Name: Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie die Synthese und Charakterisierung eines Ruthenium-basierten mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmers. Diese Methode liefert ein hochwirksames Analogon für Studien zur mitochondrialen Kalziumbiologie.

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Diese Forschung wurde von der Cornell University unterstützt. Diese Arbeit von der Cornell-Center für Materialien geteilt Forschungseinrichtungen, Gebrauch gemacht, durch das NSF-MRSEC-Programm (Grant DMR-1120296) unterstützt werden. S.R.N. räumt Unterstützung durch eine NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) und Dr. Dave Holowka für die Unterstützung bei der Kalzium-Experimente. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.

Hinweis: konzentrierte Säuren und Basen sind in dieser Synthese verwendet. Verwenden Sie alle entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung der Reaktion, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe.
 1. Vorbereitung der [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 <ol><li>Synthese von [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12 <ol><li>auflösen 1,00 g RuCl 3 · n H 2 O (40 % Ru nach Gewicht, 4,1 Mmol) in 5 mL H 2 O. Cool die dunkle braune Lösung auf 0 ° C im Eisbad. 11 mL (0,23 Mol) von 80 % Hydrazin Hydrat Lösung in gewissem Sinne tropfenweise hinzugeben. Die erste Reaktion wird kräftig mit der Evolution Gas, wodurch eine braune Lösung sein. Lassen Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 16 h rühren; die endgültige Lösung werden dunkel rot 
		Achtung: Hydrazin ist akut giftig und karzinogen. Darüber hinaus sind wasserfreie Formen von diesem Reagens explosiv. Verwenden Sie geeignete PSA und Rauch Hauben wie immer beim Umgang mit. Nicht konzentrieren, diese Lösungen zu Trockenheit.</li>
		<li>Dieser Projektmappe hinzufügen etwa 5-10 mL konzentrierter HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2. An dieser Stelle werden die Lösung gelb-braune Farbe.</li>
		<li>Erhitzen dieser Lösung bei 105 ° C unter ständigem Rühren ca. 1-2 h. Eine gelbliche Lösung wird aus der Lösung ausgefällt. Wenn nicht mehr sichtbare Formen Niederschlag, vom Herd nehmen.</li>
		<li>Ermöglichen dem Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen lassen, und dann in ein Eisbad 0 ° C für 10 min. sammeln die gelbliche Lösung durch Vakuumfiltration und waschen mit 5 mL Ethanol und Diethylether.</li>
		<li>Lösen sich vollständig auf das Rohprodukt in 15-25 mL heißem Wasser. Chill-10 mL einer konzentrierten HCl-Lösung in einem Filter Kolben indem man sie in ein Eisbad. Filtern Sie die gelbe Lösung in die gekühlte HCl-Lösung Niederschlag eines blass gelbe reinen Feststoffs zu induzieren. Dieser Niederschlag zu filtern und mit 5 mL von 0,5 M HCl, Ethanol und Ether waschen.</li>
		<li>Characterize Verbindung mit IR-Spektroskopie. Durch die Identifizierung der Dehnung Frequenzen bei 3226 cm -1, 1604 cm -1 und 1297 cm -1 801 cm -1 Reinheit überprüft. Eine gemeinsame kleine Verunreinigung bei 2069 cm -1 zugewiesen [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.</li>
	</ol></li> <li>Synthese von [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 <ol><li>auflösen 100 mg (0,34 Mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL 1 M NH 4 OH in einem 200 mL schwere Wand Runde Talsohle Druckbehälter. Lose den Kolben mit einem Stopfen verschließen und Wärme der Reaktionsmischung bei 75 ° C für 6 h entfernen vom Herd nehmen und rühren bei Raumtemperatur für 4 Tage um eine dunkle grüne Lösung zu erzielen. 
		Vorsicht! Heizung eines versiegelten Behälter führt zu einen Druckaufbau. Achten Sie darauf, entsprechenden Druck spülmaschinenfest Glaswaren. Für diese Reaktion dient der Abdichtung des Schiffes zu Verlust von gasförmigen NH 3 zu minimieren. Legen Sie daher den Stopfen lose, um Freisetzung von Überdruck zu ermöglichen.</li>
	</ol></li> <li>Reinigung durch Kationenaustausch Chromatographie <ol><li>In ein 25 mL Becherglas aussetzen 5 g Kationenaustausch Harz (z. B. Dowex 50WX2 200-400 Mesh (H + Form) in 10 mL 0,1 M HCl.</li>
		<li>Laden diese Gülle in einer 10 mL-Spalte (10 mm Durchmesser, Höhe 15 cm) mit 50 mL Lösungsmittel Reservoir angebracht. Das Harz mit ca. 20-30 mL 0,1 M HCl zu waschen, bis das Eluat farblos ist.</li>
		<li>Rückkehr zum Grün Reaktionslösung in Schritt 1.2.1 isoliert. Diese Projektmappe hinzufügen konzentrierte HCl zur Einstellung des pH-Wertes auf 2, an welcher Stelle die Lösung braun verfärbt.</li>
		<li>Laden diese gesäuerte Lösung der Kationenaustausch Harz-Spalte im Schritt 1.3.2 durch pipettieren sie sanft auf das Harz vorbereitet. Lassen Sie das Eluat vollständig entleeren, und laden die Lösung fortsetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Projektmappe hinzugefügt wurden. Die Oberkante des Harzes wird dunkelbraun/schwarz sein. Das Harz wird in Volumen leicht zurückgehen.</li>
		<li>Verwendung Glasperlen, die Abdeckung des Harzes. Dies werden verhindert, dass das Harz gestört zu werden wenn neue Lösungen hinzugefügt werden.</li>
		<li>Die Spalte mit 20 mL 1 M HCl eluieren.</li>
		<li>Eluieren die Spalte mit einer erhöhten HCl-Konzentration von 1,5 M (&#8776; 50 mL). Eine gelbe Lösung beginnen, aus der Spalte zu kommen. Die HCl-Konzentration bis zu 2 M zu erhöhen und weiter eluierenden bis das Eluat farblos ist oder ein sehr blasses Grün-Gelb. Einem Gesamtvolumen von 150-200 mL werden für diesen Prozess erforderlich.</li>
		<li>Erhöhen die HCl-Konzentration bis 2,5 M (20-50 mL). Das Eluat als Brüche im Reagenzglas zu sammeln. Bis 3 M HCl erhöhen. Das Produkt wird aus der Spalte als eine grün-braune Lösung eluieren. Eine rot-braune Bruch kann auch damit beginnen, kommen aus der Spalte. Da diese Fraktionen rot oxidierte Ruthenium Verunreinigungen sind, nicht mit den grün-braune Brüchen zu bündeln.</li>
