Name: Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Lernen Sie die Isolierung intakter Mäuse-Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix und der Ductus-Architektur mittels Histologie und Immunhistochemie. Diese Methode unterstützt Entwicklungsbiologie und Krebsforschung.

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Die Autoren möchten April Wiles und Dr. Roger Broderson für Hilfe mit tierischen Sektions- und Drüse Isolation, bzw. zu bestätigen. Mittel für diese Arbeit wurde von den Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers für chronische Erkrankungen des Alterns unterstützt.

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen in diesem Protokoll wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Philadelphia College of Osteopathic Medicine genehmigt und alle Techniken wurden unter strengen durchgeführt ethische Leitlinien.
 1. Probe Beschaffung und Verarbeitung <ol><li>Wählen Sie geeignete tierische Betreff und Ort in eine CO-2-Kammer. Verwenden Sie für dieses Experiment 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J und C57BI/6J.</li>
	<li>Schalten Sie Gasstrom zu 30-40 %. Sobald das Tier nach ca. 2 min sichtlich bewusstlos ist, öffnen Sie das Gasventil zu vollen Druck für eine zusätzliche 5 min. 
	Hinweis: Bestätigen Sie tierischen Tod durch die Beobachtung von sichtbaren Zeichen der Atmung (z.B. Bewegung der Brust) für einen Zeitraum von 10 Minuten nach Beendigung der CO 2 Lieferung. Wenn das Tier noch am Leben ist, kann es wieder in die CO-2-Kammer platziert. Zervikale Dislokation kann auch verwendet werden, obwohl es nicht empfohlen wird, da Blut ansammeln kann, um die Milchdrüsen stören die Dissektion und Ergebnisse.</li>
	<li>Nach Opfer, pin-Kadaver in Rückenlage und mit 70 % Ethanol zu sättigen.</li>
	<li>Kneifen das Fell direkt über dem Schambein mit Pinzette und nick mit kleine chirurgische Scheren. Drehen der Schere das Fell entlang der ventralen Mittellinie bewegen auf kranialen kaudalen geschnitten.</li>
	<li>Mit größeren Schere oder einer Gefäßklemme unverblümt sezieren die subkutane Faszie bilateral, mit Vorsicht nicht auf um das Peritoneum zu durchbohren. Schneiden Sie entlang der horizontalen Ränder an beiden distalen Enden des Schnittes.</li>
	<li>Pin das Fell Klappen öffnen und wieder mit 70 % Ethanol sprühen. 
	Hinweis: Obwohl die Verwendung von 70 % Ethanol bessere visuelle Unterscheidung zwischen der Drüse und die umliegenden Unterhautgewebe erlaubt, seien Sie vorsichtig zu trocknen des Gewebes als Folge der Verwendung dieser Lösung. Um zu vermeiden, trocknen, entfernen der Drüsenkörpers in einem Zeitrahmen nicht zu 4 min nicht überschreiten. Als Alternative zu 70 % Ethanol, kann der Prüfer auch ersetzen einen allgemeinen isolieren Puffer, z. B. 1 X PBS, um Gewebe Austrocknung zu vermeiden.</li>
	<li>Ortung der Milchdrüsen von Interesse, schieben Sie ein #4 Skalpellklinge entlang der Innenseite der Fell-Klappen, Schneiden der Brustdrüse und die damit verbundenen kutane Fettgewebe frei von der Dermis. 
	Hinweis: 3,5 x chirurgische micro Lupen können einfacher Visualisierung der Drüsen helfen.</li>
	<li>Tauchen sofort neu isoliert Drüse in konische Rohr mit 10:1 Lösung-Gewebe-Volumen von 10 % neutral gepuffertem Formalin für 24-48 h 
	Hinweis: Je nach Absicht der Studie, viele alternative Fixiermittel verwendet werden wie Paraformaldehyd, Ethanol für genomische Studien und handelsüblichen RNA Puffer erhalten.</li>
	<li>Folgen institutionelle Protokolle für die Einbettung von Paraffin, reichen Proben an einen Lieferanten für die Verarbeitung, einbetten, und schneiden/Folie Montage. Sektion Gewebe bei 5 µm. 
	Hinweis: Aufgrund von überschüssigem Fettgewebe umliegenden Drüse, sollten Sie entfernen 100-200 µm Gewebe vor dem Schneiden und färben.</li>
</ol> 2. Retikuläres Gewebe <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>Ort-Folien auf Heizblock gefärbt werden gesetzt auf 58 ° c für 1 h Paraffin schmilzt. 
		Achtung: Paraffin Wachs schmelzen Folie überschreiten. Aufmerksam verfolgen oder platzieren Sie wischen unter Folie, Abfluss Wachs zu erfassen. 
		Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich und kann übersprungen werden. Wenn Ergebnisse sind nicht wie erwartet, Hinzufügen von diesen Schritt zurück kann Ergebnis verbessern.</li>
		<li>Inkubieren Folien in einer Folie jar mit 100 % Xylol für 30 min vollständig untertauchen zu gewährleisten. Einmal zu wiederholen. 
		Hinweis: an dieser Stelle sollte Sichtprüfung durchgeführt werden um sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte sind frei von Fettgewebe und Paraffin. Wenn zusätzliche Fettgewebe oder Wachs ersichtlich ist, sollte die Folie wieder in Xylol eingetaucht sein. Seien Sie vorsichtig, um zusätzliche Exposition gegenüber Xylol zu minimieren, da dies Schrumpfung des Gewebes führen kann.</li>
		<li>Einmal rehydrieren Gewebe in eine Folie JAR-Datei mit 100 % igem Ethanol für 10 min. wiederholen.</li>
