DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen
28. Januar 2018
Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.
Das DNA-Färbeprotokoll besteht aus drei allgemeinen Schritten. Die erste besteht darin, das Gel in eine Lösung aus SYBR Green I und Nitroblau-Tetrazolium, auch bekannt als NBT, zu geben. Das Gel wird dann 25 Minuten lang gerührt, wenn es sich um ein Polyacrylamid-Gel handelt, und eine Stunde, wenn es sich um ein Agarose-Gel handelt.
Der letzte Schritt besteht darin, das Gel einer blauen Lichtquelle wie blauen LEDs oder Sonnenlicht auszusetzen. Während dieses Schritts treten einige Niederschlagsbänder auf. Diese Banden stehen in direktem Zusammenhang mit der DNA-Konzentration und das Gel kann dann in einem Büroscanner digitalisiert werden, um die DNA zu quantifizieren.
Für das Polyacrylamid-Gel wird ein nicht denaturierendes Polyacrylamid-Gel hergestellt. Das Gel wird dann mit den Proben beladen und der Elektrophoreseprozess beginnt. SYBR Green I wird auf das 1,2-fache verdünnt und die NBT 20 millimolaren Lösungen sind nun hergestellt.
Das Gel wird in einen Kunststoffbehälter gegeben und 16,75 mil des verdünnten SYBR Green I und 325 mil des NBT bei 20 Millimolar zugegeben. Anschließend wird der Behälter mit Parafilm und Alufolie abgedeckt und bei 60 U/min für 25 Minuten gerührt. Zum Schluss wird die Alufolie und ein Parafilm entfernt und das Gel dem Sonnenlicht oder einer blauen Lichtquelle ausgesetzt.
Für die Bandenquantifizierung und Kalibrierungskurven wird das Gel in einen Büroscanner gegeben, dann wird das Bild mit einer Bildanalysesoftware analysiert. Schließlich wird ein Transplantat aus normalisiertem Signal versus Konzentration hergestellt. Es wird ein Agarose-Gel hergestellt.
Die Vertiefungen werden mit einem Plasmid beladen, das Ampicillin-Resistenz aufweist, und das Gel wird in zwei Stücke geschnitten, von denen jedes mit einem anderen Fleck gefärbt wird. Dann wird die Plasmidbande extrahiert und durch chemische Umwandlung in kompetente Zellen mit einem Medium umgewandelt, das Ampicillin enthält. Ein 1%Agarose-Gel wird in TAE 1X-Puffer hergestellt und mit vier Mikrolitern Plasmid in einer Menge von etwa 100 Nanogramm pro Mikroliter beladen.
Das Gel in der Elektrophoresekammer wird dann eine Stunde lang mit 100 Volt betrieben. Die Hälfte des Gels wird mit der SYBR Green I- und NBT-Methode und die andere Hälfte mit der SYBR Green I UV-Methode gefärbt. Für Agarosegel wird die SYBR Green I NBT-Methode unter Verwendung von SBYR Green I in einer Konzentration von 1,2X und NBT in einer Konzentration von 2 Millimolar durchgeführt.
Das Gel wird in einen Plastikbehälter gegeben und das Lösungsvolumen wird skaliert, um das Gel zu bedecken, und die Rührzeit wird auf eine Stunde verlängert. Bei Agarose-Gelen wird die häufig verwendete SYBR Green I-Methode durchgeführt, indem das Gel mit 1X SYBR Green I-Lösung bedeckt und eine Stunde lang gerührt wird. Dann wird das Gel zwei Minuten lang einem UV-Transilluminator zur Bandenvisualisierung ausgesetzt.
Sobald das Gel gefärbt ist, wird das Plasmidband mit einem Skalpell geschnitten und das Plasmid mit einem kommerziellen Extraktionskit extrahiert. Die DNA wird auf 9,1 Nanogramm pro Mikroliter normalisiert, um chemisch kompetente Escherichia coli XL 10-Bakterien zu transformieren. Zum Schluss werden die Völker gezählt.