	</ol></li> <li>Charakterisierung und Prüfung der Reinheit von [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 <ol><li>Testen aller Fraktionen aus Schritt 1.3.8. durch UV-Vis-Spektroskopie. Um diese Aufgabe auszuführen, fügen Sie 100 µL einer bestimmten Fraktion in 2 mL 3 M NH3 und analysieren von UV-Vis-Spektroskopie. Brüche, enthält reines Produkt haben eine große Absorption-Band bei 360 nm und eine weniger intensive Extinktion bei 600 nm. Extinktion bei 480 oder 533 nm ist bezeichnend für rot oxidierte Ruthenium und Ruthenium rote Verunreinigungen bzw..</li>
		<li>Fraktionen enthält reines Produkt bündeln und verdunsten der Lösung für Trockenheit durch rotary verdampfen. Das Produkt wird als grün-braune Feststoff isoliert werden. Die Erträge sind in der Regel in der Größenordnung von 5-15 mg (10-20 % Ausbeute). Single-Kristalle, geeignet für x-ray Diffraction, von der Dampf-Diffusion von Ethanol in wässrigen Lösungen der Verbindung abgerufen werden können.</li>
		<li>Zur Überprüfung der Reinheit, analysieren die Verbindung mittels UV-Vis Spektroskopie in einer Lösung von pH 7.4 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Reinheit kann beurteilt werden, indem man das Verhältnis der Intensität der 360 nm und 600 nm Gipfeln. Dieses Verhältnis ist 31 für reine Verbindung. Für unreine Verbindungen wird das Verhältnis kleiner sein.</li>
		<li>Analyse die Probe in der Solid-State-durch IR-Spektroskopie. Diagnose-Bänder sind 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 und 815 cm -1. Gemeinsamen Unreinheit Bands sind auf 1762 cm -1 und 1400 cm -1, charakteristisch für NH 4 CL Ruthenium rot erkennen Sie an Bands bei 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 und 800 cm -1.</li>
	</ol></li> <li>Bewertung der mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmung durch Fluoreszenz-Spektroskopie Vorsicht! Die folgenden Verfahren verwenden Säugerzellen. Arbeiten sollten in entsprechenden Laminar-Flow-Hauben, die zertifiziert sind, biologische Sicherheit Level 2 (BSL2) Forschung durchgeführt werden. 
	&#8203; Hinweis: [(OH-2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH-2)] Cl 5 wird als bezeichnet werden [RU] in diesem Abschnitt <ol><li>machen gepuffert Glukose-haltigen Kochsalzlösung (BGSS) der Assay-Medien. BGSS ist eine Lösung, bestehend aus 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 5 mM Natrium Succinat, 30 µM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N &#39;, N &#39;-Tetraacetic Säure (EGTA). Kombinieren Sie alles außer der EGTA, einstellen Sie pH auf 7,4. EGTA hinzufügen und pH-Wert 7,4 nachjustieren. Für 50 mL Assay Medien hinzufügen 0,5 mL 1 mg/mL Glukose.</li>
		<li>Kultur HeLa-Zellen in 500 cm 2 Petrischalen in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 ° c verstärken HeLa-Zellen, die durch Aussaat in ein 100 mm Petrischale wachsen Sie in einer Petrischale 500 cm 2. Der gesamte Datenträger in die große Schüssel beträgt 115 mL. Jeder große Schüssel ergibt etwa 18 Millionen Zellen, genug für zwei Fluoreszenz-Spektroskopie-Experimenten.
		<ol><li>Die Zellen wachsen bis sie 90-95 erreichen % confluency. Entfernen Sie die Medien, und spülen Sie die Zellen mit 15 mL pH 7.4 PBS. Fügen Sie 15 mL 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) mit PBS-Puffer und inkubieren Sie für 10 Minuten, die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf 14 mL Falcon Rundrohre unten</li></ol></li> <li>Zellen mit Trypan blau und ein Hemocytometer mit einem inversen Mikroskop zählen, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Lautstärke der Medien benötigt um 7,5 Millionen Zellen pro 1,8 mL Volumen zu erreichen des Mediums. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 min bei 5310 × g. Dekantieren des Überstandes und fügen Sie das berechnete Volumen der BGSS. Aufschwemmen Sie Zellen sanft.
		<ol><li>Für diese Probe bereiten Stammlösungen von 40 mM Digitonin in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 1 mM Calcium Green-5N in H 2 O und 10 mM CaCl 2 in H 2 O. [Ru]-Stammlösungen, in reinem Wasser zubereitet, können reichen von 1-3 mM. 
			&#8203; Hinweis: Calcium Green-5N ist lichtempfindlich. Im Dunkeln lagern und Lichteinfall minimieren.</li>
		</ol></li> <li>Setup die Fluorimeter zur Anregung im 506 nm und lesen die Emission bei 532 nm mit der Küvettenhalter kontrolliert bei 37 ° C. Prepare eine Acryl Küvette mit einer Stir Bar oder Rad, 1,8 mL Zellsuspension aus 1.5.2 über 1,8 µL Digitonin Lösung, 3.6 & #181; L-Calcium Green-5N (Lösung) und 9 µL [Ru] (für Stammlösung 1 mM, 5 µM Endkonzentration). Inkubieren Sie Zellen für 15 min in die Fluorimeter.
		<ol><li>Lesen die Daten als Anregung/Emission Verhältnis statt der rohen Absorption. Diese Praxis minimiert Fehler mit Schwankungen in der Intensität der Lichtquelle verbunden.</li>
			<li>Die erste Probenanalyse in Ermangelung [Ru] die Wirkung des Zusatzes von CaCl 2 auf die Reaktion der Zellen Messen durchführen.</li>
			<li>Begin Analyse auf die Fluorimeter mit den Einstellungen in 1.5.4 beschrieben. Warten Sie ca. 2 Minuten um eine stabile Emission Baseline festlegen, und fügen Sie 1,8 µL CaCl 2 (10 µM Endkonzentration). Die Emissionsintensität steigen sofort auf die Zugabe von CaCl 2 und wird dann im Laufe von Minuten vergehen, wie die Kalzium-Ionen die Mitochondrien geben. Warten Sie, bis der Zerfall beendet hat (&#8776; 5 min). Fügen Sie zusätzliche Kalzium Dunkleosteus an die mitochondriale Kalzium Aufnahme Antwort von Zellen, die nicht mit [Ru] behandelt bestimmen.</li>
		</ol></li> <li>In einem anderen Küvette mit 5 µM [Ru], wiederholen Sie den Versuch wie oben beschrieben in 1.5.4.3. Im Beisein der Inhibitor Emissionsintensität erhöhen, aber nicht zerfallen. Diese Feststellung bedeutet mitochondriale Calciumaufnahme blockiert.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
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<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
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<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Die mitochondriale Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 kann synthetisiert [Ru (NH3)5Cl] Cl2, ein bekannter ruthenium(III) Ausgangsmaterial, wie in diesem Verfahren beschrieben. Die Synthese von [Ru (NH3)5Cl] Cl2 gelingt leicht mit wenig Schwierigkeiten. Nach dem Rühren RuCl3 für 16 h in Hydrazin Hydrat, der pH-Wert der Lösung sollte auf e...

