Name: Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie gesättigte Fettsäuren Makrophagen-Zelltod induzieren und mit Ceramid-Akkumulation korrelieren. Diese Methode nutzt Knochenmarkszellen von Mäusen und BSA-Fettsäure-Konjugate für metabolische Entzündungsforschung.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der University of Louisville Startkapital und National Cancer Institute (Bethesda, MD) gewährt R01CA177679, R01CA180986.

das Protokoll von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Louisville gebilligt wurde.
 1. Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) <ol><li>einschläfern eine 6 bis 8 Wochen alten, gesunden Wildtyp-Maus mit CO 2. Heften Sie es auf eine Dämmplatte und sprühen Sie es mit 70 % Ethanol, bis es getränkt ist. Entfernen Sie die Tibia/Femur-Knochen mit Zange und Schere. Setzen Sie sie in einer Petrischale mit 5 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie alle Verfahren unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Aufschneiden beide Enden der Tibia/Femur-Knochen mit einer Schere in einem sterilen Gewebekultur-Haube. Spülen Sie den Knochen mit einer 25 G Nadel mit PBS + 2 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem 15 mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen 500 X g, 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL roten Blutzelle Lysis Puffer zur lyse der Erythrozyten (RBC) für weniger als 1 min. sofort mit 9 mL 1 X PBS verdünnt. Zentrifuge wieder wie in Schritt 1.3. Die Überstände dekantieren.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS, filtern die Zellsuspension durch eine sterile 40 μm-Nylon-Netzgewebe in einem anderen 15 mL-Tube, Zelle Schutt/Klumpen zu entfernen. Zentrifuge wieder wie in 1.3. Die Überstände dekantieren.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 15 mL Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) 1640 mit 5 % FBS und 10 μg/mL Gentamicin, Platte, die die Zellen in der Kulturschale von 100mm Gewebe am 37 o C-Inkubator für 60 min. Wirbel sanft das Gericht, die schwimmende herausnehmen Zellen, und zähle sie.</li>
	<li>Platte 6 x 10 6 Zellen in einer 100-mm-Schale mit 12 mL Makrophagen differenzieren Medien (RPMI 1640 mit 5 % FBS und 10 μg/mL Gentamicin, gemischt mit 30 % L929 konditionierten Media 10) mit 10 ng/mL rekombinanter Maus Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) für 2 Tage.</li>
	<li>Nach Kultivierung für 2 Tage in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2, füttern Sie jedes Gericht mit 6 mL frische Makrophagen differenzieren Medien mit 10 ng/mL M-CSF.</li>
	<li>Am Tag 5, 8 mL der alten Medien, ohne die Zellen zu stören und fügen 10 mL frisches Makrophagen differenzieren Medien mit 10 ng/mL M-CSF.</li>
	<li>Am 7. Tag ernten die Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) mit einer Zelle Heber. 
	Hinweis: Angehängte Makrophagen können auch mit 5 mL 1 mM EDTA mit 1 X PBS-Puffer für 5 bis 10 min losgelöst werden nach dem Entfernen der Float-Zellen und Platte zweimal mit 5 mL 1 X PBS waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.3., Aufschwemmen sie in frische Makrophagen, die Medien zu unterscheiden und mit einer Hemocytometer zu zählen.
	<ol><li>Bestätigen die BMDMs &#39; Phänotyp durch Durchflusszytometrie als 5 beschrieben. Vorbereiten der abgeleiteten Maus Makrophagen in einer bestimmten Konzentration für die folgenden Studien.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-fetthaltige Säure konjugieren Vorbereitung <ol><li>vorbereiten 2 mM BSA in sterilen PBS. Zum Beispiel wiegen 6,65 g BSA, hinzufügen 30 mL 1 X PBS aufzulösen, fügen Sie mehr PBS bis 50 mL Skalierung Komponenten um 2 mM BSA in 1 X PBS zu machen.</li>
	<li>Vorbereitung 5 mM individuelle Natriumsalz der Fettsäuren in 2 mM BSA. Heizen auf 37 ° C oder höher, wenn nötig, und beschallen die Mischung von 2 mM BSA und Natriumsalz von Fettsäuren, bis eine klare Lösung erhalten wird. 
	Hinweis: Im Vergleich zu ungesättigten Fettsäuren, gesättigter Fettsäuren benötigen eine höhere Temperatur und weitere Beschallungsdauer für auflösen.</li>
	<li>Filter die Fettsäuren-Säure-BSA-Lösung durch einen 0,22-μm-Filter, aliquoten es in 1,5 mL sterile Microcentrifuge Rohre, und speichern sie bei 4 ° C für den kurzfristigen Einsatz oder bei-20 ° C für langfristige Lagerung. Kein Niederschlag nach Lagerung bei 4 ° C im Kühlschrank beachtet werden.</li>
</ol> 3. Gesättigte Fettsäuren induzieren Zelle Tod der Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen <ol><li>BMDMs in einer Gewebekultur 24-Well-Platte-Platte mit 0,4 x 10 6 /mL in Makrophagen differenzieren Medien.</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit 0,4 mM Palmitinsäure und Stearinsäure für 16 bis 24 h bei 37 ° C-Inkubator mit 5 % CO 2. BSA zu verwenden, als die Negativkontrolle.</li>
	<li>Ernte der Zellen mit einer Zelle Lifter nach Behandlung und spin-down der Zellen bei 500 X g, 4 ° C für 5 min.</li>
	<li>Beflecken Zellen mit Annexin V-Alexa 488 und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μL annexin V Bindung Puffer für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die Probe mit 200 µL annexin-Bindung Puffer verdünnen, vorsichtig mischen, dann halten Sie die Proben auf Eis nach der Inkubationszeit.</li>
	<li>Analysieren die gefärbten Zellen so bald wie möglich durch Flow Cytometry 5. Annexin V-Alexa 488 in FITC Kanal erkannt und 7-AAD in PerCP/PerCP-Cy5.5-Kanal erkannt wird.</li>
</ol> 4. Intrazelluläre Ceramid Färbung <ol><li>nach der Fettsäure-Behandlung, die Zellen wie in Schritt 3.3 ernten. Befestigen Sie die Zellen in 4 % Paraformaldehyd für 30 min.</li>
	<li>Die Probe mit 1 mL 1 X PBS waschen, spin-down als Schritt in 3.3 und dekantieren des Überstandes.</li>
	<li>Die Zellen mit Anti-Ceramid Primärantikörper (Verdünnung 1: 200) in 100 μl 1 X Permeabilisierung Puffer für 30 min. Färben</li>
	<li>Waschen und Spin down die Zellen wieder wie in Schritt 4.2.</li>
	<li>Die Zellen mit Anti-Maus IgM Sekundärantikörper (Verdünnung 1: 500) in 100 μl 1 X Permeabilisierung Puffer für 30 min. Färben</li>
	<li>Waschen und Spin down die Zellen wieder wie in Schritt 4.2. Fügen Sie 250 μl 1 X PBS und analysieren die gefärbten Zellen von Flow Cytometry 5. 
	Hinweis: Finden Sie die detaillierte Reagenz-Liste in der Tabelle von Geräten und Reagenzien.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die richtige Vorbereitung der Fettsäure-Lösung ist von entscheidender Bedeutung für die biologische Funktion von Fettsäuren zu studieren. Die Neutralisation der Fettsäuren erhöht die Löslichkeit in wässriger Lösung. Natriumsalze der Fettsäuren, vor allem gesättigte Fettsäuren, sind jedoch noch der geringe Löslichkeit in Wasser oder PBS, wie wir beobachten. Eine Methode ist mit 95-100 % Ethanol helfen Fettsäure1auflösen. Mit dieser Methode kann auch bei niedrigeren Konzentrationen für weniger gifti...