		<li>Umzug Folien eine Folie JAR-Datei mit 95 % igem Ethanol für 10 min. wiederholen einmal.</li>
		<li>Verschieben Sie Folien eine Folie Glas enthält 75 % Ethanol für 5 min.</li>
		<li>Verschieben Sie Folien eine Folie Glas mit 50 % Ethanol für 5 min.</li>
		<li>10 mM Natriumcitrat Lösung (pH-Wert 6,0) in einer heißen Platte oder eine Mikrowelle kochen und gießen Sie in Coplin Jar. 
		Achtung: Überwachen Sie Lösung beim Erwärmen und vermeiden Sie kochen über zu. Container werden sehr heiß. Schutz verwenden, um Verbrennungen zu vermeiden.</li>
		<li>Langsam Platz Dias in Coplin jar, vollständiges Untertauchen zu gewährleisten und bei 100 ° C für 10 min zum Abrufen von Epitopen inkubieren. Entfernen und sorgfältig trocknen Folien.</li>
		<li>Zeichnen eine Sperre um Gewebe mit einem hydrophoben Marker. Fügen Sie genügend körpereigene Enzym-Blocker (Wasserstoffperoxid und Natriumazid, erhältlich im Handel) Gewebe abdecken und 10 min. inkubieren</li>
		<li>Submerge Folien in 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 10 min.</li>
		<li>Fügen Sie genügend Serum 10 % Esel in 1 X PBS Gewebe abdecken und für 1 h bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer inkubieren. 
		Hinweis: Das Experiment kann hier durch die Speicherung der Folien in die feuchte Kammer bei 4 ° C über Nacht angehalten werden. Während Esel Serum gefunden wurde, um optimale Färbung Ergebnisse zu erzielen, kann der Prüfer verschiedene Seren wie Rinderserumalbumin (BSA), Ziegenserum oder Pferd Serum, um optimale Ergebnisse zu bestimmen testen möchten. Wenn BSA verwenden, sollte der Prüfer diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
		<li>Dekantieren überschüssige Blocker von Folien und richtig verdünnte Primärantikörper in 1 % Serum direkt hinzufügen Folien um sicherzustellen, dass das Gewebe in Lösung gleichmäßig bedeckt ist. 30 min bei Raumtemperatur in eine feuchte Kammer inkubieren. 
		Hinweis: Dieser Schritt fortgesetzt werden für längere Zeit Laufzeiten mit feuchten Kammer gelagert um 4 ° C. Achten Sie darauf, die richtige Negativkontrolle Folien (z. B. eine Folie mit keine primären Antikörper, Antigen-negativen Gewebe, etc. bekannt) bei diesem Schritt enthalten.</li>
		<li>Sorgfältig waschen Dias durch fließt etwa 1 mL der DiH 2 O über Gewebe und inkubieren Sie 1 Änderung der 1 X PBS für 5 min.</li>
		<li>Dekantieren überschüssige PBS und fügen Sie genug Meerrettich-Peroxidase-Label Gewebe zu bedecken und 30 min. in eine feuchte Kammer inkubieren. 
		Hinweis: Bei diesem Schritt kann der Prüfer, fluoreszierende Färbung mit Gewebekulturen konjugierten Sekundärantikörper fortfahren möchten. Wenn dies gewünscht ist, sollten die nächsten Schritte beschrieben entsprechend angepasst werden.</li>
		<li>Sorgfältig waschen Dias durch fließt etwa 1 mL der DiH 2 O über Gewebe und inkubieren Sie 1 Änderung der 1 X PBS für 5 min.</li>
		<li>Diaminobenzidine (DAB) plus Chromogen-Lösung entsprechend dem Hersteller empfohlene Verhältnis und vermischen von Wirbel. 
		Hinweis: Viele fertige Kits sind im Handel erhältlich neben in diesem Protokoll verwendet.</li>
		<li>Dekantieren Überschuss Puffern von Folien und fügen Sie 2-3 Tropfen (10-50 µL) Chromogen Fleck direkt zu den Geweben und 5 min in die feuchte Kammer inkubieren. Sorgfältig waschen Folien durch fließende etwa 1 mL DiH 2 O über Gewebe. 
		Achtung: DAB-Chromogen ist hochgiftig. Vermeiden Sie direkten Kontakt des Flecks mit Haut und sammle Flow aus Sondermüll.</li>
	</ol></li> <li>Hämatoxylin und Eosin (H &#38; E) <ol><li>Chromogen Inkubation Nachspülung nach Tauchen Folien in Harris Hämatoxylin für 2-2,5 min. Spülen Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für 1-2 min. 
		Hinweis: Achten Sie darauf, direkten Wasserstrahl auf Geweben.</li>
		<li>Folien Submerge für 2-3 s in Differenzierung Lösung (0,25 mL Salzsäure in 100 mL 70 % igem Ethanol). Spülen Sie Folien vorsichtig unter fließendem Wasser für ca. 1-2 min.</li>
		<li>Tauchen Sie Folien in blauen Agent (4,5 mg Calciumcarbonat in 100 mL Leitungswasser, pH-Wert eingestellt auf 9,4) für 60 S. Spülen Folien in 95 % igem Ethanol für 30 s.</li>
		<li>Submerge Folien in alkoholischer Eosin Y für ca. 2-3 min.</li>
		<li>Entwässern Gewebe in 2 Änderungen von 95 % Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Gelief Gewebe in 1 von 100 % Ethanol für mind. 1 ändern</li>
		<li>Trocknen Folien mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie 1 Tropfen (ca. 100-200 µL) von synthetischen, nichtwässrigen, Harz-Basis Montage Medien zu schieben und Deckglas anzuwenden. 
		Hinweis: Wenn eine andere Färbung Methode gewählt wurde, möglicherweise eine andere Montage-Medien erforderlich. Zum Beispiel, wenn der Prüfer eine Leuchtstoff-konjugierten Sekundärantikörper gewählt haben, eine wässrige Halterung mehr ideal wäre.</li>
