Name: Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Methode zur Gewinnung von NK- und T-Zell-Linien aus Patienten mit chronischer aktiver EBV-Infektion mittels peripherem Blut und niedriger IL-2-Dosis. Diese Technik ermöglicht die Erforschung von CAEBV-Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch die Schlüssel Projekte der chinesischen Akademie der Wissenschaften (KFZD-SW-205), strategische biologische Ressourcen Technologie-Support-System der chinesischen Akademie der Wissenschaften (CZBZX-1 und ZSSB-004) und durch Zuschüsse vom National Science Foundation of China (unterstützt 81401640) und Shanghai Natural Science Fund (14ZR1434800).

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Institut für Genetik und Entwicklungsbiologie, chinesische Akademie von Wissenschaften, genehmigt und das Protokoll folgt den institutionellen Richtlinien für menschliches Wohlergehen.
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des Workflows.
1. Isolierung von PBMC von CAEBV Patienten
<ol><li>Primäre PBMC von 2 mL Vollblut von CAEBV Patienten durch den Farbverlauf (z.B.Ficoll-Plakette) zu reinigen Zentrifugation, die Anweisungen des Herstellers. Alternativ kryokonserviert Tauwetter PBMC von flüssigem Stickstoff mit RPMI 1640 Medium.</li>
	<li>18 µL Zellsuspension 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzufügen, 3 min. zu beflecken Zellen, das Fahrwerk an die Zelle Gegenplatte übertragen und messen die Zellen Konzentration und Rentabilität mit einem automatisierten Zelle Zähler warten.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zellsuspension bei einer Dichte von 2-3 × 106 Zellen/mL mit kompletten RPMI 1640 Kulturmedium mit 20 % humanem Serum (Hitze inaktiviert bei 56 ° C), 2 mM L-Glutamin ergänzt und Antibiotika (100 µg/mL Streptomycin, 100 U/mL Penicillin). Samen 1 mL PBMC Suspension pro Bohrloch in 24 wohlen Zellplatten Kultur.</li>
	<li>Fügen Sie 150 U RhIL-2 pro Bohrloch.</li>
	<li>Legen Sie die Kultur-Platten in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C.</li>
	<li>Am 2. Tag beobachten Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop (200 X Vergrößerung); Zellen sind in einem guten Zustand, wenn sie hell und rund sind.</li>
</ol>2. Ausbau der Nummerierung der lebensfähigen Zellen und Zellen
<ol><li>Die Zellmorphologie unter dem Mikroskop (200 X Vergrößerung) zu beobachten und überwachen den Zustand des Zellwachstums durch Nummerierung der Zellen vor dem Wechsel Medium: 18 µL Zellsuspension 2 µL Trypan blau (0,4 %) hinzu, und die Zellen Konzentration zu berechnen (siehe 1.2, Abbildung 2).</li>
	<li>500 µL des Mediums in einer 24-Well-Platte zu verwerfen, und 500 µL frische komplette Kulturmedium hinzufügen. Fügen Sie 150U RhIL-2 pro Bohrloch.</li>
	<li>Verändern Sie zweimal in der Woche wie in Schritt 2.2 das Medium.</li>
	<li>Ziehen Sie die Zelle Wachstumskurve (Abbildung 3).</li>
	<li>Überschreitet der lebensfähigen Zellen Konzentration 5 × 106/mL, teilen Sie sich Zellen in neue Brunnen in einer Konzentration von 1 – 2 × 106 Zellen/mL in jede Vertiefung. Dieser Vorgang dauert ca. 2-4 Wochen.</li>
</ol>3. Zelle Phänotypisierung von Durchflusszytometrie
<ol><li>Wenn Zellen erweitert haben, sammeln Sie 1 × 106 Zellen um die Phänotypen der Zell-Linien zu bestimmen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 240 X g für 5 min bei Raumtemperatur (NK/T-Zellen werden an der Unterseite des Rohres Niederschlag).</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie den Niederschlag durch Zugabe von 7 mL PBS. Zentrifuge für 5 min bei 240 X g bei Raumtemperatur. Einmal wiederholen.</li>
	<li>Jedes Rohr 200 µL Humanserum hinzufügen, gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zellen bei 240 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen bei 1 × 106/mL mit kalten PBSA (PBS+0.2%BSA). Teilen Sie Zellen in 5 Röhren auf, jedes Röhrchen mit 2 × 105 Zellen.</li>
	<li>Zentrifuge Zellen bei 240 X g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand verwerfen und wieder auszusetzen, die Zellen mit PBSA Puffer oder PBSA mit 10 µL PE (oder PE-Cy7) und 10 µL FITC beschriftet Antikörper, die Zell-Rezeptoren von T oder NK-Zellen auf dem Eis zu beflecken, wie Abbildung 4angegeben ist. Zellen mit PBSA Puffer ausgesetzt sind als Negativkontrolle verwendet.</li>
	<li>Inkubation der Zellen mit Antikörpern für 20-30 min auf Eis im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalten PBSA, wieder auszusetzen, die Zellen mit 300 µL kalter PBSA.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zelle Phänotyp mit einem Durchflusszytometer.<ol>
