Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intakte und angereicherte Bakterien, die Phagosomen enthalten, zu isolieren. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, wie z.B. Veränderungen der Phagosomenreifung und der Antigenverarbeitung, wenn pathogene Mikroorganismen in Wirtszellen eindringen. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie mit einfachen Schritten und ohne die Notwendigkeit spezieller Geräte qualitativ hochwertige Bakterien produziert, die Phagosomen enthalten.

Personen, die mit der Methode noch nicht vertraut sind, würden sie im Vergleich zu den Nicht-Methoden technisch zugänglich finden. Die Idee, diese Methode zu entwickeln, hatten wir erst, als wir die Mechanismen untersuchten, mit denen intrazelluläre Krankheitserreger die Phagosomen zu ihrem Vorteil kapern. Dieses Verfahren wird von Saray Gutierrez, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert.

Um die Salmonella Typhimurium-Kultur zu starten, verwenden Sie eine Bakterienschlaufe, um eine einzelne Bakterienkolonie in 5 Milliliter Gehirn-Herz-Infusionsbrühe zu impfen. Dann inkubieren Sie die Suspension über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator unter Schütteln. Am nächsten Tag wird ein Milliliter dieser Bakteriensuspension in 19 Milliliter BHI-Brühe in einem Erlenmeyerkolben überführt.

Erneut im 37 Grad Celsius heißen Inkubator unter Schütteln inkubieren. Wenn der OD600 einen erreicht, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und geben Sie die Kultur in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 5400 x G bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten.

Nach Entfernen des Überstands wird das Bakterienpellet in 10 Milliliter sterilem PBS wieder suspendiert. Nachdem Sie die Zentrifugation einmal wiederholt haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in 4,9 Millilitern PBS. Als nächstes fügen Sie der Bakteriensuspension 100 Mikroliter frisch zubereitete Biotin-Bindelösung hinzu.

Nachdem Sie diese Suspension in fünf 1,5-Milliliter-Röhrchen aufgeteilt haben, inkubieren Sie sie in einem thermischen Block bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 350 U/min für zwei Stunden. Nachdem die Röhrchen zehn Minuten lang bei 15.000 x G bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden, wird der Überstand verworfen. Nach zwei weiteren Zentrifugationsschritten und vollständiger Entfernung der Biotin-Verknüpfungslösung resuspendieren Sie diese Biotin-kodierten Bakterien in einem sterilen PBS von einem Milliliter in einem einzigen 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Übertragen Sie 100 Mikroliter Streptavidin-konjugierte magnetische Kügelchenlösung in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Sie es für fünf Minuten in ein Magnetgestell. Nachdem Sie das Lösungsmittel aus dem Röhrchen entfernt haben, nehmen Sie das Röhrchen aus dem Magnetgestell. Suspendieren Sie dann die Kügelchen, die in der Tube verblieben sind, mit einem Milliliter Biotin-kodierter Bakteriensuspension.

Inkubieren Sie das Röhrchen auf einem Thermoblock bei Raumtemperatur für eine Stunde und schütteln Sie es bei 350 U/min. Legen Sie dann das Rohr für fünf Minuten auf das Magnetgestell. Verwenden Sie eine Pipette, um die Bakterien zu entfernen, die nicht an der Wand haften, und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen, das mit nicht kodierten Bakterien beschriftet ist.

Das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen, die an der Wand haften, enthält Biotin Streptavidin-kodierte Bakterien. Nehmen Sie das Röhrchen mit den Biotin Streptavidin-kodierten Bakterien aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie es erneut in einem Milliliter sterilem PBS. Nachdem die Röhre fünf Minuten lang auf dem Magnetgestell gelegen hat, entfernen Sie das PBS.

Zum Schluss suspendieren Sie die gewaschenen Biotin Streptavidin-kodierten Bakterien in 500 Mikrolitern sterilem PBS erneut und markieren Sie das Röhrchen als codierte Bakterien. Am Tag vor der Infektion wurden die vollständig differenzierten BMDMs in einer sechs Zentimeter großen Schale in RPMIs mit zehn Prozent FBS ergänzt. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie die kodierte Bakteriensuspension bei 15.000 x G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Nach dem Entfernen des Überstands wird das Bakterienpellet in RPMI-Medium, das mit zehn Prozent FBS ergänzt ist, wieder suspendiert. Entfernen Sie das Medium aus den BMDMs und fügen Sie fünf Milliliter codierte Bakteriensuspension in RPMI-Medium hinzu, um die Zellen zu infizieren. Um die Phagozytose zu synchronisieren, inkubieren Sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur.

Um die Phagozytose einzuleiten, inkubieren Sie dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium aus dem Geschirr und waschen Sie die Zellen dreimal bei RPMI, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen. Zur Abtötung von nicht phagozytierten Bakterien bei zehn Millilitern RPMI, die zehn Prozent FBS in 50 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin enthalten.

Zum Schluss inkubieren Sie die infizierten BMDMs bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid bis zum gewünschten Zeitpunkt. Bereiten Sie zunächst das Volumen des erforderlichen Phagosomen-Isolationspuffers A vor, indem Sie kurz vor der Verwendung DTT und Cytochalasin B sowie Protease- und Phosphatasehemmer hinzufügen, wie vom Hersteller empfohlen. Entfernen Sie das Medium zum gewünschten Zeitpunkt von den infizierten Zellen und waschen Sie die Zellen mit sterilem, auf Raumtemperatur vorgewärmtem PBS.

Geben Sie dann 750 Mikroliter Phagosome Isolation Buffer A in die Schale und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang auf Eis. Denken Sie daran, den Teller gelegentlich zu rocken. Fügen Sie als Nächstes 250 Mikroliter Phagosomen-Isolationspuffer B hinzu und rocken Sie dann die Platten, um sicherzustellen, dass der Puffer die Oberfläche vollständig bedeckt.

Kratzen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Gummipolizisten aus der Schale und geben Sie sie in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, um die Zellsuspension mindestens 15 Mal durch eine 26-Gauge-Nadel zu führen. Legen Sie anschließend die Zellenaufhängung für fünf Minuten auf das Magnetgestell.

Bei den an die magnetischen Kügelchen gebundenen Partikeln handelt es sich um Phagosomen, die kodiertes S.Typhimurium enthalten. Übertragen Sie dann die Suspension, die den Rest der zellulären Komponenten enthält, in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung Cytosol. Nehmen Sie das Röhrchen mit den isolierten Phagosomen aus dem Gestell und suspendieren Sie es erneut in einem Milliliter sterilem PBS.

Legen Sie das Rohr für fünf Minuten wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie dann das PBS. Nachdem Sie dieses Waschen einmal mit PBS wiederholt haben, entfernen Sie das PBS und suspendieren Sie schließlich S.Typhimurium, das Phagosomen enthält, wieder in den erforderlichen Puffer. Um die Wirksamkeit der S.Typhimurium-Biotinylierung durch konfokale Mikroskopie zu beurteilen, wurden BMDMs mit mCherry S.Typhimurium infiziert, das mit Biotin markiert war.

Nach Fixierung und Inkubation mit Cy5-Streptavidin wurde die erfolgreiche Biotinylierung durch das Cy5-Streptavidin-Fluoreszenzsignal bestätigt. Dieses Signal wurde ausschließlich in biotinyliertem mCherry S.Typhimurium beobachtet, während es bei nicht biotinyliertem mCherry S.Typhimurium kein Signal gab. Die Immunblockanalyse isolierter Phagosomen zeigte eine signifikante Anreicherung von mCherry-exprimierendem S.Typhimurium in Phagosomen im Vergleich zur zytosolischen Fraktion.

Die Immunblockanalyse mit Endosomen- und Lysosomenmarkern in isolierten Phagosomen zeigte eine Anreicherung der getesteten Marker in isolierten Phagosomen vier Stunden nach der Infektion im Vergleich zu 30 Minuten nach der Infektion. Bei der Anwendung dieses Protokolls auf Staphylococcus aureus wurde eine erfolgreiche Biotinylierung von GFP-exprimierendem S.aureus gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa eineinhalb Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Inkubationszeit, die der Untersucher für die Infektion wählt

Um den Erfolg der Isolierung von Phagosomen-haltigen Bakterien zu gewährleisten, stellen Sie bitte sicher, dass die Puffer die angegebenen Konzentrationen enthalten und dass die Platten gerockt werden, um eine homogene Abdeckung der Zellen zu gewährleisten. Seien Sie auch vorsichtig beim Schaben der Zellen und beim Passieren der Zellsuspension durch die Nadel. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie Proteomik oder Metabolomik mit isolierten Phagosomen durchgeführt werden, um Veränderungen zu untersuchen, die durch Krankheitserreger unter Beteiligung pathogener Faktoren verursacht werden.