Name: Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Salmonella Typhimurium-haltigen Phagosomen aus Makrophagen mit Biotin-Streptavidin-Beschichtung. Diese zugängliche Methode ermöglicht Studien zur Phagosomenreifung und Immunantwort.

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Forschung in der Robinson Lab wird unterstützt durch Mittel aus Köln-Exzellenz-Cluster auf zelluläre Stressreaktionen im Aging-Associated Krankheiten, Universität zu Köln, Deutschland (CECAD; gefördert durch die DFG im Rahmen der Exzellenzinitiative des Bundes und staatliche Regierungen) und Zuschüsse aus der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune und Maria Pesch-Stiftung der Universität zu Köln.

alle Schritte, die die Verwendung von pathogenen S. Typhimurium muss in einem BSL-2 oder höhere biologische Sicherheit Ebene Anlage durchgeführt werden. Die Kultur und die Beschichtung von S. Unter einem Laminar-Flow-Haube um Kontaminationen zu vermeiden muss Typhimurium sowie die Infektion des Knochenmarks abgeleitet Makrophagen (BMDMs) durchgeführt werden. Die Isolation der S. Typhimurium-mit Phagosom durchgeführt werden kann, auf jedem Labortisch BSL-2.
 die Gewinnung von Knochenmark von Mäusen für seine Differenzierung in Makrophagen war in Übereinstimmung mit Richtlinien im Bereich des Tierschutzes durchgeführt und genehmigt von der Nordrhein-Westfälischen Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt und dieser (LANUV) Nordrhein-Westfalen; AZ.: 84-02.05.40.14.082 und 84-02.04.2015.A443] und der Universität zu Köln.
 1. Culturing S. Typhimurium <ol><li>Impfung S. typhimurium (SL1344 Stamm) aus einer einzigen bakterielle Kolonie in 5 mL des Gehirns Herz Infusion (BHI) Brühe mit einer bakteriellen Schleife.</li>
	<li>Brüten die Bakteriensuspension in einem Inkubator bei 37 ° C über Nacht mit zitternden.</li>
	<li>Am folgenden Tag 1 mL der Bakteriensuspension in 19 mL BHI Brühe in einem konischen Kolben und Inkubation bei 37 ° C in einem Inkubator mit zitternden.</li>
	<li>Überwachen die S. Typhimurium Wachstum durch die Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600) mit einem Spektrophotometer. Messungen sollten etwa alle 30 min.</li>
	<li>Bei OD 600 erreicht 1.0, entfernen Sie Bakteriensuspension aus dem Inkubator und Transfer in 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie Bakterien bei 5.400 x g für 15 min bei 4 ° c</li>
	<li>Überstand zu entfernen und erneut in 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Zentrifuge bei 5.400 x g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Bakterien in 4,9 mL sterile PBS.</li>
</ol> 2. Beschichtung von S. Typhimurium mit magnetischen Beads NHS-Biotin/Streptavidin-konjugiert <ol><li>Hinzufügen 100 µL von 10 mg/mL Biotin Lösung (NHS-Biotin in Dimethyl Sulfoxid, DMSO gelöst) frisch zubereitet, um die Bakteriensuspension verknüpfen in der vorherigen Schritt vorbereitet. Verdünnen Sie beispielsweise 5 mg von NHS-Biotin in 0,5 mL sterile DMSO. Mix richtig von oben und unten mehrmals pipettieren.</li>
	<li>Unterteilt den Mix in fünf 1,5 mL Röhrchen.</li>
	<li>Für 2 h bei Raumtemperatur (RT) auf einen Thermoblock mit konstanter Schütteln bei 350 u/min inkubieren.</li>
	<li>Rohre bei 15.000 x g für 10 min bei RT Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
	<li>In 1 mL sterile PBS, Zentrifuge bei 15.000 x g für 10 min bei RT Aufschwemmen und entsorgen des Überstands.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5 zwei weitere Male, um die überschüssiges Biotin Verknüpfung Lösung vollständig zu entfernen.</li>
	<li>Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen das Pellet in 1 mL sterile PBS.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 µL 10 mg/mL Streptavidin konjugiert magnetische Beads-Lösung in einem 1,5 mL-Tube und lassen Sie es auf dem magnetischen Rack für 5 min.</li>