Fettsäuren spielen eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel und in der Synthese der Phospholipide der Membran in verschiedenen Arten von Zellen. Fettsäuren haben eine geringe wässrige Löslichkeit. Entsprechende Vorbereitung der Fettsäure ist von entscheidender Bedeutung für die Erforschung der biologischen Funktionen der Fettsäuren in Säugerzellen. Wenn Fettsäuren mit Ethanol vorbereitet sind, kann viele Fettsäuren ihre giftigen Seife (Reinigungsmittel) Wirkung auf die Zellmembran, auch bei relativ niedrigen Konzentrationen1angezeigt. Als natürliche, große Transporter für die freien Fettsäuren im Serum gilt als Serum-Albumin einen guten Träger für Fettsäure-Lieferung in Vitro für Fettsäure Funktion Assays2,3,4. Jedoch sind die Details der Vorbereitung der Fettsäure und Serum-Albumin-Konjugat in der Regel nicht verfügbar, obwohl viele Forschungsarbeiten mit Fettsäuren veröffentlicht worden sind.
Makrophagen express hoch epidermale Fettsäure-bindendes Protein und Fett Fettsäure-bindende Protein5,6,7,8. Sie aktiv Aufnahme gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die ihre Immunfunktionen regulieren kann. Um die Wirkung von Fettsäuren auf Makrophagen und andere Zellen zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden der Fettsäure Vorbereitung angewandte1,7,9. Mit entsprechend vorbereitete Fettsäure/Serum-Albumin-Konjugate, um die Wirkung von Fettsäuren auf Makrophagen Funktion zu untersuchen, ist von entscheidender Bedeutung in biologisch sinnvolle Daten zu erhalten. Studien über die Auswirkungen der Fettsäuren auf Makrophagen Funktion bieten Grundkenntnisse und mögliche therapeutische Ziele in Bezug auf Fettsäure-Stoffwechsel bei Erkrankungen Makrophagen beteiligt.

