Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

Das übergeordnete Ziel der Synthese und Reinigung besteht darin, relativ einfach ein Ruthenium-360-Analogon herzustellen, das in mitochondrialen Kalziumaufnahme-Assays verwendet wird und 10-mal wirksamer ist als kommerziell erhältliches Ruthenium-360. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mitochondrialen Kalziumbiologie zu beantworten, indem sie einen reinen Inhibitor der mitochondrialen Kalziumaufnahme liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Endprodukt sowohl sehr stark als auch rein ist.

Personen, die neu in dieser Methode sind, können Schwierigkeiten haben, da die Reinigung Zeit und Geduld erfordert. Der Produzent wird von Sarah Nathan, einer Doktorandin aus meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Synthese von Pentaammin, Chlorrutheniumdichlorid, wie im Textprotokoll beschrieben.

100 mg Pentaamminchlor-Rutheniumdichlorid werden in 50 Millilitern einer molaren Ammoniumhydroxidlösung in einem 200-Milliliter-Rundkolben gelöst. Verschließen Sie den Kolben locker mit einem Glasstopfen und erhitzen Sie das Reaktionsgemisch sechs Stunden lang auf 75 Grad Celsius. Das Erhitzen eines verschlossenen Behälters führt zu einem Druckaufbau.

Stellen Sie sicher, dass der Glasstopfen locker ist, damit der überschüssige Druck abgelassen werden kann. Nach sechs Stunden das Reaktionsgemisch vom Herd nehmen. Und vier Tage lang bei Raumtemperatur umrühren, um eine dunkelgrüne Lösung zu erhalten.

Um das resultierende trans-Diaqua-Octo-Amin mu-Oxo-Dirutheniumpentachlorid durch Kationenaustauschchromatographie zu reinigen, werden zunächst fünf Gramm Maschenkationenaustauscherharz in 10 Millilitern 0,1 molaren HCL in einem 25-Milliliter-Becherglas suspendiert. Laden Sie diese Gülle in eine 10-Milliliter-Säule, die mit einem 50-Milliliter-Lösungsmittelbehälter befestigt ist. Waschen Sie das Harz mit ca. 20 bis 30 Millilitern 0,1 molaren HCL, bis die Elue farblos ist.

Als nächstes fügen Sie konzentriertes HCL zu der zuvor isolierten grünen Reaktionslösung hinzu, um den PH-Wert auf zwei einzustellen, woraufhin sich die Farbe der Lösung in Braun ändert. Laden Sie diese angesäuerte Lösung in die Kationenaustauscherharzsäule, indem Sie sie vorsichtig auf das Harz pipettieren. Lassen Sie die Elue vollständig abtropfen und laden Sie die Lösung weiter.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Lösung hinzugefügt wurde. Die Oberseite des Harzes ist dunkelbraun oder schwarz. Das Volumen des Harzes nimmt leicht ab.

Bedecken Sie als Nächstes die Oberseite des Harzes mit Glasperlen, um zu verhindern, dass das Harz gestört wird, wenn neue Lösungen hinzugefügt werden. Eluieren Sie die Säule mit 20 Millilitern eines molaren HCL. Dann eluieren Sie die Säule mit 50 Millilitern einer erhöhten HCL-Konzentration von 1,5 molaren.

Eine gelbe Lösung beginnt sich von der Säule zu lösen. Erhöhen Sie anschließend die HCL-Konzentration auf zwei Molare und setzen Sie die Eluierung mit 150 bis 200 Millilitern fort. Das Eluant beginnt in einem sehr hellen Gelb und geht in ein helles Gelb über.

Warten Sie, bis das aus der Säule kommende Eluant wieder sehr blass ist. Geduld ist bei diesem Schritt entscheidend. Das Eluant muss sehr blass sein.

Erhöhen Sie die HCL-Konzentration weiter auf 2,5 molaren. Sammeln Sie das Eluans in Form von Fraktionen in Reagenzgläsern. Erhöhen Sie schließlich die Konzentration auf drei molare HCL.

Das Produkt eluiert als grün-braune Lösung aus der Säule. Es kann auch beginnen, sich von der Säule zu lösen. Bei diesen Fraktionen handelt es sich um rutheniumbraune Verunreinigungen, die nicht mit den grün-braunen Fraktionen zusammengelegt werden sollten.

Um alle Fraktionen mittels UV-Vis-Spektroskopie zu testen, fügen Sie 100 Mikroliter einer gegebenen Fraktion in zwei Milliliter dreimolares Ammoniak hinzu. Analysieren Sie dann das Gemisch mittels UV-Vis-Spektroskopie. Fraktionen, die reines Produkt enthalten, haben eine große Absorptionsbande bei 360 Nanometern und eine weniger intensive Absorption bei 600 Nanometern.

Die Extinktion bei 480 Nanometern ist ein Hinweis auf Rutheniumbraun und die Extinktion bei 533 Nanometern stellt Rutheniumrot-Verunreinigungen dar. Andere Verunreinigungen sind bei einer Absorption von weniger als 300 Nanometern zu sehen. Poolfraktionen, die reines Produkt enthalten, werden durch Rotationsverdampfung bis zur Trockenheit verdampft, bevor die Probe im festen Zustand mittels IR-Spektroskopie analysiert wird.

Fahren Sie mit der Bewertung der mitochondrialen Kalziumaufnahmehemmung durch Fluoreszenzspektroskopie fort, wie im Textprotokoll beschrieben. UV-Vis-Spektren von gereinigtem trans-Diaqua-Octo-Amin mu-Oxo-Dirutheniumpentachlorid zeichnen sich durch die Haupt- und Nebenabsorptionen bei 360 Nanometern bzw. 600 Nanometern aus. Umgekehrt weist ein unreines Gemisch Absorptionsbanden bei 533 Nanometern von Rutheniumrot-Verunreinigungen und bei 275 bis 300 Nanometern vom Ausgangsmaterial auf.

Die Festkörpercharakterisierung mittels Infrarotspektroskopie hat die erwarteten Strecken von den Aminen. Neben dem Ruthenium-Sauerstoff erstreckt sich Ruthenium bei 850 inversen Zentimetern. Permeabalisierte HeLa-Zellen, die mit einem calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff und trans-Diaqua Octoamin mu-Oxo-Dirutheniumpentachlorid behandelt wurden, zeigen eine Hemmung der Calciumaufnahme in die Mitochondrien.

Beim Versuch des Eingriffs ist es wichtig, daran zu denken, dass die Fraktionen vollständig eluieren können. Geduld wird ein reines Produkt hervorbringen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dieses potente Ruthenium 360-Analogon synthetisiert, reinigt und charakterisiert.

mitochondriale Kalziumspiegel reguliert eine Vielzahl von interzellulären Prozessen, einschließlich Bioenergetik und kontrolliertem Zelltod. Der aus dieser Methode hergestellte Inhibitor kann in Studien eingesetzt werden, um die Rolle der mitochondrialen Kalziumbiologie bei der Vermittlung anderer biologischer Prozesse zu verstehen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit konzentrierten Säuren und Basen korrosiv ist und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der richtigen PSA getroffen werden sollten.