Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, von einer einzelnen Maus genügend Zellen aus Spinalganglien und Ischiasnerven zu gewinnen, um eine durchflusszytometrische Analyse der Zellen durchführen zu können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da peripheres neuronales Material bei der Verdauung große Mengen an Ablagerungen erzeugt. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass mehrere Marker gleichzeitig verwendet werden können, um mehrere Zelltypen zu identifizieren.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Entzündungen und Immunpathologien während der Neuropathie. Während diese Methode Einblicke in Mausmodelle geben kann, kann sie mit geringfügigen Modifikationen auch auf andere Organismen wie menschliche und Schweinenerven angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit der Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der großen Mengen an Ablagerungen, die durch die Verdauung erzeugt werden, zu kämpfen haben.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Dissektions- und Zelldissoziationsschritte schwierig durchzuführen sind, da das neuronale Material pro Maus begrenzt ist. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir ein Protokoll sahen, das Schwanenzellen aus dem Ischiasnerv aus dem Labor von Steve Lacroix isolierte. Bereiten Sie zunächst die Maus wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vor und positionieren Sie sie mit der Bauchseite nach unten, während Sie die unteren Gliedmaßen ausstrecken.

Als nächstes verwenden Sie eine Pinzette, um den gesamten Ischiasnerv bilateral zu präparieren. Beginnen Sie damit, das Muskelgewebe vom oberen hinteren Oberschenkel zu trennen und folgen Sie dem Nerv entlang der Wirbelsäule nach oben. Schneiden Sie den Nerv dort durch, wo er aus der Wirbelsäule austritt, und unmittelbar über dem Knie am anderen Ende.

Übertragen Sie dann die herausgeschnittenen Nerven in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 1 Milliliter eiskaltes PBS enthält. Lagern Sie die Nerven auf Eis. Isolieren Sie als Nächstes das Spinalganglion.

Beginnen Sie damit, die Rippen auf beiden Seiten parallel und nahe der Wirbelsäule zu schneiden. Schneiden Sie dann die Wirbelsäule quer auf Höhe der Oberschenkelknochen auf der hinteren Seite und in der Nähe des Schädels auf der vorderen Seite durch. Entfernen Sie die Wirbelsäule und schneiden Sie mit einer Irisschere alle Muskeln, Fette und andere Weichteile von der Wirbelsäule ab.

Legen Sie dann die Wirbelsäule mit der Bauchseite nach oben und öffnen Sie sie, beginnend mit dem kaudalen Ende, indem Sie eine Spitze der Schere in der 12-Uhr-Position in den Wirbelkanal schieben und den Knochen abschneiden. Fahren Sie fort, bis die gesamte Wirbelsäule durchtrennt ist, und wiederholen Sie diesen Vorgang in der Sechs-Uhr-Position, bis die Wirbelsäule halbiert ist. Trennen Sie die beiden Hälften der Wirbelsäule und legen Sie die Probe dann unter ein Seziermikroskop.

Entfernen Sie das Rückenmark, um die Spinalnerven freizulegen, lokalisieren und entfernen Sie dann die lumbalen Spinalwurzelganglionen, indem Sie vorsichtig an der Rückenwurzel ziehen, um sie in die Wirbelkanäle zu ziehen. Als nächstes schneiden Sie mit einer Irisschere die Nerven und das Bindegewebe um das Spinalganglion ab. Übertragen Sie die Spinalganglien mit einer Pinzette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie auf Eis.

Die Spinalganglien zu lokalisieren, sie zu ziehen, ohne sie zu beschädigen, und sie vom Spinalnerv zu befreien, erfordert Übung und Geschicklichkeit. Bereiten Sie ein Aufschlussmedium vor, ergänzen Sie es mit einhundert Mikrogramm pro Milliliter Desoxyribonuklease und lagern Sie es auf Eis. Geben Sie dann 500 Mikroliter Verdauungsmedium in jedes der Röhrchen mit den Ischiasnerven und den Spinalganglien.

Für die Ischiasnerven hacken Sie das Material 15 bis 20 Mal mit einer Federschere und inkubieren dann die Gewebesuspensionen in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten unter leichtem Rühren. Nach der Inkubation die Zellsuspension wiederholt durch eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze zerreiben, um unvollständig verdautes Gewebe mechanisch zu dissoziieren. Wiederholen Sie die Verreibung durch eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze.

Anschließend wird die Probe weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubiert. Bereiten Sie den eiskalten FACS-Puffer vor und spülen Sie damit ein Edelstahlsieb mit einer Maschenweite von 140 Mikrometern in einer 60-Millimeter-Petrischale auf Eis ab und weichen Sie ihn ein. Halten Sie dann mit einer stumpfen Pinzette den 140-Mikron-Siebfilter über die Petrischale und führen Sie die Gewebesuspensionen wiederholt durch den Filter.