Mitochondriale Calcium ist ein wichtiger Regulator für eine Reihe von Prozessen, die entscheidend für die normale Zellfunktion, einschließlich Energieerzeugung und Apoptose sind. 1 , 2 , 3 die mitochondriale Kalzium Uniporter (MCU), ein Ion-Transporter-Protein, das auf der inneren mitochondrialen Membran befindet regelt den Zustrom von Calcium-Ionen in die Mitochondrien. 4 , 5 , 6 chemische Inhibitoren der MCU sind wertvolle Werkzeuge für die Fortsetzung der Bemühungen, die Funktion und die zellulären Funktionen dieses Transportprotein und mitochondriale Kalzium zu studieren. Die zusammengesetzten [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, gehört der einzige bekannteren selektive Inhibitoren für die MCU mit einem gemeldeten K-d -Wert von 24 µM.7 ,8,9,10 dieser Komplex eine gemeinsame Verunreinigung gefunden in kommerzielle Formulierungen von Ruthenium rot (RuRed), eine Triruthenium di-µ-Oxo ist überbrückt Hexacation der Formel [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die auch als ein Kalzium-Aufnahme-Hemmer verwendet wurde. Obwohl Ru360 im Handel erhältlich ist, ist es sehr kostspielig. Darüber hinaus wird die Synthese und die Isolierung von Ru360 durch schwierige Reinigung Verfahren und mehrdeutige Charakterisierungsmethoden herausgefordert.
Vor kurzem haben wir alternative Verfahren eine Ru360 analog, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5Zugriff auf berichtet. 11 diese Verbindung hemmt die MCU mit hoher Affinität, ähnlich wie bei Ru360. In diesem Protokoll beschreiben wir unsere effektivsten Synthese dieser Verbindung, die von [Ru (NH3)5Cl] Cl2beginnt. Reinigung des Produkts verwenden stark saure Kationenaustauschermembran Harz ist zusammen mit gemeinsamen Fallstricke für dieses Verfahren detailliert. Wir auch Methoden zur Charakterisierung und Beurteilung der zusammengesetzte Reinheit zu präsentieren und einen einfachen Ansatz, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Blockierung der mitochondrialen Calciumaufnahme abzugrenzen.