	<li>Entfernen des Lösungsmittels mit einer Pipette, die Streptavidin-konjugiert magnetische Beads-Lösung aus der magnetischen Halterung zu nehmen und mit 1 mL Biotin beschichtet-bakterielle Suspension in Schritt 2.7 vorbereitet Aufschwemmen.</li>
	<li>Inkubation für 1 h bei RT auf einen Thermoblock mit konstanter Schütteln bei 350 u/min.</li>
	<li>Legen Sie die Lösung auf der magnetischen Zahnstange; 5 min warten und dann mit einer Pipette entfernen Bakterien, die nicht an die Wand gehalten haben (halten Sie es in ein Rohr mit der Bezeichnung als &#34; nicht beschichteten Bakterien &#34;). Der Anteil an der Wand des Rohres in Kontakt mit den Magneten ist Biotin/Streptavidin-beschichteten Bakterien.</li>
	<li>Das Rohr mit den beschrifteten Bakterien aus der magnetischen Halterung entfernen und in 1 mL sterile PBS Aufschwemmen.</li>
	<li>Der magnetischen Zahnstange wieder aufsetzen, 5 min warten und die PBS entfernen mit einer Pipette.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.13 und 2.14 zwei weitere Male, um die Bakterien zu entfernen, die nicht mit der Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet werden.</li>
	<li>Nach der letzten Wäsche Aufschwemmen beschichtet-Bakterien in 500 µL steriler PBS und beschriften Sie das Rohr als &#34; Bakterien beschichtet &#34;.</li>
	<li>Zählen die Koloniebildenden Einheiten (KBE) beider &#34; nicht beschichteten Bakterien &#34; und &#34; Bakterien beschichtet &#34; Lösungen durch Ausplattieren Verdünnungsreihen auf Agarplatten BHI. Ca. 2 x 10 8 KBE/mL der beschichteten Bakterien stammen aus 20 mL der ursprünglichen Bakteriensuspension mit OD 600 von 1,0. Halten Sie die beschichtet, bakterieller Aussetzung bei 4 ° C am nächsten Tag verwendet werden, um Makrophagen infizieren.</li>
</ol> 3. Infektion von BDMDs <ol><li>am selben Tag, wenn die Bakterien mit Biotin und Streptavidin konjugiert magnetischen Kügelchen beschichtet, Platte voll differenzierte BMDMs 22 in 6 cm Gerichte bei einer Dichte von 5 x 10 6 Zellen pro Schale.</li>
	<li>Am nächsten Tag, Zentrifugieren beschichtet-bakterielle Aussetzung bei 15.000 x g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Den Überstand zu entfernen und erneut in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einer Konzentration von 10 x 10 6 KBE/mL.</li>
	<li>, Infizieren Makrophagen an einer Vielzahl von Infektionen (MOI) 10, entfernen Sie das Medium aus der BMDMs und 5 mL beschichtet-bakterielle Suspension vorbereitet. Optimale MOI für jeden Zelltyp oder experimentelle Zwecke von isolierten Phagosom beurteilt werden kann.</li>
	<li>Inkubation bei RT für 10 min Phagozytose synchronisieren.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C in einem 5 % CO 2 Inkubator für 30 min, Phagozytose zu initiieren. Andere Zelltypen erfordern unterschiedliche Inkubationszeiten zur Internalisierung der Bakterien zu gewährleisten.</li>
	<li>Der Bakterien-haltigen Medium vom Geschirr entfernen und Waschen der Zellen mit RPMI dreimal nicht verinnerlicht Bakterien entfernen.</li>
	<li>Schließlich fügen Sie 10 mL RPMI mit 10 % FBS und 50 µg/mL Gentamycin nicht phagozytiert Bakterien zu töten.</li>
	<li>Inkubieren der infizierten BMDMs bei 37 ° C mit 5 % CO 2, bis der gewünschte Zeitpunkt. Der gewünschte Zeitpunkt muss nach den Bakterien und Zelltyp verwendet und dem Zweck der Analyse experimentell ermittelt werden. Für die Studie der frühen Phagosom Endosom Fusion Events in S. Typhimurium-infizierten BMDMs, empfiehlt sich eine 30 min Inkubation. Für die Analyse der späteren Ereignisse können nach 2 h oder 4 h Inkubation Phagosom extrahiert werden. Längere Inkubationszeit von Makrophagen mit S. Tod von den Makrophagen führt Typhimurium über 24 h. Intrazelluläre Infektion verlängert, bevor die Phagosom Extraktion wahrscheinlich zu einer Verschlechterung der Biotin-Moleküle führen könnte. Aber wir waren nicht darauf bedacht Verlust von Biotin auf beschichteten Bakterien bis 24 Uhr</li>