Es werden die koloniebildenden Einheiten berechnet. Das Ergebnis wird veredelt und die Ergebnisse von SYBR Green I NBT und SYBR Green I UV verglichen. Ein violetter Formazan-Niederschlag erscheint an der Stelle, an der sich die DNA befindet.
Im Experiment wurde eine DNA-Leiter geladen, um eine Kalibrierungskurve mit einer Nachweisgrenze von 192 Pikogramm bei 1.500 Basenpaaren zu erstellen. Die Verwendung von Agarose-Gelen ermöglicht die Probenrückgewinnung mit handelsüblichen Kits und beeinträchtigt die Extraktion nicht. Eine gewisse Wiederherstellung mit dieser Methode mit blauer LED führt zu einer besseren Qualität im Vergleich zum SYBR Green I mit Transilluminator.
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Übersicht
Diese Methode ermöglicht die selektive Färbung und Quantifizierung von DNA in Gele mithilfe einer SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium-Lösung. Das Verfahren erfordert minimale Ausrüstung und eignet sich daher für Anwendungen im Feld.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biologie
- Molekularbiologie
- Feldanwendungen
Hintergrund
- Die DNA-Quantifizierung ist für verschiedene biologische Untersuchungen unerlässlich.
- Herkömmliche Methoden erfordern häufig komplexe Geräte.
- Diese Methode vereinfacht den Prozess erheblich.
- Verwendet gängige Reagenzien für effektive Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer einfachen Methode zur DNA-Färbung.
- Möglichkeit der Quantifizierung von DNA in verschiedenen Gelelektrophorese-Typen.
- Erleichterung von Feldarbeiten mit minimalen Geräteanforderungen.
Verwendete Methoden
- Das Gel in einer SYBR Green I- und NBT-Lösung einweichen.
- Das Gel 25 Minuten (Polyacrylamid) oder 1 Stunde (Agarose) rühren.
- Das Gel einer blauen Lichtquelle oder Sonnenlicht aussetzen.
- Das Gel zur DNA-Quantifizierung digitalisieren.
Hauptergebnisse
- Sichtbare Präzipitatsbänder korrelieren mit der DNA-Konzentration.
- Eine wirksame Färbung wird mit minimalem Equipment erzielt.
- Die Ergebnisse können mithilfe gängiger Büroskanner quantifiziert werden.
- Die Methode zeigt Zuverlässigkeit unter Feldbedingungen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen praktischen Ansatz zur DNA-Quantifizierung.
- Sie eignet sich für verschiedene Gele und Feldanwendungen.
- Verbessert den Zugang für Forscher an abgelegenen Standorten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese DNA-Färbemethode ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantifizierung von Nukleinsäuren ohne spezielle Geräteausstattung und unterstützt so eine schnelle Zielvalidierung unter ressourcenarmen Bedingungen. Durch den Verzicht auf UV-Transillumination werden Sicherheitsrisiken und der operationelle Aufwand in frühen Entdeckungsabläufen verringert. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit durch eine reproduzierbare, farbstoffbasierte Signal-Korrelation mit der DNA-Konzentration und erleichtert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in Leitstrukturforschungs-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch direkte Korrelation zwischen der Intensität des Formazan-Niederschlags und der DNA-Konzentration und unterstützt so die Beurteilung der Zielstrukturenbindung.
- Operativer Wert: Verwendet Rühren bei Raumtemperatur und Belichtung mit blauem Licht, wodurch gefährliche UV-Protokolle und spezielle Bildgebungsgeräte vermieden werden.
- Prädiktiver Wert: Liefert quantitative Ergebnisse, die mit Büroscannern kompatibel sind, und ermöglicht einen schnellen Vergleich der Nukleinsäureausbeuten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt stabile, sichtbare Präzipitatbänder, die standardisierte Auslesewerte für Hochdurchsatz-Screening-Formate von Nukleinsäuren darstellen.