<table><tbody><tr><td>Rutheniumtrichloridhydrat</td><td>Druckchemikalie</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrierte Salzsäure</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Konzentriertes Ammoniumhydroxid</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Calciumgrün 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinat</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Rundkolben</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Glasstopfen</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 15 cm Glassäule mit</td><td>Reservoirs Custom - ähnlich wie Chemglass Säulen</td><td>Ähnlich wie CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Rohre mit rundem Boden</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 Petrischalen</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Acrylküvetten</td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrometer</td><td>Agilent Modell Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorimeter</td><td>SLM Modell 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-Spektrometer</td><td>Bruker Hyprion FTIR mit ATR-Aufsatz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>ALC Modell PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td>VWR&nbsp;</td><td>Tel.: 89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

synthese und bewertung von ruthenium-basierte mitochondrialen kalzium-aufnahme-hemmer

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Wir beschreiben die Synthese und Reinigung von eine mitochondriale Kalzium-Aufnahme-Hemmer, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)]5 +. Die optimierte Synthese dieser Verbindung beginnt ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in einem geschlossenen Behälter, wodurch eine umweltfreundliche Lösung. Reinigung erfolgt mit Kationenaustausch Chromatographie. Diese Verbindung ist gekennzeichnet und rein sein von IR und UV-Vis Spektroskopie überprüft. Die mitochondriale Kalzium-Aufnahme hemmenden Eigenschaften sind in permeabilized HeLa-Zellen von Fluoreszenz-Spektroskopie bewertet.