<li>Richten Sie den Flow Cytometer in "Arbeitsblatt erstellen" Zustand. Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Dot-Plot, der forward Scatter (FSC) versus Side Scatter (SSC) anzeigt.</li>
		<li>Laden Sie der Isotype Kontrollröhrchen um den FSC und SSC Spannungen zu optimieren und optimieren Sie den FSC-Schwellenwert um Ablagerungen zu beseitigen ohne Beeinträchtigung der Zellpopulation von Interesse. Löschen Sie alle Parameter mit Ausnahme von FSC, SSC, FITC, PE und PE-Cy7.</li>
		<li>Führen Sie die Isotype-Steuerung und einer einzigen positiven Kontrolle in jeder Gruppe 2-Farbanalyse mit Ausgleich.</li>
		<li>Laden Sie Proben und erstellen Sie HLA-DR VS CD19 CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 und CD3 VS CD16 Punkt plottet zeigt verschiedene Bevölkerung der Zellen. Hinweis: PBMC wurden verwendet, um mit negativen/Isotype Steuerungen und einzigen positiven Ausgleich durchzuführen. 2-Farben-Immunfluoreszenz mit Durchflusszytometer war routinemäßig verwendet, um den Ausdruck der Oberflächenmarker zu analysieren. Die folgenden Antikörper sind enthalten: Anti-HLA-DR, Anti-CD4, Anti-CD16 konjugiert mit Fluorescein erfolgt (FITC), Anti-CD8, Anti-CD56, CD3 konjugiert mit Phycoerythrin (PE) und Anti-CD19 konjugiert mit PE-Cy7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ausbau und Kryokonservierung von NK/T-Zellen
<ol><li>Ändern Sie das Medium, wenn die Zelle Phänotyp-Analyse abgeschlossen ist. Sorgfältig entfernen Sie die Hälfte des Überstands und berühren Sie die Zellen an der Unterseite der Platte. Fügen Sie die gleiche Menge an frischem Nährmedium mit 300 U/mL RhIL-2 zu den Zellplatten.</li>
	<li>Die Hälfte des Mediums ändern alle 3 Tage (als 2.2) bis die Zelle Cluster sind deutlich sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 2). In der Regel dauert dieser Vorgang ca. 2-3 Wochen.</li>
	<li>Transfer der Zellen vom 24-Well Platten zum T25 Kulturflaschen nach dem Mischen verschiedenster Brunnen derselben Linie. Doppelte Volumen Kulturmedium wie es gelb bis das Volumen des Mediums wird erweitert um 10-15 mL. Fügen Sie RhIL-2 mit der Konzentration von 150 U/mL.</li>
	<li>Ändern mittlere 24 h vor dem Einfrieren nach 2-3 Wochen wachsen, wenn die Zelle Masse mit bloßem Auge beobachtet werden kann. Messen Sie Zellkonzentration mit einer Zelle Zähler.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 240 X g und wieder auszusetzen Sie Zelle Pellet bei einer Dichte von 5-10 x 106 Zellen/mL mit gefrorenen Vorratslösung der fötalen Rinderserum 90 % und 10 % Dimethylsulfoxide (DMSO) enthält. Mit einer Rate von 1 ° C / Min. bis-80 ° C eingefroren und dann direkt in flüssigen Stickstoff übertragen.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
<li>Okano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+problematic+standpoints+of+severe+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).</li>
<li>Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronic+mononucleosis+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The chronic mononucleosis syndrome.</a> J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).</li>
<li>Jones, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphomas+containing+Epstein-Barr+viral+DNA+in+patients+with+chronic+Epstein-Barr+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections.</a> N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).</li>
<li>Kikuta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+genome-positive+T+lymphocytes+in+a+boy+with+chronic+active+EBV+infection+associated+with+Kawasaki-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease.</a> Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
<li>Tabata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroa+vacciniforme-like+lymphomatoid+papulosis+in+a+Japanese+child%3A+a+new+subset%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset.</a> J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).</li>
<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. und X.C. sind Co-Erfinder auf Patentanmeldungen für Einsatzmöglichkeiten dieser Methode zur Festsetzung von NK/T-Zell-Linien und die Zell-Linien, die in dieser Studie festgestellt. D.Z., X.Z. und X.C. erklären, keine finanziellen Interessenkonflikte in dieser Arbeit. Die verbleibenden Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte haben.