- Reproduzierbarkeit: Definierte Rührzeiten (25 min für Polyacrylamid, 60 min für Agarose) und skalierbare Reagenzkonzentrationen gewährleisten eine konsistente Signalgenerierung über verschiedene Ansätze hinweg.
- Plattformkompatibilität: Funktioniert sowohl mit Agarose- als auch mit Polyacrylamidgelen und ermöglicht eine nahtlose Integration in bestehende Elektrophoreseabläufe für die Analyse von Varianten oder Plasmiden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Ermöglicht die Wiederherstellung funktionaler Plasmide nach der Färbung, wie durch eine höhere Anzahl an koloniebildenden Einheiten im Vergleich zu UV-basierten Methoden gezeigt, und ermöglicht dadurch die funktionelle Validierung in nachfolgenden Analysen.
- Mechanistische Risikominimierung: Vermeidet UV-induzierte DNA-Schäden und erhält so die Probengenauigkeit für eine präzise Genotyp-Phänotyp-Korrelation in phänotypischen Screening-Assays.
- Präklinische Anwendbarkeit: Ermöglicht den feldtauglichen Nachweis von Genexpressionskonstrukten oder viralen Titerbestimmungen in präklinischen Modellen ohne aufwändige Laborinfrastruktur.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Nukleinsäure-Extraktion bis zur Validierung funktioneller Assays ein, insbesondere dort, wo der Zugang zu Geräten eingeschränkt ist oder eine schnelle Iteration erforderlich ist.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Zielvalidierung, indem sie quantifizierbare DNA-Signale bereitstellt, die mit der transkriptionellen oder Editier-Effizienz in Studien zur Pfadmodulation korrelieren.
- Screening: Ermöglicht standardisierte Nukleinsäure-Quantifizierung zur Bestätigung von Hits in CRISPR- oder Überexpression-Bibliotheken und verbessert so die Reproduzierbarkeit von Assays.
- Analytik: Erzeugt lineare Signal-Konzentrations-Kurven mittels Büroscanner-Bildgebung und unterstützt dadurch die Daten-Normalisierung über Multiwell-Platten- oder Gele-basierte Formate hinweg.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Gewinnung intakter Nukleinsäuren für funktionelle In-vitro-Assays und schafft so eine Brücke von der Entdeckung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Benötigt lediglich SYBR Green I, NBT und eine blaue Lichtquelle und stellt somit ein kostengünstiges, wiederverwendbares Modul für mehrere Projektteams dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem UV-bedingte Artefakte vermieden werden, und verbessert so die Datenzuverlässigkeit bei Target-Validierungsassays.
- Operativer Wert: Macht Dunkelkammern oder Durchlichtkammern überflüssig, erhöht die Durchsatzkapazität und reduziert Engpässe in gemeinsam genutzten zentralen Einrichtungen.
- Strategischer Wert: Senkt die Investitionskosten für die Nukleinsäurequantifizierung und ermöglicht dezentrale Tests in Satellitenlaboren oder kollaborativen Standorten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem sie eine frühzeitige, geräteunabhängige Bestätigung der Konstrukt-Ausbeute ermöglicht, bevor in die nachgeschaltete Aufreinigung investiert wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Kenntnisse in Molekularbiologie für die Gelelektrophorese und die Gelpräparation.
- Benötigt Zugang zu einer blauen Lichtquelle (z. B. 470 nm LEDs) oder Sonnenlicht sowie zu Standard-Laborrührgeräten.
- Setzt standardisierte Färbezeiten und Reagenzkonzentrationen voraus, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren zu gewährleisten.
- Kann eine Optimierung für Hochdurchsatzformate erfordern, da manuelle Arbeitsschritte bei der Gelhandhabung notwendig sind.
- Auf den Nachweis von Nukleinsäuren beschränkt; ohne Anpassung nicht anwendbar für Protein- oder Kleinstmolekül-Assays.