<table><tbody><tr><td>CPX Ultraschallbad&nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Modell 2800</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpalmitat (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>M.W. 278</td></tr><tr><td>Natriumstearat (SA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), fettsäurefrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (mM-CSF)</td><td>Zellsignaltechnologie&nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-Ceramid-Antikörper (Maus IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Klon: MID 15B4</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgM Antikörper & Mikrokette, FITC Konjugat</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Fixierungspuffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilisierungspuffer</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer für rote Blutkörperchen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Zell-Lifter&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Hinweis: M.W. steht für das Molekulargewicht.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gesättigte fettsäuren induzieren ceramid-assoziierten makrophagen zelltod

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Makrophagen express hoch epidermale Fettsäure-bindendes Protein und Fett Fettsäure-bindendes Protein. Sie aktiv Aufnahme gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immunfunktionen spielen könnte. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass verschiedene Fettsäuren, gesättigt oder ungesättigt, können unterschiedliche Auswirkungen auf das Zellwachstum und die Funktion besitzen. Allerdings variieren die Ansätze für die Fettsäure-Vorbereitung zu unphysiologischen Ergebnissen führen kann. Serum-Albumin, natürliche Träger für Fettsäuren in peripheren Säugetierblut wird empfohlen zur Bildung einer konjugiert komplex mit das Natriumsalz von Fettsäuren, Fettsäure-Funktion in Säugerzellen, minimiert die Toxizität von Fettsäure-Seife zu untersuchen. Somit ist eine einfache, relativ schnelle Heizung und beschallen Methode entwickelt und präsentiert hier für BSA-Fettsäuren konjugierte Säurebildung. Wir beschreiben ein Protokoll mit gesättigten Fettsäuren, vor allem Stearinsäure Säuren zu schweren Zelltod in der Maus Knochenmark abgeleitet Makrophagen induzieren. Wir zeigen weiter, dass gesättigte Fettsäure-induzierte Zelltod mit kumulierten zellulären Ceramid-Spiegel positiv assoziiert ist. Diese Methode kann für Studien über die Auswirkungen der Fettsäure auf andere Säugetier-Zellen erweitert werden.

Fettleibigkeit erhöht freie Fettsäure-Konzentrationen im Serum. Als professionelle Phagozyten aufgreifen Makrophagen aktiv Fettsäuren zu Host Homöostase. Bei diesen Prozessen können überladene Lipide Makrophagen Zelltod auslösen. Zu diesem Zweck wir BMDMs kultiviert in Vitro mit übergewichtigen diätetischen Fettsäuren und gemessenen Makrophagen Zelltod mit Flow durchflusszytometrischen Färbung. Im Vergleich zur BSA-Kontrolle, gesättigten Fettsäuren, induziert insbesondere Stearin...

Wir zeigen eine geradlinige Methode murine primären Makrophagen von Knochenmarkzellen zur Ableitung und eine einfache Methode zur Vorbereitung von BSA-Fettsäure konjugiert. Dann zeigen wir, dass gesättigter Fettsäuren Makrophagen Zelltod induzieren können, und solchen Zelltod positiv assoziiert mit zellulären Akkumulation von Ceramid-Ebenen ist.

Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments, in dem Makrophagen mit gesättigten Fettsäuren behandelt werden, ist es, zu zeigen, dass der Zelltod von gesättigten Fettsäuren durch gesättigte Fettsäuren induzierte Makrophagen mit akkumulierten zellulären Konzentrationen von Ceramiden verbunden ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der metabolischen Entzündung zu beantworten. Wie zum Beispiel: durch gesättigte Fettsäuren induzierter Zelltod und Entzündungen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen einfachen, aber detaillierten Ansatz zum Antrieb von BSA-Fettsäurekonjugaten bietet. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, eine genaue stabile BSA-Fettsäurekonjugatlösung mit konsistenten Ergebnissen herzustellen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Entfernung der Tibia- und Femurknochen einer euthanasierten sechs bis acht Wochen alten gesunden Wildtyp-Maus, wie im Textprotokoll beschrieben.Schneiden Sie beide Enden der Tibia- und Femurknochen mit einer Schere und einer sterilen Gewebekulturhaube auf. Spülen Sie die Knochen mit einer 25-Gauge-Nadel mit PBS plus zwei Prozent fötalem Rinderserum in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 500 g, vier Grad Celsius für fünf Minuten.Als nächstes suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem Milliliter Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen, um die roten Blutkörperchen weniger als eine Minute lang zu lysieren. Verdünnen Sie die Zellen sofort mit neun Millilitern 1x PBS. Nochmals zentrifugieren, wie zuvor, und den Überstand dekantieren.Suspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern 1x PBS. Filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch steriles 40-Mikron-Nylonnetz in ein weiteres 15-Milliliter-Röhrchen, um Zelltrümmer und Klumpen zu entfernen. Nach der Zentrifugation wie zuvor wird das Zellpellet in 15 Millilitern Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 mit fünf Prozent FBS und 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin wieder suspendiert.Dann legen Sie die Zellen in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale und legen Sie sie für 60 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Schwenken Sie die Schale vorsichtig, nehmen Sie die schwimmenden Zellen heraus und zählen Sie sie. Als nächstes werden 6.000.000 Zellen zwei Tage lang in einer 100-Millimeter-Schale mit 12 Millilitern Makrophagen-Differenzierungsmedien und 10 Nanogramm pro Milliliter rekombinanter Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (MCSF) disponiert.Nach einer zweitägigen Kultivierung in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf Prozent CO2 füttern Sie jede Schale mit sechs Millilitern frischem Makrophagen-Differenzierungsmedium, das 10 Nanogramm pro Milliliter MCSF enthält. Nehmen Sie am fünften Tag acht Milliliter des alten Mediums heraus, ohne die Zellen zu stören, und fügen Sie 10 Milliter frisches Makrophagen-Differenzierungsmedium mit 10 Nanogramm pro Milliliter MCSF hinzu. Am siebten Tag entnehmen Sie die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen (BMDMs) mit einem Zelllifter.Bestätigen Sie den Phänotyp der BMDMs durch Durchflusszytometrie, wie im Textprotokoll angegeben. Um das BSA-Fettsäurekonjugat herzustellen, bereiten Sie fünf Millimolare einzelne Natriumsalze von Fettsäuren in zwei Millimolaren BSA vor. Erhitzen Sie die Mischung bei Bedarf auf 37 Grad Celsius oder höher.Dann Sonic Erhitzen Sie die Mischung aus zwei Millimolaren BSA und Natriumsalz der Fettsäuren, bis eine klare Lösung erhalten wird. Nach der Beschallung filtrieren Sie die Fettsäure-BSA-Lösung durch einen 0,22-Mikron-Filter. Anschließend aliquotieren Sie die gefilterte Lösung in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Lagern Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius für den kurzfristigen Gebrauch oder bei minus 20 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Nach der Lagerung bei vier Grad Celsius im Kühlschrank sollte kein Niederschlag mehr zu beobachten sein. Platte der BMDMs in einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 0,4 Millionen Zellen pro Milliliter in Makrophagen-Differenzierungsmedien.Behandeln Sie die Zellen mit der 0,4 millimolaren Palmitinsäure und Stearinsäure für 16 bis 24 Stunden in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf Prozent CO2. Verwenden Sie BSA als Negativkontrolle. Ernten Sie die Zellen nach der Behandlung mit einem Zelllifter.Dann schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 g und vier Grad Celsius herunter. Färben Sie die Zellen mit Annexin V-Alexa 488 und 7-AAD in 100 Mikrolitern Annexin-V-Bindungspuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Probe wird mit 200 Mikrolitern Annexin-Bindungspuffer verdünnt und vorsichtig gemischt.Bewahren Sie die Proben nach der Inkubationszeit auf Eis auf. Analysieren Sie die gefärbten Zellen so schnell wie möglich mittels Durchflusszytometrie. Annexin V-Alexa 488 wird im FITC-Kanal und 7-ADD im PerCP PerCP-Cy5.5-Kanal erkannt.Ernten Sie die Zellen nach der Fettsäurebehandlung wie zuvor. Fixieren Sie dann die Zellen 30 Minuten lang in vier Prozent Paraformaldehyd. Waschen Sie die Probe mit einem Milliter 1x PBS, bevor Sie die Probe wie zuvor herunterschleudern.Nach dem Dekantieren des Überstands werden die Zellen 30 Minuten lang mit Anti-Ceramid-Primärantikörper in 100 Mikrolitern 1x Permeabilisierungspuffer gefärbt. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor gewaschen und zentrifugiert haben, färben Sie die Zellen 30 Minuten lang mit Anti-Maus-IgM-Sekundärantikörper in 100 Mikrolitern 1x Permeabilisierungspuffer. Waschen und schleudern Sie die Zellen wieder wie zuvor herunter.Fügen Sie dann 250 Mikroliter 1x PBS hinzu und analysieren Sie die gefärbten Zellen mittels Durchflusszytometrie. BMDMs wurden in-vitro mit adipösen Mengen an Nahrungsfettsäuren kultiviert und der Zelltod der Makrophagen wurde mittels durchflusszytometrischer Färbung gemessen. Im Vergleich zur BSA-Kontrolle induzierten gesättigte Fettsäuren, insbesondere Sterinsäuren, einen signifikanten Zelltod von BMDMs.Tote Zellen wurden als doppelt positive Population gezeigt, die mit Annexin V und 7-AAD gefärbt wurde. Darüber hinaus ist der durch gesättigte Fettsäuren induzierte Zelltod positiv mit den akkumulierten zellulären Ceramidspiegeln in Makrophagen assoziiert. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man BSA-Fettsäurekonjugationen zubereitet und Makrophagen mit BSA-Fettsäurekonjugaten behandelt, um Zelltod und Entzündungen zu untersuchen.Bei ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der metabolischen Entzündungen, um den durch gesättigte Fettsäuren induzierten Zelltod und Entzündungen bei Fettleibigkeit zu erforschen.