In diesem Protokoll wurde eine neuartige Technik für den Aufbau von NK/T-Zell-Linien aus dem Vollblut von CAEBV Patienten entwickelt. Im Vergleich mit den bisherigen Verfahren, ist der Hauptvorteil dieser Methode seiner Einfachheit und seiner Forderung nach nur ein kleines Volumen des Blutes, während es eine hohe Erfolgsquote und gute Bedingungen der Zellviabilität aufweist. Darüber hinaus können NK/T-Zell-Linien eingerichtet werden, durch Kultivierung PBMC ohne festzustellen, dass die Zelltypen der EBV latent infiziert ...

Epstein - Barr-Virus (EBV) ist allgegenwärtig und befällt nicht nur B-Zellen, sondern auch T und natürlichen killer (NK)-Zellen, wodurch eine Reihe von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen (LPD) und Lymphom/Leukämie, wie z. B. EBV-assoziierten hemophagocytic Lymphohistiocytosis, Hydroa Vacciniforme-wie Lymphom, extranodal NK/T-Zell-Lymphom, nasale Art und aggressive NK Zell-Leukämie1,2,3. Unter diesen ist schwerer chronisch aktive EBV (SCAEBV) Erkrankung, die einfallenden vor allem in Ostasien, und das gilt jetzt als ein LPD verursacht durch klonale Expansion von EBV-infizierte T oder NK Zellen4,5,6, 7, aber ohne die scheinbare Immunschwäche präsentieren in infektiöse Mononukleose (IM)-wie Symptomen wie Fieber, Hepatosplenomegalie, Lymphadenopathie und Leberfunktionsstörungen, anhaltend oder wiederkehrend sowie hohen EBV-DNA in die peripheren Blut8,9. Patienten mit CAEBV haben eine schlechte Prognose10,11, und seine Pathogenese und die Rolle der EBV ist unklar. Daher Zellinien von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen abgeleitet und Lymphome sind sehr hilfreich, wie Zellmodelle für Klärung des Mechanismus der EBV NK oder T-Zell-Proliferation und seine Beziehung mit hoher Inzidenz von Leukämie induziert oder Lymphom.
Bislang wurden mehrere Zellinien mit verschiedenen Techniken12,13,14,15,16eingerichtet. Eine menschliche NK-Zell-Linie, NK-YS, entstand von NK-Zellen-Lymphom/Leukämie, durch Kultivierung zusammen mit einer Maus Stromazellen Zelllinie als Zubringer und in Anwesenheit von RhIL-2 in einer Konzentration von 20U pro mL15. KAI3 war ein weiterer NK-Zell-Linie gegründet von Patienten mit einer schweren Moskito-Allergie oder SCAEBV mit autologen Lymphoblastoid Zelllinie (LCL), B-Zellen durch EBV, als Feeder-Zellen und Zugabe von RhIL-2 bei 100U/mL16verwandelt. SNK6 und SNT8 wurden von Tumorgewebe des nasalen NK/T Zelle Lymphom Patienten abgeleitet, durch Zugabe von Hochdosis-RhIL-2 (700U/mL)12. Mit ähnlicher Technik war die SNK-1 Zelle von CAEBV Patienten, kultiviert von PBMC durch T-Zellen entfernen und Hinzufügen von 700U/mL RhIL-213,17. SNT13 und SNT15 wurden durch Entfernen von CD4 + und CD8 + Zellen18gegründet. Bisher wurden alle anderen T-Zellen und NK-Zell-Linien von EBV-NK/T LPD Patienten mit dieser Methode19entwickelt.
Die Nachteile der oben erwähnten vorhandenen Methoden gehören die Beschäftigung von Feeder-Zellen, das Erfordernis einer hohen Dosis von IL-2, die Auslastung von mehr als 10 mL Vollblut oder die Reinigung von NK/T-Zellen, die sehr anspruchsvoll in der Klinik die Notwendigkeit der Überprüfung, welche Arten von Zellen, dass EBV latent infiziert vor Beginn der Kultur. Als CAEBV vor allem bei Kindern in Asien tritt, ist 10 mL Blut nicht einfach, in allen Regionen zu erwerben. In dieser Studie haben wir eine neue einfache Methode mit einer hohen Erfolgsquote, NK und/oder T-Zell-Linien zu etablieren, durch Kultivierung PBMC von CAEBV Patienten mit niedrig dosierten rhIL2 und ein Volumen von 2 mL Vollblut ohne Feeder-Zellen entwickelt. Die Ergebnisse dieser Methode haben ihre hohe Effizienz und Zeitersparnis bewiesen.