Diese Methode beschreibt, eine Synthese der mitochondrialen Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2, eine bekannte ruthenium(III) Ausgangsmaterial. [Ru (NH3)5Cl] CL2 zeichnet sich durch IR-Spektroskopie mit Schwingungs-Modi bei 3200 cm-1, 1608 cm-1und 1298 cm-1798 cm<...

Ein Protokoll für die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von einer Ruthenium-basierte Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme wird vorgestellt. Ein Verfahren zur Bewertung ihrer Wirksamkeit in permeabilized Säugerzellen wird demonstriert.

Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Das übergeordnete Ziel der Synthese und Reinigung besteht darin, relativ einfach ein Ruthenium-360-Analogon herzustellen, das in mitochondrialen Kalziumaufnahme-Assays verwendet wird und 10-mal wirksamer ist als kommerziell erhältliches Ruthenium-360. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mitochondrialen Kalziumbiologie zu beantworten, indem sie einen reinen Inhibitor der mitochondrialen Kalziumaufnahme liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Endprodukt sowohl sehr stark als auch rein ist.Personen, die neu in dieser Methode sind, können Schwierigkeiten haben, da die Reinigung Zeit und Geduld erfordert. Der Produzent wird von Sarah Nathan, einer Doktorandin aus meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Synthese von Pentaammin, Chlorrutheniumdichlorid, wie im Textprotokoll beschrieben.100 mg Pentaamminchlor-Rutheniumdichlorid werden in 50 Millilitern einer molaren Ammoniumhydroxidlösung in einem 200-Milliliter-Rundkolben gelöst. Verschließen Sie den Kolben locker mit einem Glasstopfen und erhitzen Sie das Reaktionsgemisch sechs Stunden lang auf 75 Grad Celsius. Das Erhitzen eines verschlossenen Behälters führt zu

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf Plattenlesern basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien. Der Assay analysiert das Fluoreszenzsignal eines kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, um die Kinetik der mitochondrialen Kalziumaufnahme und der Kalziumüberladung zu untersuchen.

Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf konfokaler Mikroskopie basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in kultivierten Zellen. Der Assay verwendet den calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhod-2/AM zur Messung des mitochondrialen Calciums in permeabilisierten kultivierten Zellen.

Calcium-Influx-Assay zur Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme in kultivierten Zellen

Ruthenium Phosphinkomplexe werden häufig für die homogene katalytische Reaktionen wie Hydrierungen eingesetzt. Die Synthese einer Reihe von neuartigen dreizähnigen Ruthenium-Komplexe mit dem N -triphos Liganden N (CH 2 PPh 2) 3 gemeldet. Zusätzlich wird die stöchiometrische Umsetzung eines Dihydrid Ru N -triphos Komplex mit Lävulinsäure beschrieben.

Die Synthese, Charakterisierung und Reaktivität von einer Serie von Ruthenium<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Komplexe

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca2 + Import Assay mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca2 + Farbstoffs Rhod-2/AM.

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Die metabolische Anpassung ist für T-Zellen von grundlegender Bedeutung, da sie Differenzierung, Persistenz und Zytotoxizität bestimmt. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der mitochondrialen Atmung in ex vivo Zytokin-differenzierten humanen primären T-Zellen vorgestellt.

Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen

Wir präsentieren eine nicht-invasive, Echtzeit-Methode zur Überwachung der Mitochondriengesundheit mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie (RRS). Wir nutzten RRS, um mitochondriale Redoxzustände zu quantifizieren, und entwickelten eine Metrik für die mitochondriale Gesundheit, das Resonance Raman reduzierte mitochondriale Verhältnisse (3RMR), das eine schnellere Reaktion auf Veränderungen der Sauerstoffversorgung zeigt als traditionelle Blut-Gas-Analyte.

Echtzeit-nicht-invasive Bewertung der Mitochondrienfunktion mittels Resonanz-Raman-Spektroskopie

Lernen Sie die Synthese und Charakterisierung eines Ruthenium-basierten mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmers. Diese Methode liefert ein hochwirksames Analogon für Studien zur mitochondrialen Kalziumbiologie.

Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer

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