</ol> 4. Isolierung von S. Typhimurium-Phagosom mit <ol><li>bereiten Sie das Volumen der erforderlichen Phagosom Isolierung Puffer ein (50-mM-Rohre, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT), eine Endkonzentration von 1 mM, Cytochalasin B, um eine endgültige Konzentration von 10 µM und Protease und Phosphatase-Inhibitoren, wie vom Hersteller empfohlen. 
	Hinweis: DVB-t und Cytochalasin B muss hinzugefügt werden das Phagosom Isolierung Puffer A immer unmittelbar vor dem Gebrauch. Cytochalasin B stört das Zytoskelett den Bruch der Zellmembran zu erleichtern.</li>
	<li>Zum gewünschten Zeitpunkt zeigen, das Medium aus den infizierten Zellen zu entfernen und waschen Sie mit sterilen PBS erwärmt, RT.</li>
	<li>Fügen Sie 750 µL phagosome-Isolierung Puffer A pro Schale und inkubieren Sie 20 min auf Eis. Bei der Verwendung von verschiedenen Zellzahlen sollte das Volumen der Isolierung Puffer A proportional angepasst werden.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL Phagosom Isolierung Puffer B (50-mM-Rohre, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol und 68 mM Saccharose). Rocken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass der Puffer die gesamte Oberfläche der Schale erreicht. Bei der Verwendung von verschiedenen Zellzahlen sollte das Volumen der Isolierung Puffer B proportional angepasst werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zellen aus der Schale durch vorsichtig abkratzen mit einem Kautschuk-Polizisten und übertragen Sie sie auf einem vorgekühlt 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Die Zellsuspension durchlaufen eine 26G-Nadel mit einer 1 mL Spritze mindestens 15 Mal (eine Aspiration plus ein Auswurf der Aussetzung Zellzahlen als einmal). Dies ist genug, um die cytosolische Inhalte von BMDMs freizugeben. Die Anzahl der Durchläufe durch die Nadel muss für jeden Zelltyp optimiert werden.</li>
	<li>Legen die Zellsuspension auf dem magnetischen Rack und 5 min warten. Die Partikel an den Magneten befestigt sind die Phagosom mit beschichteten - S. Typhimurium. Die Suspension enthält den Rest der Zellkomponenten.</li>
	<li>Übertragen die Suspension in einem 1,5 mL Röhrchen beschriftet als &#34; Zytosol &#34;.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr mit der isolierten Phagosom aus der magnetischen Rack und ihnen in 1 mL sterile PBS Aufschwemmen.</li>
	<li>Legen die Phagosom Aussetzung der magnetischen Zahnstange, 5 min warten und entfernen die PBS.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.9 und 4.10 zu isolierten S. waschen Typhimurium-mit Phagosom.</li>
	<li>Endlich die PBS zu entfernen und Aufschwemmen der Phagosom in den erforderlichen Puffer; z. B. in einem Tests (RIPA) Testpuffer für Proteinanalytik. Ca. 50-200 µg des Proteins ergibt sich pro Probe nach diesem Protokoll abhängig von den ursprünglichen Betrag von Zellen und das MOI Infektion.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine neue Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert wird hier beschrieben. Nach sanften Unterbrechung der Zellmembran können Bakterien-haltigen Phagosom leicht mit einem magnetischen Rack extrahiert werden. Wir zeigen, dass die Kennzeichnung der Bakterien die Fähigkeit des Erregers induzieren Entzündungen bewahrt und ändert nichts an der phagocytic Eigenschaft der Wirtszelle. Wichtig ist, Phago...

Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-1.
Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesikel genannt Phagosom enthalten. Durch eine Reihe von Kernfusion und Kernspaltung Veranstaltungen mit anderen Vesikel wie Endosomen und Lysosomen erwirbt die Erreger-haltigen Phagosom eine Reihe von Proteinen, die für die Beseitigung des phagosomal Inhalts erforderlich. Daher ist die enzymatische Zusammensetzung der Phagosom im Laufe dieses Prozesses, bekannt als Phagosom Reifung2sehr variabel.
Kurz nach der Phagozytose, Multimeric, die komplexe vacuolar ATPase (V-ATPase) durch Fusion mit Endosomen3Phagosom Membran integriert ist. Die Anlage nutzt ATP zu Pumpe Protonen aus dem Zytosol in das Lumen der Phagosom4. Versauerung der Phagosom ist unerlässlich für die Fusion-Veranstaltungen mit anderen Vesikel5 und für die Aktivierung einer großen Anzahl von pH-abhängigen abbauende Enzyme6. Ein weiterer Multimeric enzymatischen Komplex, die schnell auf der Membran Phagosom montiert ist ist der NADPH-Oxidase (NOX) Komplex. Komplexe NOX oxidiert NADPH um reaktive Sauerstoffspezies (ROS), werden in das Phagosom Lumen abgesondert und, die wesentlich dazu beitragen, die Tötung der verschlungen Mikroorganismen7,zu produzieren.
Während die ersten Schritte der Reifung präsentieren Phagosom Marker in der Regel wie Rab5 und Rab7 der frühen und späten Endosomen bzw. zusammen mit der V-0 -Untereinheit des V-ATPase8. Fusion von Phagosom mit Lysosomen und späten Endosomen führt die Belichtung der phagocytized Erreger, eine Vielzahl von hydrolytische Enzyme wie Cathepsin Proteasen, Lipasen und β-Galaktosidase9. Versauerung des lumens ist auch erforderlich für die Aktivierung dieser Enzyme. Beispielsweise ist die Spaltung von Cathepsin D, die aktive Kurzform zu produzieren pH-abhängigen10. Diese Enzyme erniedrigen den Erreger und vermitteln die Herstellung von Pathogen-abgeleitete kurze Peptide, die durch die Makrophagen große Histocompatibility Komplexes (MHC) Klasse II Moleküle auf T-Zellen eine adaptive Immunantwort11auslösen dargestellt werden.
Daher Phagosom Reifung ist entscheidend für die angeborene Immunantwort und verbindet die angeborene und adaptive Waffen des Immunsystems. Es ist keine Überraschung, dass die Erreger Strategien zur Beseitigung von Makrophagen durch den oben beschriebenen Prozess der Reifung Phagosom Überwindung entwickelt haben. Beispielsweise verhindert die intrazellulären Bakterien Mycobacterium Tuberculosis und Legionella Pneumophila Phagosom Reifung durch hemmende V-ATPase Montage- und konsequente Lumen Versauerung12,13 . Andere Bakterien wie Listeria Monocytogenes oder Shigella Flexneri induzieren Porenbildung in der Phagosom Membran in die Zellflüssigkeit14,15zu entkommen. Auf der anderen Seite, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium (S. Typhimurium) zum Ändern der Eigenschaften von Phagosom in die Vakuole, es in einen geeigneten Standort für ihre Replikation16verwandeln kann. Diese Fähigkeit macht S. Typhimurium ein sehr interessantes Modell Erreger-vermittelte Störungen von Phagosom Reifung zu studieren.
S. Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien werden schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthaltenen Phagosom17. Einige Berichte haben, dass S. oben beschrieben. Typhimurium-enthaltenden Phagosom präsentieren Hersteller für Endosomen und Lysosomen18, und andere Studien ergaben Phagosom-Lysosomen Fusion verhindert auf S. Typhimurium Infektion19.
Zunächst Phagosom Reifung auf S. Typhimurium Infektion ist durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht worden. Die Entwicklung von Techniken für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ermöglichte eine genauere Studie über das Phagosom Inhalte in Bezug auf Endosom und Lysosomen Marker. Bis heute ist die main-Methode verwendet für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ist der subzellulären Fraktionierung auf Saccharose Schritt Steigungen18,20. Diese Methode erfordert jedoch mehrere Zentrifugation Schritte, die Phagosom mechanische beschädigen können, beeinflussen die Stabilität der phagosomal Komponenten (Proteine und Lipide) und nimmt Zeit in Anspruch. Darüber hinaus erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge: ein Stück von Spezialausrüstungen, die nicht für jedes Labor zugänglich ist.
Vor kurzem ein neuer Ansatz zur Isolierung der Bakterien-haltigen angewendet wurde Phagosom, in denen bakterielle Erreger mit biotinylierte Lipopetide (Lipobiotin) und später beschriftet sind mit Streptavidin-konjugiert magnetische Beads21 extrahiert . Wir schlagen eine alternative komplementäre Methode durch bakterielle Oberfläche Amin-haltigen Makromoleküle mit NHS-Biotin labeling von Streptavidin konjugiert magnetische Beads gefolgt. Phagosom erhalten durch diese Methode sind hochangereichertes im Endosom und Lysosomen Marker und können für eine breite Palette von Assays aus Protein-Analyse, Analyse der Omics verwendet werden. Darüber hinaus erfordert es keine Spezialausrüstung wie Ultrazentrifugen. Darüber hinaus werden durch den Wegfall der Zentrifugation Schritte, die mechanische Beschädigung Phagosom und der Höhe der Zeit beschäftigt erheblich reduziert. Diese Methode kann leicht für die Isolierung von Phagosom mit anderen Bakterien, wie z. B. die grampositive Staphylococcus Aureus, ebenfalls in dieser Handschrift angepasst werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist eine einfache, kostengünstige, und weniger zeitaufwändig als die klassische Trennung von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation, Rendern sehr bereichert Bakterien-haltigen Phagosom.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL oder DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spektralphotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bakterienschleife (10&micro; l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-Aktin-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rab5 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rab7 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1)-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cathepsin-D-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-Calnexin-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von salmonella typhimurium-mit phagosom von makrophagen

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien sind schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthielt in Vesikel genannt Phagosom um abgebaut werden. Isolierung von S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom studieren verbreitet wie S. Typhimurium Infektion verändert den Prozess der Reifung Phagosom, bakteriellen Abbau zu verhindern. Klassisch, die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom von Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung durchgeführt wurde. Aber dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein gewisses Maß an Geschicklichkeit. Hier ist eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit magnetischen Beads Biotin-Streptavidin-konjugiert. Phagosom erhalten durch diese Methode können in jeder Puffer der Wahl, so dass die Verwendung von isolierten Phagosom für ein breites Spektrum von Assays, wie Eiweiß, Metaboliten und Lipid-Analyse ausgesetzt werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist spezifisch, effizient, schnell, erfordert eine minimale Ausstattung und ist vielseitiger als die klassische Methode der Isolation von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation.

Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom durch dieses Protokoll erfordert die Biotinylierungen der Bakterien als ein erster Schritt. Wir beurteilen daher die Wirksamkeit von S. Typhimurium Biotinylierungen durch Analyse der konfokalen Mikroskopie der BMDMs infiziert mit biotinylierte mCherry -S. Typhimurium mit Cy5-Streptavidin beschriftet. Kurz, BMDMs infiziert wurden, wie in diesem Protokoll mit mCherry -Sbeschrieben. Typhimurium z...

Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intakte und angereicherte Bakterien, die Phagosomen enthalten, zu isolieren. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, wie z.B. Veränderungen der Phagosomenreifung und der Antigenverarbeitung, wenn pathogene Mikroorganismen in Wirtszellen eindringen. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie mit einfachen Schritten und ohne die Notwendigkeit spezieller Geräte qualitativ hochwertige Bakterien produziert, die Phagosomen enthalten.Personen, die mit der Methode noch nicht vertraut sind, würden sie im Vergleich zu den Nicht-Methoden technisch zugänglich finden. Die Idee, diese Methode zu entwickeln, hatten wir erst, als wir die Mechanismen untersuchten, mit denen intrazelluläre Krankheitserreger die Phagosomen zu ihrem Vorteil kapern. Dieses Verfahren wird von Saray Gutierrez, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert.Um die Salmonella Typhimurium-Kultur zu starten, verwenden Sie eine Bakterienschlaufe, um eine einzelne Bakterienkolonie in 5 Milliliter Gehirn-Herz-Infusionsbrühe zu impfen. Dann inkubieren Sie die Suspension über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator unter Schütteln. Am nächsten Tag wird ein Milliliter dieser Bakteriensuspension in 19 Milliliter BHI-Brühe in einem Erlenmeyerkolben überführt.Erneut im 37 Grad Celsius heißen Inkubator unter Schütteln inkubieren. Wenn der OD600 einen erreicht, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und geben Sie die Kultur in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 5400 x G bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten.Nach Entfernen des Überstands wird das Bakterienpellet in 10 Milliliter sterilem PBS wieder suspendiert. Nachdem Sie die Zentrifugation einmal wiederholt haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in 4,9 Millilitern PBS. Als nächstes fügen Sie der Bakteriensuspension 100 Mikroliter frisch zubereitete Biotin-Bindelösung hinzu.Nachdem Sie diese Suspension in fünf 1,5-Milliliter-Röhrchen aufgeteilt haben, inkubieren Sie sie in einem thermischen Block bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 350 U/min für zwei Stunden. Nachdem die Röhrchen zehn Minuten lang bei 15.000 x G bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden, wird der Überstand verworfen. Nach zwei weiteren Zentrifugationsschritten und vollständiger Entfernung der Biotin-Verknüpfungslösung resuspendieren Sie diese Biotin-kodierten Bakterien in einem sterilen PBS von einem Milliliter in einem einzigen 1,5-Milliliter-Röhrchen.Übertragen Sie 100 Mikroliter Streptavidin-konjugierte magnetische Kügelchenlösung in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Sie es für fünf Minuten in ein Magnetgestell. Nachdem Sie das Lösungsmittel aus dem Röhrchen entfernt haben, nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell. Suspendieren Sie dann die Kügelchen, die in der Tube verblieben sind, mit einem Milliliter Biotin-kodierter Bakteriensuspension.Inkubieren Sie das Röhrchen auf einem Thermoblock bei Raumtemperatur für eine Stunde und schütteln Sie es bei 350 U/min. Legen Sie dann das Rohr für fünf Minuten auf das Magnetgestell. Verwenden Sie eine Pipette, um die Bakterien zu entfernen, die nicht an der Wand haften, und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen, das mit nicht kodierten Bakterien beschriftet ist.Das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen, die an der Wand haften, enthält Biotin Streptavidin-kodierte Bakterien. Nehmen Sie das Röhrchen mit den Biotin Streptavidin-kodierten Bakterien aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie es erneut in einem Milliliter sterilem PBS. Nachdem die Röhre fünf Minuten lang auf dem Magnetgestell gelegen hat, entfernen Sie das PBS.Zum Schluss suspendieren Sie die gewaschenen Biotin Streptavidin-kodierten Bakterien in 500 Mikrolitern sterilem PBS erneut und markieren Sie das Röhrchen als codierte Bakterien. Am Tag vor der Infektion wurden die vollständig differenzierten BMDMs in einer sechs Zentimeter großen Schale in RPMIs mit zehn Prozent FBS ergänzt. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie die kodierte Bakteriensuspension bei 15.000 x G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Nach dem Entfernen des Überstands wird das Bakterienpellet in RPMI-Medium, das mit zehn Prozent FBS ergänzt ist, wieder suspendiert. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und fügen Sie fünf Milliliter codierte Bakteriensuspension in RPMI-Medium hinzu, um die Zellen zu infizieren. Um die Phagozytose zu synchronisieren, inkubieren Sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur.Um die Phagozytose einzuleiten, inkubieren Sie dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium aus dem Geschirr und waschen Sie die Zellen dreimal bei RPMI, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen. Zur Abtötung von nicht phagozytierten Bakterien bei zehn Millilitern RPMI, die zehn Prozent FBS in 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin enthalten.Zum Schluss inkubieren Sie die infizierten BMDMs bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid bis zum gewünschten Zeitpunkt. Bereiten Sie zunächst das Volumen des erforderlichen Phagosomen-Isolationspuffers A vor, indem Sie kurz vor der Verwendung DTT und Cytochalasin B sowie Protease- und Phosphatasehemmer hinzufügen, wie vom Hersteller empfohlen. Entfernen Sie das Medium zum gewünschten Zeitpunkt von den infizierten Zellen und waschen Sie die Zellen mit sterilem, auf Raumtemperatur vorgewärmtem PBS.Geben Sie dann 750 Mikroliter Phagosome Isolation Buffer A in die Schale und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang auf Eis. Denken Sie daran, den Teller gelegentlich zu rocken. Fügen Sie als Nächstes 250 Mikroliter Phagosomen-Isolationspuffer B hinzu und rocken Sie dann die Platten, um sicherzustellen, dass der Puffer die Oberfläche vollständig bedeckt.Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Gummipolizisten aus der Schale und geben Sie sie in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Zellsuspension mindestens 15 Mal durch eine 26-Gauge-Nadel zu führen. Legen Sie anschließend die Zellenaufhängung für fünf Minuten auf das Magnetgestell.Bei den an die magnetischen Kügelchen gebundenen Partikeln handelt es sich um Phagosomen, die kodiertes S.Typhimurium enthalten. Übertragen Sie dann die Suspension, die den Rest der zellulären Komponenten enthält, in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung Cytosol. Nehmen Sie das Röhrchen mit den isolierten Phagosomen aus dem Gestell und suspendieren Sie es erneut in einem Milliliter sterilem PBS.Legen Sie das Rohr für fünf Minuten wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie dann das PBS. Nachdem Sie dieses Waschen einmal mit PBS wiederholt haben, entfernen Sie das PBS und suspendieren Sie schließlich S.Typhimurium, das Phagosomen enthält, wieder in den erforderlichen Puffer. Um die Wirksamkeit der S.Typhimurium-Biotinylierung durch konfokale Mikroskopie zu beurteilen, wurden BMDMs mit mCherry S.Typhimurium infiziert, das mit Biotin markiert war.Nach Fixierung und Inkubation mit Cy5-Streptavidin wurde die erfolgreiche Biotinylierung durch das Cy5-Streptavidin-Fluoreszenzsignal bestätigt. Dieses Signal wurde ausschließlich in biotinyliertem mCherry S.Typhimurium beobachtet, während es bei nicht biotinyliertem mCherry S.Typhimurium kein Signal gab. Die Immunblockanalyse isolierter Phagosomen zeigte eine signifikante Anreicherung von mCherry-exprimierendem S.Typhimurium in Phagosomen im Vergleich zur zytosolischen Fraktion.Die Immunblockanalyse mit Endosomen- und Lysosomenmarkern in isolierten Phagosomen zeigte eine Anreicherung der getesteten Marker in isolierten Phagosomen vier Stunden nach der Infektion im Vergleich zu 30 Minuten nach der Infektion. Bei der Anwendung dieses Protokolls auf Staphylococcus aureus wurde eine erfolgreiche Biotinylierung von GFP-exprimierendem S.aureus gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa eineinhalb Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Inkubationszeit, die der Untersucher für die Infektion wählt.Um den Erfolg der Isolierung von Phagosomen-haltigen Bakterien zu gewährleisten, stellen Sie bitte sicher, dass die Puffer die angegebenen Konzentrationen enthalten und dass die Platten gerockt werden, um eine homogene Abdeckung der Zellen zu gewährleisten. Seien Sie auch vorsichtig beim Schaben der Zellen und beim Passieren der Zellsuspension durch die Nadel. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie Proteomik oder Metabolomik mit isolierten Phagosomen durchgeführt werden, um Veränderungen zu untersuchen, die durch Krankheitserreger unter Beteiligung pathogener Faktoren verursacht werden.

