen analytischen Gating-Strategie von diskriminierten B-Lymphozyten unterliegt.Der Eingriff wird von Melinda durchgeführt. Sie ist Assistenzingenieurin in unserem Labor. Zuerst werden 35 Milliliter verdünnte Zellsuspension auf 15 Milliliter Dichtegradient in ein konisc

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Antikörpern aus Säugetierzellen durch Einführung von Plasmidvektoren mit schweren und leichten Kettengenen. Diese Vektoren interagieren mit Polyethylenimin und gelangen durch Bildung von Polyplexen in die Zellen; Später werden sie in einzelne Proteine übersetzt und zu vollständigen Antikörpern zusammengesetzt, die in das extrazelluläre Medium sezerniert werden.

Erzeugung rekombinanter monoklonaler Antikörper aus Säugetierzellkulturen

Das Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen. Eukaryotische Expressionsvektoren, die für die schweren und leichten Ketten von Antikörpern kodieren, die von isolierten antigenspezifischen B-Zellen kloniert wurden, werden mit Hilfe von Polyplexen in Säugetierzellen eingeführt. Sobald sich diese Vektoren in den Zellen befinden, durchlaufen sie eine Translation, und die resultierenden schwer- und leichtkettigen Peptide lagern sich zu...

Eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Die Synthese von humanen monoklonalen Antikörpern ist der erste Schritt in Studien, die darauf abzielen, die pathophysiologischen Mechanismen von Autoantikörper-vermittelten Immunantworten zu entschlüsseln. Wir haben ein Protokoll zur Erzeugung rekombinanter monoklonaler Immunglobulin G (IgG)-Antikörper aus blutsortierten B-Zellen entwickelt, einschließlich B-Zellisolierung, Antikörperklonierung und In-vitro-Synthese.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern auf Basis der Hybridom-Technologie vorgestellt. Die Mäuse wurden mit einem Immunkonjugat immunisiert. Milzzellen wurden durch PEG und einen elektrischen Impuls mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert. Antikörper-produzierende Hybridomzellen wurden mittels HAT und antigenspezifischem ELISA-Screening selektiert.

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Eine einfache aber wirksame Methode, die magnetischen Nanopartikel verwendet antigen-reaktiven B-Zellen für die funktionale und phänotypische Analyse zu erfassen und zu bereichern beschrieben.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Erfahren Sie die Generierung diskriminierender humaner monoklonaler Antikörper aus zirkulierenden B-Lymphozyten für Immuntherapie-Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung seltener antigenspezifischer B-Zellen aus Blutproben.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden (Video) | JoVE Journal

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

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