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Um die Wechselwirkung eines Proteins mit seiner Ziel-Lipid verwendeten wir MACS und Annexin V-konjugierten magnetischen Kügelchen und Lipid-Vesikel, die aus der Ziel-Lipid-und Annexin V-Bindung Phosphatidylserin synthetisiert testen. Gebundene Proteine ​​zum Ziel Lipid sind co-gereinigt und analysiert nach der Elution von den Beads.

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Dieses Video zeigt die Aktivierung von Caspase-Proteinen in menschlichen Makrophagen unter Verwendung von bimolekularen Fluoreszenz-Komplementations-Reporterproteinen. Die Pro-Domänen von Caspase-1 sind mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten von Venusproteinen fusioniert, die zu Inflammasom-Komplexen rekrutiert werden. Die Nähe von Inflammasomen induziert die Rückfaltung und Fluoreszenz von Venusfragmenten, was die Caspase-Aktivierung in den Makrophagen bestätigt.

Visualisierung der Caspase-Aktivierung in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Video zeigt die Bewertung mehrerer Caspase-Aktivierungen in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen durch Stimulation mit dem Influenzavirus. Nach der Makrophagenlyse, der Hitzeinaktivierung von Lysat und der Zentrifugation werden intrazelluläre Caspasen für die anschließende immunologische Analyse gesammelt.

Bewertung der Aktivierung multipler Caspasen in Makrophagen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Erfahren Sie, wie gesättigte Fettsäuren Makrophagen-Zelltod induzieren und mit Ceramid-Akkumulation korrelieren. Diese Methode nutzt Knochenmarkszellen von Mäusen und BSA-Fettsäure-Konjugate für metabolische Entzündungsforschung.

Gesättigte Fettsäuren induzieren Ceramid-assoziierten Makrophagen Zelltod

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