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Gutiérrez, S., et. al., Isolierung von Salmonella typhimurium-haltigen Phagosomen aus Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Kultivierung und Aufbereitung von Salmonella typhimurium , um eine saubere, stoffwechselaktive Bakteriensuspension zu erhalten, die für den experimentellen Einsatz geeignet ist.

Vorbereitung der Salmonella typhimurium-Kultur

Quelle: Sigal, N., et al. RNA-Reinigung aus intrazellulär gezüchteten Listeria monocytogenes in Makrophagenzellen.  J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video demonstriert die Isolierung internalisierter pathogener Bakterien aus infizierten Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs). Bakterien dürfen sich an Wirtszellen anheften, und ungebundene Bakterien werden weggespült. Nach der Internalisierung wird ein Antibiotikum hinzugefügt, um nicht internalisierte Bakterien zu beseitigen. Die Wirtszellen...

Isolierung intrazellulärer pathogener Bakterien aus infizierten Wirtszellen

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung von zytosolischem und vakuolärem Salmonella typhimurium in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mittels differentieller Permeabilisierung. Die Makrophagen sind mit einer fluoreszierenden Protein-exprimierenden Salmonelle infiziert, die in einer spezialisierten Vakuolenstruktur namens Salmonellen-haltige Vakuole oder SCV internalisiert ist. Eine Untergruppe von Bakterien entkommt dem SCV und dringt in das Zytosol ein. Die cholesterinreiche...

Ein Assay zur Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonellen in infizierten primären Makrophagen

Dieses Video zeigt eine hochauflösende Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopietechnik (TIRF) zur Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenbildung und des Verschlusses während der Makrophagen-vermittelten Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen (RBCs), die an der Oberfläche einer Glasbodenschale befestigt sind. Die Makrophagen dehnen Pseudopodien um die Erythrozyten aus und umhüllen sie in den Phagosomen, wodurch sie sich von der Glasoberfläche lösen.

TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Isolierung von Maus-Peritonealmakrophagen. Diesem Verfahren folgt eine RNA-Extraktion, um eine Genexpressionsanalyse bei der Stimulation von Toll-like-Rezeptoren durchzuführen.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

Wir beschreiben die Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose mit verstärkten grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden Escherichia colizu beurteilen.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

Bakteriophagen, die auf der Erde allgegenwärtig und vielfältig sind, infizieren und vermehren sich in bakteriellen Wirten und spielen eine entscheidende Rolle in mikrobiellen Ökosystemen. Trotz ihrer Bedeutung kann ihr Vorhandensein industrielle Prozesse stören. Wir haben eine Methode entwickelt, bei der bakterielle Lipopolysaccharide verwendet werden, um Bakteriophagen aus Salmonellenkulturen zu eliminieren.

Entfernung von Bakteriophagen aus infizierten Salmonellenkulturen

Lernen Sie die Isolierung von Salmonella Typhimurium-haltigen Phagosomen aus Makrophagen mit Biotin-Streptavidin-Beschichtung. Diese zugängliche Methode ermöglicht Studien zur Phagosomenreifung und Immunantwort.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

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