		<li>Folien über Nacht bei Raumtemperatur einstellen lassen.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius rot (PSR) färben <ol><li>Wählen Sie Folien werden gebeizt und Immunhistochemie Protokoll über Schritt 6 (50 % Ethanol einweichen) folgen.</li>
		<li>Submerge Folien in PSR Fleck für 1 h.</li>
		<li>Tauchen Sie Folien in 0,5 % Essigsäure für 1-2 s zweimal, um Flecken zu differenzieren.</li>
		<li>Entwässern Gewebe in 2 Änderungen von 95 % Ethanol für 1 min.</li>
		<li>Gelief Gewebe in 1 von 100 % Ethanol für mind. 1 ändern</li>
		<li>Klare Folien durch kurz eintauchen in 100 % Xylol für über 3-4 s.</li>
		<li>Trocknen Folien mit einem fusselfreien Tuch. Geben Sie 1 Tropfen (ca. 100-200 µL) von synthetischen, nichtwässrigen, Harz-Basis Montage Medien zu schieben und Deckglas anzuwenden.</li>
	</ol></li></ol> 3. Probieren Sie Analyse <ol><li>Duktales Analyse <ol><li>Select Folien gebeizt für α-SMA. Mit einem Lichtmikroskop, ausgestattet mit einem Kamera Ziel, repräsentative Bilder mit 20 X Vergrößerung sammeln.</li>
		<li>Mit ImageJ (NIH), zu unterscheiden und zählen Kanäle in jedem Bild. Diese können manuell aufgelistet werden oder man kann einzelne Kanäle eine Punkteskala zuweisen. Zuweisen einer Punkteskala, ImageJ zu öffnen und wählen Plugins. Als nächstes wählen Sie Analyze und Zelle Zähler aus dem Drop-down-Menü. Initialize klicken Sie unter markieren Sie Typ1 zunächst Kennzeichnung der Rohre zu. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Ergebnisse anzeigen die Anzahl die duktale. 
		Hinweis: Achten Sie darauf, überprüfen Strukturen sind duktale und nicht vaskulären.</li>
		<li>In &#39; setzen Messung &#39; Optionen, aktivieren Sie &#39; Umfang &#39; und &#39; Bereich &#34;.</li>
		<li>Mit dem Freihand Polygon-Werkzeug zeichnen Sie eine Linie um jedes Rohr auf das Myoepithelial Fach (Sichtbarkeit von α-SMA Fleck unterstützt). Wählen Sie &#39; Messen &#39; und notieren Sie den Umfang und die Fläche.</li>
		<li>Wieder mit dem Freihand Polygon-Werkzeug eine Linie entlang der apikalen Seite des duktalen Epithel im Innern des Gefäßlumens. Wählen Sie &#39; Messen &#39; und notieren Sie den Umfang und die Fläche.</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Umfang der luminalen Abteil aus dem Umfang des Myoepithelial Fach um den Umfang des duktalen Epithel zu erhalten. Subtrahieren Sie den Bereich der luminalen Fach aus dem Bereich der Myoepithelial Fach, das Gebiet der duktalen Epithel zu erhalten.</li>
	</ol></li> <li>Immunohistochemistry Analyse <ol><li>auf eine Analysesoftware wie ImageJ oder Fidschi Suite Hellfeld Bilder hochladen. 
		Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum Beizen Analyse mit ImageJ und der IHC Toolbox Plugin.</li>
		<li>Öffnen Sie die Toolbox IHC aus dem Plugin-Menü. In der &#34; Modell auswählen &#34; Combo-Box öffnet sich, wählen geeignete Fleck (d. h. H-DAB, PSR, etc.). Wählen Sie die &#34; Farbe &#34; Option, um den Fleck zu isolieren. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster. 
		Hinweis: Diese Methode ist sinnvoll, wenn ein Protein des Interesses in den extrazellulären oder cytosolischen Räumen liegt oder an der Plasmamembran gebunden ist. Wenn das Protein des Interesses Atomkraft ist, Auswahl, &#34; Kerne &#34; fordert das Plugin, das Bild für positiv gefärbten Kernen analysieren.</li>
		<li>Color Chooser schieben verwenden, um den Fleck ohne Hintergrund Einschluss oder Ausschluss der übermäßigen Fleck richtige Isolierung. 
		Hinweis: Wenn der automatische Modus nicht in der Lage ist, den Fleck zu erkennen oder nicht akzeptable Bilder führt, zeichnen Sie ein Quadrat Region von Interesse (ROI) über eine identifizierte Region gebeizt. Wählen Sie im Fenster "IHC-Toolbox" &#34; Zug &#34;, Plugin, um das entsprechende Ziel zu lenken.</li>
		<li>Konvertieren Sie das Bild auf 16-Bit. Gehen Sie zu Bild &#8594; Typ &#8594; 16bit.</li>
		<li>Schwelle das Bild. Gehen Sie zu Bild &#8594; einstellen &#8594; Auto Schwelle.</li>
		<li>Setzen die Messskala Bild durch Ziehen einer Linie ROI direkt über die Maßstabsleiste in das Bild, dann die Länge zuweisen. Um die Maßstabsleiste einzustellen, gehen Sie zu Analyse &#8594; Set Maßstab. Geben Sie die Anzahl der Pixel pro die gewünschte Längeneinheit (z.B. 120 Pixel pro 50 µm).</li>
		<li>Die resultierende Fläche messen und grauen Mittelwert. Gehen Sie zu Analyze &#8594; Set Messungen und sammeln Sie die Messung durch Klicken auf Analyze &#8594; Maßnahme.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dem Papier haben wir eine Technik, um intakte Maus Milchdrüsen für nachgeschaltete histologische Analysen der ECM Ausdruck und duktale Morphologie isolieren beschrieben. Im Hinblick auf Analysen von duktalen Morphologie ermöglicht diese Methode die rasche Untersuchung der duktalen Architektur basiert auf gefärbten histologischen Abschnitte. Andere Methoden des duktalen Analysen beruhen auf Injektionen von Farbstoffen ermöglicht Visualisierung des Baumes duktale Methoden die technisch schwierig und zeitraubend sein kan...