Sammeln Sie die Zellsuspension aus der Petrischale und geben Sie sie in dasselbe 1,5-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gelagert wird. Unvollständig verdautes Gewebe, das auf dem Filter verbleibt, durch wiederholtes Verreiben mit einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze durchschieben. Spülen Sie dann den Siebfilter zweimal mit 500 Mikrolitern FACS-Puffer und kombinieren Sie ihn mit der Zellsuspension in der 1,5-Milliliter-Tube.

Wenn zu viel der Probe unvollständig verdaut und durch das Metallgewebe geleitet wird, kann es zu Zellverlust kommen und eine durchflusszytometrische Analyse kann unmöglich sein. Die Zellsuspensionen zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Suspendieren Sie dann das Zellpellet wieder in einem Milliliter FACS-Puffer

Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal und suspendieren Sie das endgültige Zellpellet erneut in 150 bis 350 Mikrolitern FACS-Puffer. Die Zellen sind nun bereit für die Färbung. Wählen Sie am Computer die geeigneten Kanäle für die Detektion der interessierenden Fluorophore, die geeignete Flussrate der Proben und die Gesamtzahl der pro Probe zu erfassenden Ereignisse aus.

Die Mindestanzahl der Ereignisse sollte eine Million betragen. Erstellen Sie als Nächstes Streudiagramme unter einem globalen Arbeitsblatt der Seitenstreuung A im Vergleich zur Vorwärtsstreuung A sowie für jedes interessierende Fluorophor im Vergleich zur Vorwärtsstreuung A. Erstellen Sie außerdem eine Statistikansicht, in der die Anzahl der Ereignisse und die mittlere Fluoreszenzintensität für die ausgewählten Fluorophore angezeigt werden. Bestimmen Sie das übergeordnete Gate P1 basierend auf dem Streudiagramm von DAPI-Steuerelementen, die nur für die Färbung

Hängen Sie die Probe an die Durchflusszytometrie an und klicken Sie auf Erfassen. Beobachten Sie das Diagramm DAPI versus FSC, und reduzieren Sie die Spannung des pazifischen blauen DNA-Kanals, bis die DAPI+-Population sichtbar wird. Zeichnen Sie mit dem Rechteck-Gating-Tool einen Quader um die DAPI+-Population.

Dies stellt das P1-Gatter dar. Wählen Sie die Streudiagramme für jedes der Fluorophore aus, und zeigen Sie nur die DAPI+-Ereignisse an. Dies stellt die Hintergrundfluoreszenz für jedes der Fluorophore dar.

Zeichnen Sie auch mit dem Rechteck-Gating einen Quader in den Streudiagrammen für jedes der Fluorophore, beginnend bei 103 auf der y-Achse. Dieses Gate stellt den Bereich dar, in dem positive Ereignisse für jeden der angegebenen Marker gefunden werden sollten. Passen Sie die Spannungen für jedes der Fluorophore mit den Steuerelementen für die reine DAPI-Färbung an.

Hängen Sie die Probe an die Durchflusszytometrie an und klicken Sie auf Erfassen. Beobachten Sie die Position der DAPI+-Population für jedes der Fluorophore und passen Sie die jeweiligen Spannungen so an, dass die Populationen außerhalb des Rechteckgatters liegen. Nachdem das Durchflusszytometer eingerichtet wurde, führen Sie die Proben aus und exportieren Sie die Forward Scatter-Dateien für die weitere Analyse.

Das Auswaschen der DAPI-Färbung vor der Analyse durch Durchflusszytometrie verringerte die Fluoreszenzintensität der nicht kernhaltigen Trümmer. Dadurch konnte das Material am oberen Ende der Vorwärtsstreuachse, das unvollständig verdautes Gewebe enthält, bei der Selektion der Singulett-Population ausgeschlossen werden. Insgesamt können regelmäßig mehr als 30.000 Einzelstücke aus zwei vollen Ischiasnerven und mehr als 200.000 Einzelstücke aus den Spinalganglien gewonnen werden.

Von den Ischiasnerven exprimierten etwa 5 % der Unterzähler CD45 auf ihrer Oberfläche, während etwa 5 % bis 10 % CD45 in den Spinalganglien exprimierten, wodurch diese Zellen als Leukozyten hämatopoetischen Ursprungs definiert wurden. Ein Großteil der CD45-positiven Singlelets exprimierte auch allmählich MHC-Klasse II. In den Spinalganglien kann CD11b jedoch zum Nachweis von mikroglialartigen Zellen verwendet werden; Diese Mikroglia-Population fehlt an den Ischiasnerven.

Im Ischiasnerv und im Spinalganglion exprimierten 2 bis 5 % der Unterhemden CD68. In den Ischiasnerven exprimierten etwa 60%80% der CD68-positiven Makrophagen CD206. Während ein kleinerer Teil des CD68-positiven CD206 im Spinalganglion co-exprimierte.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine konstante Temperatur zu halten, um ein gleichbleibendes Ergebnis zu gewährleisten. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik Forschern auf dem Gebiet des Diabetes, die toxischen Wirkungen von Streptozotocin zu untersuchen, das zur Induktion von Diabetes bei Mäusen verwendet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Durchflusszytometrie an peripherem neuronalem Gewebe durchführt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd gefährlich sein kann und immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille.