Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Gewinnung von NK- oder T-Zelllinien von CAEBV-Patienten, was für die Erforschung dieser tödlichen Krankheit von großer Bedeutung ist. Diese Methode hilft bei der Gewinnung von NK- oder T-Zelllinien für die Erforschung des Mechanismus von CAEBV, wie z. B. die Untersuchung des rohen VBV auf die Zellproliferation, das Screening von Inhibitoren, die die NK/T-Zellproliferation beeinträchtigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr einfach und effizient ist und nur eine kleine Menge an peripherem Blut und eine niedrige Dosis Eisen zwei benötigt, um NK- oder T-Zelllinien von CAEBV-Patienten zu etablieren.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Überleben der Zellen in der ersten von zwei Wochen der Kultur ungewiss ist und diese Methode Ihnen zeigt, wie Sie die Zellproliferation der frühen Kultur bestimmen können. Als wir die Idee für diese Methode hatten, stellten wir fest, dass menschliches Serumeisen zwei PBMC für bis zu zwei Wochen enthalten kann. Wir haben gezeigt, dass die Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da sie die Form der Zellen und die Ursache der Proliferation zeigt.

Und diese Erweiterung der Zellen und die Nummerierung der Y-Bar-Zellen Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie primäres PBMC aus zwei Millilitern Vollblut von CAEBV-Patienten durch Gradientenzentrifugation. Alternativ können Sie kryokonserviertes PBMC aus flüssigem Stickstoff mit RPMI-1640-Medium auftauen. Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu 18 Mikrolitern Zellsuspension hinzu, um die Zellen drei Minuten lang zu färben, dann übertragen Sie die Suspension auf die Zellzählerplatte und messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit der Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.

Bereiten Sie die Zellsuspension mit einer Dichte von zwei bis drei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter vor, ergänzt mit vollständigem RPMI-1640-Kulturmedium mit 20 % Humanserum, zwei Millimolaren L-Glutamin und Antibiotika. Anschließend wird ein Milliliter PBMC-Suspension pro Vertiefung in die 24-Well-Zellkulturplatten gesät. Geben Sie anschließend 150 Einheiten pro Milliliter rhIL-2 in jede Vertiefung

Stellen Sie die Kulturplatten in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie am zweiten Tag die Zellmorphologie unter einem Mikroskop mit 200-facher Vergrößerung. Die Zellen sind in gutem Zustand, wenn sie hell und rund sind.

In diesem Schritt fügen Sie zwei Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu 18 Mikrolitern Zellsuspension hinzu und berechnen die Konzentration der Zellen. Beobachten Sie als Nächstes die Zellmorphologie und überwachen Sie den Zustand des Zellwachstums, indem Sie die Zellen nummerieren, bevor Sie das Medium wechseln. Es ist wichtig, die Zellmorphologie und den Zustand zu überwachen.

Ob die Zellen überleben, können wir anhand der polymorphen Zellen und des Zustands der Zellen in einem frühen Stadium einer Kultur beurteilen. Entfernen Sie anschließend 500 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter frisches vollständiges Kulturmedium hinzu. Geben Sie dann 150 Einheiten pro Milliliter rhIL-2 in jede Vertiefung

Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche. Zeichnen Sie die Zellwachstumskurve. Wenn die Konzentration lebensfähiger Zellen das Fünffache von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter übersteigt, teilen Sie die Zellen in neue Vertiefungen mit einer Konzentration von ein bis zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in jeder Vertiefung

Dieser Prozess dauert zwei bis vier Wochen. Wenn sich die Zellen ausgebreitet haben, sammeln Sie eine mal 10 bis sechs Zellen, um die Phänotypen der Zelllinien zu bestimmen. Zentrifugieren Sie sie bei 240 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die NKNT-Zellen auszufällen.