Brustkrebs ist gekennzeichnet durch ein hohes Maß an Gewebe Fibrose1,2,3,4. Als die ECM bezeichnet, diese nicht-zelluläre Einheit findet sich in unterschiedlichem Ausmaß in allen Geweben und besteht hauptsächlich aus einem komplexen Geflecht von fibrillären und nicht-fibrillären Kollagene, Elastin und Glykoproteinen neben verschiedenen Signalmoleküle, die in dieser Matrix abgesondert. Homöostatische Bedingungen wird die Ablagerung und den Abbau des ECM streng kontrolliert. 5 während Brust Tumorgenese, wird das Gleichgewicht der ECM-Ablagerung und Abbau gestört. Als solche wurden Brusttumoren berichtet, reichlich ECM-Proteine wie Kollagene, Fibronektin und Tenascin-C unter anderem zum Ausdruck bringen. 6 der abnorme Ausdruck dieser Proteine zusätzlich erhöhte Muster Matrix Vernetzungsgrad ist dokumentiert worden, zur Förderung der Brust Tumor Progression, Metastasierung und Therapie Widerstand1,3, 4,7,8,9.
Um ECM Zusammensetzung und duktale Morphologie zu beurteilen, wurde Isolation intakt Milchdrüsen durchgeführt. Hier wir weibliche nulliparous Mäusen unzulänglich für Caveolin-1 verwendet, eine integrale Membranprotein, verbunden mit einer aggressiven Brustkrebs-Tumor Signatur10,11,12, und weibliche nulliparous B6 zu kontrollieren Mäuse. Histologischen Verarbeitung und Färbung dieser Gewebe erlaubt die Identifizierung von mehreren ECM-Proteinen zusammen mit Charakterisierung von duktalen Morphologie.
Alles in allem Möglichkeit die Isolierung des gesamten, intakte Milchdrüsen Forscher die, Gewebe-weite morphologische oder zelluläre Veränderungen in Reaktion auf exogene oder endogene Faktoren zu untersuchen. Nachteile der Technik sind verbunden mit Analysen von 2 Dimension (2D) Gewebeschnitte im Gegensatz zu einer 3D Perspektive, die ein vollständigeres Bild der komplexen Morphologie des Baumes duktale erbringen würde. Angesichts der Komplexität der Zell-Zell und Zelle-ECM-Interaktionen, die stattfinden in der Brustdrüse, ist die Isolierung des gesamten, intakten Drüsen vorteilhaft für effizient analysieren duktale Morphologie und Protein Ausdruck in verschiedenen Regionen der Murine Milch- Drüse.