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td><td></td> 560944 <td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>Hu CD4 FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td>557086</td><td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td><td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>556647</td><td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td><td>560728</td><td>Antikörper für FACS</td></tr><tr><td>humanes IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>humanes Serum</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>Zentrifugationsmikroskop</td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturcluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Polystyrolplatten</td></tr><tr><td>25cm2 Zellkulturkolben</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polystyrol</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Bestandteil des Zellmediums</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Lebensdauer</td><td>22400089</td><td>Für Zellmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Bestandteil des Zellmediums</td></tr><tr><td>100 x Streptomycin Penicillin-Lösung BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Bestandteil des Zellmediums</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Für die In-vitro-Isolierung von Lymphozyten</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Zum Einfrieren von Zellen</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva Software</td><td>FACS Analyse</td></tr></tbody></table>

eine effiziente und einfache methode, nk und t-zell-linien von patienten mit chronischen aktiven epstein - barr-virus-infektion zu etablieren

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Eine Reihe von Methoden wurden beschrieben, NK/T-Zell-Linien von Patienten mit Lymphom oder Lymphoproliferative Syndrome zu etablieren. Diese Methoden angewendet Feeder-Zellen, gereinigten NK oder T-Zellen mit mehr als 10 mL Blut oder eine hohe Dosis von IL-2. Diese Studie stellt eine neue Methode, eine leistungsstarke und einfache Strategie zu etablieren, dass NK und T-Zell-Linien durch Kultivierung der peripheren Mononukleäre Zellen (PBMC) Blut mit dem Zusatz von rekombinanten menschlichen Il-2 (RhIL-2) und weniger als 2 mL Vollblut verwendet. Die Zellen können in zwei Wochen schnell vermehren und für mehr als 3 Monate gehalten werden. Mit dieser Methode wurden 7 NK oder T-Zell-Linien mit einer hohen Erfolgsquote eingerichtet. Diese Methode ist einfach, zuverlässig und für Schaffung Zelllinien aus mehr Fälle von CAEBV oder NK/T-Zell-Lymphom.

Nach 3 Tagen während der Einrichtung von Zelllinien Kultur, beginnen die polymorphen Zellen erscheinen (Abbildung 2). Nach 7 Tagen wachsen Zellen schnell, da sowohl die Anzahl als auch die Lebensfähigkeit der Zellen mit einer hohen Rate (Abbildung 3) erhöht werden. Kleine Gruppen von Zellen sind deutlich sichtbar nach 10-14 Tagen wächst, wenn die Zellkonzentration 3-6 × 106überschreiten kann. In diesem Zeitraum sollten...

Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Gewinnung von NK- oder T-Zelllinien von CAEBV-Patienten, was für die Erforschung dieser tödlichen Krankheit von großer Bedeutung ist. Diese Methode hilft bei der Gewinnung von NK- oder T-Zelllinien für die Erforschung des Mechanismus von CAEBV, wie z. B. die Untersuchung des rohen VBV auf die Zellproliferation, das Screening von Inhibitoren, die die NK/T-Zellproliferation beeinträchtigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr einfach und effizient ist und nur eine kleine Menge an peripherem Blut und eine niedrige Dosis Eisen zwei benötigt, um NK- oder T-Zelllinien von CAEBV-Patienten zu etablieren.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Überleben der Zellen in der ersten von zwei Wochen der Kultur ungewiss ist und diese Methode Ihnen zeigt, wie Sie die Zellproliferation der frühen Kultur bestimmen können. Als wir die Idee für diese Methode hatten, stellten wir fest, dass menschliches Serumeisen zwei PBMC für bis zu zwei Wochen enthalten kann. Wir haben gezeigt, dass die Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da sie die Form der Zellen und die Ursache der Proliferation zeigt.Und diese Erweiterung der Zellen und die Nummerierung der Y-Bar-Zellen Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie primäres PBMC aus zwei Millilitern Vollblut von CAEBV-Patienten durch Gradientenzentrifugation. Alternativ können Sie kryokonserviertes PBMC aus flüssigem Stickstoff mit RPMI-1640-Medium auftauen. Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu 18 Mikrolitern Zellsuspension hinzu, um die Zellen drei Minuten lang zu färben, dann übertragen Sie die Suspension auf die Zellzählerplatte und messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit der Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.Bereiten Sie die Zellsuspension mit einer Dichte von zwei bis drei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter vor, ergänzt mit vollständigem RPMI-1640-Kulturmedium mit 20 % Humanserum, zwei Millimolaren L-Glutamin und Antibiotika. Anschließend wird ein Milliliter PBMC-Suspension pro Vertiefung in die 24-Well-Zellkulturplatten gesät. Geben Sie anschließend 150 Einheiten pro Milliliter rhIL-2 in jede Vertiefung.Stellen Sie die Kulturplatten in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie am zweiten Tag die Zellmorphologie unter einem Mikroskop mit 200-facher Vergrößerung. Die Zellen sind in gutem Zustand, wenn sie hell und rund sind.In diesem Schritt fügen Sie zwei Mikroliter 0,4 % Trypanblau zu 18 Mikrolitern Zellsuspension hinzu und berechnen die Konzentration der Zellen. Beobachten Sie als Nächstes die Zellmorphologie und überwachen Sie den Zustand des Zellwachstums, indem Sie die Zellen nummerieren, bevor Sie das Medium wechseln. Es ist wichtig, die Zellmorphologie und den Zustand zu überwachen.Ob die Zellen überleben, können wir anhand der polymorphen Zellen und des Zustands der Zellen in einem frühen Stadium einer Kultur beurteilen. Entfernen Sie anschließend 500 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter frisches vollständiges Kulturmedium hinzu. Geben Sie dann 150 Einheiten pro Milliliter rhIL-2 in jede Vertiefung.Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche. Zeichnen Sie die Zellwachstumskurve. Wenn die Konzentration lebensfähiger Zellen das Fünffache von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter übersteigt, teilen Sie die Zellen in neue Vertiefungen mit einer Konzentration von ein bis zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in jeder Vertiefung.Dieser Prozess dauert zwei bis vier Wochen. Wenn sich die Zellen ausgebreitet haben, sammeln Sie eine mal 10 bis sechs Zellen, um die Phänotypen der Zelllinien zu bestimmen. Zentrifugieren Sie sie bei 240 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die NKNT-Zellen auszufällen.Danach den Überstand entsorgen und den Niederschlag durch Zugabe von sieben Millilitern PBS waschen. Zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 240 g bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal, geben Sie dann 200 Mikroliter Humanserum in jedes Röhrchen, mischen Sie gut und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 240-mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit kaltem PBSA. Teilen Sie anschließend die Zellen in fünf Röhrchen auf, die jeweils zwei mal 10 bis fünf Zellen enthalten. Danach zentrifugieren Sie die Zellen bei 240 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen erneut mit PBSA-Puffer oder PBSA, der 10 Mikroliter PE und 10 Mikroliter FITC-markierte Antikörper enthält, um Zellrezeptoren von T- oder NK-Zellen auf Eis zu färben.Mit PBSA-Puffer suspendierte Zellen werden als Negativkontrolle verwendet. Inkubieren Sie anschließend die Zellen mit Antikörpern für 20 bis 30 Minuten auf Eis im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBSA und suspendieren Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern kaltem PBSA erneut, bevor Sie mit dem Durchflusszytometer analysiert werden.Wenn die Analyse des Zellphänotyps abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig die Hälfte des Überstands und vermeiden Sie es, die Zellen am Boden der Platte zu berühren. Geben Sie das gleiche Volumen an frischem Kulturmedium, das rhIL-2 in einer Menge von 300 Einheiten pro Milliliter enthält, auf die Platten und wechseln Sie dann alle drei Tage die Hälfte des Mediums, bis die Zellcluster unter dem Mikroskop deutlich sichtbar sind. Übertragen Sie danach die Zellen von den 24-Well-Platten in T-25-Kulturflaschen, nachdem Sie verschiedene Wells derselben Linie gemischt haben.Verdoppeln Sie das Volumen des Nährmediums, wenn es gelb wird, bis sich das Volumen des Mediums auf 10 bis 15 Milliliter ausdehnt. Fügen Sie anschließend rhIL-2 mit einer Konzentration von 150 Einheiten pro Milliliter hinzu. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden vor dem Einfrieren nach zwei bis drei Wochen Wachstum, wenn die Zellmasse mit bloßem Auge beobachtet werden kann.Messen Sie die Zellkonzentration mit dem Zellzähler. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 240-mal g und suspendieren Sie das Zellpellet bei einer Dichte von fünf bis 10 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit der gefrorenen Stammlösung, die 90 % fötales Rinderserum und 10 % DMSO enthält. Frieren Sie es bei einer Geschwindigkeit von einem Grad Celsius pro Minute auf minus 80 Grad Celsius ein und geben Sie es dann direkt in flüssigen Stickstoff.Nach dreitägiger Kultivierung während der Etablierung von Zelllinien beginnen die polymorphen Zellen zu erscheinen. Nach sieben Tagen wachsen die Zellen schnell, da sowohl die Anzahl als auch die Lebensfähigkeit der Zellen mit hoher Geschwindigkeit zunahmen. Kleine Zellcluster sind nach 10 bis 14 Tagen Wachstum deutlich sichtbar, wenn die Zellkonzentration das Drei- bis Sechsfache des Sechstels übersteigt.In dieser Zeit sollten die Zellen durch Teilung in zwei oder drei Vertiefungen der Kulturplatte expandiert werden. Etwa einen Monat später, wenn die Zellzahl das Drei- bis Fünffache von 10 bis zum Siebtel erreicht, ist die Anzahl hoch genug für die Konservierung. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Bestimmung der Phänotypen nach erfolgreicher Kultivierung der Zellen.Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass T- und NK-Zellen mit der oben beschriebenen Methode kultiviert werden können und Zelllinien mit dieser Technik etabliert werden können, da die Zellen mehr als drei Monate in gutem Zustand gewachsen sind. Diese Methode, diese Technik, kann sogar noch mehr gemacht werden. Es ist einfach, es richtig auszuführen.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Variabilität von PBMC beizubehalten. Für dieses Verfahren können beide Methoden, wie z.B. das MTT-Assay-Kit 8, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Toxizität von NK- oder T-Zelllinien zu beantworten, die für eine adoptive Immuntherapie verwendet werden können. Nach jeder Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des CAEBV, um den Mechanismus des EBV-assoziierten NK/T zu erforschen, der operative Erkrankungen im Zellmodellsystem beinhaltet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die NK- und T-Zelllinien nach diesem Protokoll etablieren und erweitern können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Krankheitserreger äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