Danach den Überstand entsorgen und den Niederschlag durch Zugabe von sieben Millilitern PBS waschen. Zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 240 g bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal, geben Sie dann 200 Mikroliter Humanserum in jedes Röhrchen, mischen Sie gut und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 240-mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit kaltem PBSA. Teilen Sie anschließend die Zellen in fünf Röhrchen auf, die jeweils zwei mal 10 bis fünf Zellen enthalten. Danach zentrifugieren Sie die Zellen bei 240 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen erneut mit PBSA-Puffer oder PBSA, der 10 Mikroliter PE und 10 Mikroliter FITC-markierte Antikörper enthält, um Zellrezeptoren von T- oder NK-Zellen auf Eis zu färben.

Mit PBSA-Puffer suspendierte Zellen werden als Negativkontrolle verwendet. Inkubieren Sie anschließend die Zellen mit Antikörpern für 20 bis 30 Minuten auf Eis im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBSA und suspendieren Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern kaltem PBSA erneut, bevor Sie mit dem Durchflusszytometer analysiert werden.

Wenn die Analyse des Zellphänotyps abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Hälfte des Überstands und vermeiden Sie es, die Zellen am Boden der Platte zu berühren. Geben Sie das gleiche Volumen an frischem Kulturmedium, das rhIL-2 in einer Menge von 300 Einheiten pro Milliliter enthält, auf die Platten und wechseln Sie dann alle drei Tage die Hälfte des Mediums, bis die Zellcluster unter dem Mikroskop deutlich sichtbar sind. Übertragen Sie danach die Zellen von den 24-Well-Platten in T-25-Kulturflaschen, nachdem Sie verschiedene Wells derselben Linie gemischt haben.

Verdoppeln Sie das Volumen des Nährmediums, wenn es gelb wird, bis sich das Volumen des Mediums auf 10 bis 15 Milliliter ausdehnt. Fügen Sie anschließend rhIL-2 mit einer Konzentration von 150 Einheiten pro Milliliter hinzu. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden vor dem Einfrieren nach zwei bis drei Wochen Wachstum, wenn die Zellmasse mit bloßem Auge beobachtet werden kann.

Messen Sie die Zellkonzentration mit dem Zellzähler. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 240-mal g und suspendieren Sie das Zellpellet bei einer Dichte von fünf bis 10 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit der gefrorenen Stammlösung, die 90 % fötales Rinderserum und 10 % DMSO enthält. Frieren Sie es bei einer Geschwindigkeit von einem Grad Celsius pro Minute auf minus 80 Grad Celsius ein und geben Sie es dann direkt in flüssigen Stickstoff.

Nach dreitägiger Kultivierung während der Etablierung von Zelllinien beginnen die polymorphen Zellen zu erscheinen. Nach sieben Tagen wachsen die Zellen schnell, da sowohl die Anzahl als auch die Lebensfähigkeit der Zellen mit hoher Geschwindigkeit zunahmen. Kleine Zellcluster sind nach 10 bis 14 Tagen Wachstum deutlich sichtbar, wenn die Zellkonzentration das Drei- bis Sechsfache des Sechstels übersteigt.

In dieser Zeit sollten die Zellen durch Teilung in zwei oder drei Vertiefungen der Kulturplatte expandiert werden. Etwa einen Monat später, wenn die Zellzahl das Drei- bis Fünffache von 10 bis zum Siebtel erreicht, ist die Anzahl hoch genug für die Konservierung. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Bestimmung der Phänotypen nach erfolgreicher Kultivierung der Zellen.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass T- und NK-Zellen mit der oben beschriebenen Methode kultiviert werden können und Zelllinien mit dieser Technik etabliert werden können, da die Zellen mehr als drei Monate in gutem Zustand gewachsen sind. Diese Methode, diese Technik, kann sogar noch mehr gemacht werden. Es ist einfach, es richtig auszuführen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Variabilität von PBMC beizubehalten. Für dieses Verfahren können beide Methoden, wie z.B. das MTT-Assay-Kit 8, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Toxizität von NK- oder T-Zelllinien zu beantworten, die für eine adoptive Immuntherapie verwendet werden können. Nach jeder Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des CAEBV, um den Mechanismus des EBV-assoziierten NK/T zu erforschen, der operative Erkrankungen im Zellmodellsystem beinhaltet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die NK- und T-Zelllinien nach diesem Protokoll etablieren und erweitern können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Krankheitserreger äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.