<table><tbody><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopkamera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Olympus</td><td>cellSens Einstiegssoftware</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Chirurgische Mikrolupen</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Vergrößerung nach Belieben des Forschers</td></tr><tr><td>Mayo Schere</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Färbegestell</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Färbeschale</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Tiegel</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Geeignete Größe für Gewebe</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Maus, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alkoholisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xylole, Reagenzqualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>geeignet für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>permanent Eindeckmedium</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt's Eindeckmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin-C Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Smooth Muscle Actin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>Nr. K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von intakt, ganze maus milchdrüsen zur analyse der extrazellulären matrix ausdruck und drüse morphologie

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Das Ziel dieses Verfahrens war #4 Bauch Milchdrüsen von weiblichen nulliparous Mäusen zu ernten, um ECM Ausdruck und duktale Architektur zu beurteilen. Hier entstand eine kleine Tasche unter der Haut mit Mayo Schere, so dass Trennung der Drüsen in das subkutane Gewebe von der zugrunde liegenden Bauchfell. Visualisierung der Drüsen wurde unterstützt durch den Einsatz von 3,5 X-R chirurgische micro Lupen. Das Fell wurde invertiert und merken zurück ermöglicht Identifikation von intakten Mamma Fettpolster. Jeder der #4 Bauch-Drüsen wurde unverblümt zergliedert durch Verschieben der Skalpellklinge seitlich zwischen die subkutane Schicht und die Drüsen. Sofort nach der Ernte, wurden die Drüsen in 10 % neutral gepuffertem Formalin für die anschließende Gewebe Verarbeitung gelegt. Exzision der gesamten Drüse ist vorteilhaft, weil es in erster Linie eliminiert das Risiko des Ausschlusses wichtiger Gewebe-weite Wechselwirkungen zwischen duktalen Epithelzellen und andere microenvironmental zellularen Bevölkerungen, die in einer partiellen Biopsie entgehen lassen könnte. Ein Nachteil der Methode ist die Verwendung von Schnittserien aus festen Geweben die Analysen des duktalen Morphogenese und Protein Ausdruck an diskreten stellen innerhalb der Drüse begrenzt. Als solche Veränderungen in duktale Architektur und Protein-Expression in 3 Dimensionen (3D) ist nicht leicht erhältlich. Alles in allem ist die Technik auf Studien, die völlig intakt murinen Milchdrüsen für nachgelagerte Untersuchungen wie Entwicklungsstörungen duktale Morphogenese oder Brust Krebs anwendbar.