Hier werden Methoden zur Untersuchung der funktionellen Wirkung von RYR1-Mutationen beschrieben, die endogen in immortalisierten menschlichen B-Lymphozyten und muskelbiopsiebasierten Satellitenzellen exprimiert werden, die in Myotuben differenziert sind.

Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

Hier stellen wir eine Methode zur Erweiterung von peripheren Blut-Naturkillern (PBNK), NK-Zellen aus Lebergeweben und chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen vor, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) stammen. Dieses Protokoll demonstriert die Expansion von NK- und CAR-NK-Zellen unter Verwendung von 221-mIL-21-Feederzellen zusätzlich zur optimierten Reinheit expandierter NK-Zellen.

Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Wir beschreiben eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen peripherer mononukleärer Blutzellen (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszierend markierte Zellen gereinigt und analysiert werden.

Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von Epstein-Barr-Viruspartikeln aus der menschlichen P3HR1-Zelllinie nach Induktion des viralen lytischen Zyklus mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat. Anschließend wird DNA aus der viralen Zubereitung extrahiert und einer Real-Time-PCR unterzogen, um die Viruspartikelkonzentration zu quantifizieren.

Isolierung und Quantifizierung des Epstein-Barr-Virus aus der P3HR1-Zelllinie

Erfahren Sie eine einfache Methode zur Gewinnung von NK- und T-Zell-Linien aus Patienten mit chronischer aktiver EBV-Infektion mittels peripherem Blut und niedriger IL-2-Dosis. Diese Technik ermöglicht die Erforschung von CAEBV-Mechanismen.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren (Video) | JoVE Journal

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

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