Weibliche Mäuse haben 5 paar Milchdrüsen. Insbesondere gibt es ein paar von zervikalen Drüsen (#1), zwei Paare von thorakalen Drüsen (#2 und #3), ein paar Bauch-Drüsen (#4) und 1 paar inguinalen Drüsen (#5) (Abb. 1A). Hier isoliert wir #4 Drüsen, da sie leicht zu identifizieren sind. In einigen Fällen wurden #4 und #5 Drüsen zusammen isoliert da Unterscheidung zwischen den beiden schwierig war. Zur Isolierung intakt #4 Bauch war Milchdrüsen, ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung des gesamten, intakte Maus Milchdrüsen um Ausdruck der extrazellulären Matrix (ECM) und duktale Morphologie zu untersuchen. Maus #4 Bauch-Drüsen wurden von ca. 8-10 Wochen alten weiblichen nulliparous Mäusen, in neutral gepuffertem Formalin fixiert, geschnitten und gefärbt mit Immunohistochemistry für ECM Proteine extrahiert.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik zur Entnahme der gesamten Brustdrüse ist es, die Analyse der histologischen Präsentation von Brustgewebe aus einer intakten Drüse ex vivo zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Tumorbiologie zu beantworten, z. B. wie Stromagewebe in Tumoren umgebaut wird oder wie eine abweichende Gen- oder Proteinexpression die duktale Architektur der Brust verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Forschern ermöglicht, die Proteinexpression und die duktale Architektur in ganzen Brustdrüsen von gesunden und kranken Mäusen zu charakterisieren und zu quantifizieren.Diese Technik wird Chris Thompson, ein Doktorand in meinem Labor, demonstrieren. Nachdem Sie acht bis 10 Wochen alte weibliche nullipare Mäuse gemäß dem Textprotokoll geopfert haben, stecken Sie den Kadaver in Rückenlage und verwenden Sie 70% Ethanol, um ihn zu sättigen. Kneifen Sie das Fell mit einer Pinzette direkt über dem Schambein zusammen und schneiden Sie es mit einer kleinen chirurgischen Schere ein.Drehen Sie dann die Schere und schneiden Sie das Fell entlang der ventralen Mittellinie und bewegen Sie es von kaudal zu kranial. Präparieren Sie mit einer größeren Schere oder einem Hämostaten die subkutane Faszie stumpf beidseitig und achten Sie darauf, das Peritoneum nicht zu punktieren. Schneiden Sie entlang der horizontalen Ränder an beiden distalen Enden des Schnitts.Als nächstes steckst du die Fellklappen auf und besprühst das Taschentuch mit PBS, um es feucht zu halten. Lokalisieren Sie dann die interessierenden Brustdrüsen, schieben Sie eine Skalpellklinge entlang der Innenseite der Felllappen und schneiden Sie die Brustdrüse und das zugehörige subkutane Fettgewebe von der Dermis frei. Bevor Sie die Bauchdrüse von der Leistendrüse trennen, achten Sie darauf, die Drüsen so deutlich wie möglich zu identifizieren.Tauchen Sie die neu isolierte Drüse sofort in ein konisches Röhrchen, das etwa sechs Milliliter einer 10 zu 1 Eins-Lösung für das Gewebevolumen 10 % neutral gepuffertes Formalin enthält, und inkubieren Sie es für 24 bis 48 Stunden. Nachdem Sie das Paraffin von den Objektträgern geschmolzen und die Scheiben gemäß dem Textprotokoll rehydriert haben, kochen Sie 10 millimolare Natriumcitratlösung auf einer heißen Platte oder in einer Mikrowelle und gießen Sie die Lösung in ein Coplin-Glas. Legen Sie die Objektträger langsam in das Coplin-Glas, stellen Sie sicher, dass sie vollständig untergetaucht sind, und inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius, um Epitope zu gewinnen.Entfernen Sie dann die Objektträger und trocknen Sie sie vorsichtig ab. Zeichnen Sie als Nächstes mit einem hydrophoben Marker eine Barriere um das Gewebe. Spülen Sie die Objektträger nach dem Trocknen ein bis zwei Sekunden lang mit PBS.Fügen Sie dann genügend endogenen Enzymblocker hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang. Tauchen Sie die Folien 10 Minuten lang in 1X PBS. Fügen Sie dann genügend 10%iges Eselsserum und PBS hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.Dekantieren Sie den Überschussblocker von den Objektträgern und geben Sie den ordnungsgemäß verdünnten Primärantikörper in 1%Serum direkt auf die Objektträger, um sicherzustellen, dass das Gewebe gleichmäßig mit Lösung bedeckt ist. Inkubieren Sie die Objektträger bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten. Waschen Sie die Objektträger vorsichtig, indem Sie etwa einen Milliliter entionisiertes Wasser über das Gewebe fließen lassen, und inkubieren Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang in einem Wechsel von 1X PBS.Dekantieren Sie das überschüssige PBS und fügen Sie genügend Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie die Objektträger vorsichtig, indem Sie etwa einen Milliliter deionisiertes Wasser über das Gewebe fließen lassen, und inkubieren Sie das Gewebe wie zuvor fünf Minuten lang in einem Wechsel von 1X PBS. Nach der Herstellung der DAB plus-Chromogenlösung den überschüssigen Puffer von den Objektträgern dekantieren und zwei bis drei Tropfen Chromogen-Färbung direkt auf das Gewebe geben.Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang in einer befeuchteten Kammer. Waschen Sie dann die Objektträger vorsichtig, indem Sie etwa einen Milliliter entionisiertes Wasser über das Gewebe fließen lassen. Nach einer abschließenden Spülung nach der Chromogen-Inkubation tauchen Sie die Objektträger zwei bis zweieinhalb Minuten lang in Harris Hämatoxylin.Spülen Sie die Objektträger dann vorsichtig ein bis zwei Minuten lang unter Leitungswasser ab. Tauchen Sie die Objektträger zwei bis drei Sekunden lang in Differenzierungslösung. Spülen Sie die Objektträger dann etwa ein bis zwei Minuten lang vorsichtig unter Leitungswasser ab.Tauchen Sie die Folien 60 Sekunden lang in blauen Agenten. Spülen Sie dann die Objektträger 30 Sekunden lang in 95%igem Ethanol aus. Übertragen Sie die Objektträger für zwei bis drei Minuten in alkoholisches Eosin Y, bevor Sie das Gewebe in zwei Wechseln von 95% Ethanol für jeweils eine Minute dehydrieren.Zum Schluss dehydrieren Sie das Gewebe einmal eine Minute lang in 100%igem Ethanol. Trocknen Sie die Objektträger vorsichtig mit einem fusselfreien Tuch ab. Tragen Sie dann einen Tropfen synthetisches, nichtwässriges Einbettmedium auf Harzbasis auf den Objektträger auf und bringen Sie einen Deckslip an.Um eine duktale Analyse durchzuführen, wählen Sie Objektträger aus, die mit Alpha-SMA gefärbt sind. Nehmen Sie dann mit einem Lichtmikroskop, das mit einem kameramontierten Objektiv ausgestattet ist, repräsentative Bilder mit 20-facher Vergrößerung auf. Um Rohre in jedem Bild zu zählen, zählen Sie sie entweder manuell oder öffnen Sie ImageJ und wählen Sie Plugins aus.Wählen Sie als Nächstes Analysieren aus, und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü den Zellzähler aus. Klicken Sie auf Initialisieren, und markieren Sie dann Typ eins, um mit der Beschriftung von Luftkanälen zu beginnen. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Ergebnisse aus, um die Anzahl der Kanäle anzuzeigen.Beginnen Sie damit, mit dem Linienwerkzeug eine Linie über die Maßstabsleiste des Bildes zu zeichnen. Klicken Sie dann auf Analysieren und Skalierung festlegen. Geben Sie im nächsten Fenster die Entfernung in bekannter Entfernung und die Einheiten in der Längeneinheit ein.Klicken Sie dann auf OK. Überprüfen Sie anschließend unter Festlegen von Messoptionen die Fläche und den Umfang. Zeichnen Sie dann mit dem Freihand-Polygon-Werkzeug eine Linie um jeden Kanal am myoepithelialen Kompartiment.Wählen Sie Messen aus, und notieren Sie den Umfang und die Fläche. Zeichnen Sie erneut mit dem Freihand-Polygon-Werkzeug eine Linie entlang der apikalen Seite des duktalen Epithels im Inneren des Lumens. Wählen Sie dann Messen aus, und notieren Sie den Umfang und die Fläche.Subtrahieren Sie die Fläche des Lumenkompartiments von der Fläche des myoepithelialen Kompartiments, um die Fläche des duktalen Epithels zu erhalten. Subtrahieren Sie den Umfang des Lumenkompartiments vom Umfang des myoepithelialen Kompartiments, um den Umfang des duktalen Epithels zu erhalten. Um eine immunhistochemische Analyse durchzuführen, laden Sie Hellfeldbilder in eine Analysesoftware wie ImageJ oder Fiji Suite hoch.Öffnen Sie über das Plugin-Menü in ImageJ die IHC-Toolbox. Wählen Sie im sich öffnenden Kombinationsfeld Modell auswählen den entsprechenden Fleck aus. Wählen Sie die Farboption aus, um den Fleck zu isolieren.Daraufhin öffnet sich ein Ergebnisfenster. Verwenden Sie die Farbauswahlfolie, um eine ordnungsgemäße Isolierung des Flecks zu gewährleisten, ohne dass es zu einem Hintergrundeinschluss oder einem übermäßigen Fleckenausschluss kommt. Gehen Sie zum Bildtyp 16-Bit, um das Bild in 16-Bit zu konvertieren.Begrenzen Sie dann das Bild, indem Sie zu Bild gehen, Schwellenwert anpassen. Gehen Sie schließlich zu Analyse, legen Sie die Messung fest, um die resultierende Fläche und den mittleren Grauwert zu messen, und wählen Sie Analysieren, Messen, um die Messung zu erfassen. In diesen fixierten Abschnitten der Brustdrüsen Nummer vier wurde die Expression von Kollagen, Fibronektin und Tenascin-C analysiert.Die Pfeile zeigen das Vorhandensein von Gängen in diesen Geweben an. Um die morphologischen Merkmale der Kanäle zu quantifizieren, ist es wichtig, die histologischen Schnitte vorsichtig zu behandeln, da eine unsachgemäße Handhabung zu beschädigten Geweben und Gängen führen kann, die nicht messbar sind. Hier wird ein Beispiel für geschädigtes Gewebe gezeigt, das nicht für die Analyse verwendet werden kann.In diesem Bild ist eine intakte Gewebeprobe dargestellt, bei der die Kanäle messbar und quantifizierbar sind. Die Gänge zeichnen sich nicht nur durch das umgebende Fibronektin-gefärbte Stroma aus, sondern auch durch die dichte Population von Epithelzellen, die das Lumen der Kanäle auskleiden. In diesem mit Fibronektin gefärbten Schnitt enthalten mehrere intakte Kanäle Veräste, die durch Pfeile gekennzeichnet sind.Für die Zwecke dieser Analyse sollten diese duktalen Abzweigungen nicht als getrennte Kanalstrukturen betrachtet werden. Bei der Beurteilung und Messung von Kanälen ist es wichtig, Gänge von Gefäßstrukturen zu unterscheiden. Gefäßstrukturen sind durch rote Pfeile und duktale Strukturen durch schwarze Pfeile gekennzeichnet.Gefäßstrukturen können nicht nur durch das Vorhandensein einer endothelialen Monoschicht, die das Lumen auskleidet, identifiziert werden, sondern auch durch das Vorhandensein von anuklaren, eosinophilen Strukturen, die auf rote Blutkörperchen im Lumen hinweisen. Einmal gemeistert, kann die Gewebeentnahme in etwa 15 Minuten pro Tier durchgeführt werden, und die Schnittfärbungen können in etwa sieben bis acht Stunden abgeschlossen werden, wobei die Objektträgerbilder am nächsten Tag aufgenommen werden, wenn alles ordnungsgemäß durchgeführt wird. Wenn Sie diese Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass die einzelnen Ziele Ihres Experiments möglicherweise Optimierungen in bestimmten Schritten erfordern.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Erzeugung der zweiten Harmonischen oder die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Zusammensetzung oder Architektur des Gewebestromus zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in vielen Bereichen, wie z. B. der Tumorbiologie, um die Gewebeorganisation und die Proteinexpressionsmuster in zahlreichen Tiermodellen menschlicher Krankheiten und Pathologien zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Brustdrüsen von Mäusen präpariert und isoliert.Sie sollten auch die Verfahren der immunhistochemischen Färbung von Gewebeschnitten verstehen, einschließlich der Verwendung von Gegenfärbungen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren und deren Geweben und Chemikalien wie Xylolen und DAB-Chromogen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie eine angemessene Haltungsschulung und die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Methode beschreibt, wie zu sezieren und zu bewerten Brustdrüse Entwicklung und Funktion von Mäusen. Abgeschnittene Milchdrüsen sind für den Grad der Entwicklung mit whole mount beurteilt, während Milchspendereflex wird ausgewertet, wobei Oxytocin-basierte myoepithelialen Zelle Kontraktion Assay.

Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Die Brustdrüsenentwicklung im Nagetier wurde typischerweise mit deskriptiven Beurteilungen oder durch Messung von physikalischen Grundattributen ausgewertet. Die Verzweigungsdichte ist ein Indikator für die Entwicklung von Mamma, der objektiv schwer zu quantifizieren ist. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die quantitative Beurteilung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften.

Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

Wir entwickelten eine Methode zur erfolgreichen Entfernung, Verarbeitung, Sektion und Flecken, zur histopathologischen Auswertung, Mammagewebe, das ursprünglich auf Rutschen als ganze Reittiere fixiert worden war. Diese Methode kann die Sammlung und Auswertung von Brustdrüsen-Vollbehältern in Reproduktions- und Entwicklungsprüfungsstudien fördern.

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Technik zur intravitalen Bildgebung der Milchdrüse der laktierenden Maus mittels konfokaler Laserscanning- und Multiphotonenmikroskopie.

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

In diesem Protokoll wird ein Ansatz zur Erzeugung von Epithelorganoiden aus primärem Normal- und Tumorbrustgewebe durch differentielle Zentrifugation erörtert. Darüber hinaus sind Anleitungen für die dreidimensionale Kultivierung sowie die Immunfluoreszenz-Bildgebung von eingebetteten Organoiden enthalten.

Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging

Dieses Protokoll beschreibt einen skalierbaren intraduktalen CRISPR-Screening-Ansatz, der parallele in vivo Gen-Knockout- und Aktivierungsstudien in der Mammarydrüse der Maus ermöglicht.

Paralleles In vivo-Screening von Gen-Knockout und -Aktivierung in der Mammarisdrüse der Maus

Lernen Sie die Isolierung intakter Mäuse-Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix und der Ductus-Architektur mittels Histologie und Immunhistochemie. Diese Methode unterstützt Entwicklungsbiologie und Krebsforschung.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

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