Name: Verwendung von synaptischen Zink Histochemie, verschiedene Regionen und Schichten im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zu offenbaren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Lernen Sie die synaptische Zink-Histochemie zur Darstellung von Schichten und Regionen im sich entwickelnden und erwachsenen Gehirn. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Unterscheidung kortikaler Areale im Frettchenmodell.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Center für Forschungsmittel (2G12RR03060-26A1); Das National Institute on Minderheit Gesundheit und gesundheitliche Ungleichheiten (8G12MD007603-27) von den National Institutes of Health; Professional Personal Kongress-City University of New York (PSC-CUNY); und Faculty Research Grant (BRD II) American University of Sharjah. Wir danken Vidyasagar Sriramoju für die Einführung von uns, diese Methoden.

<ol><li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026685">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li>
<li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li>
<li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li>
<li>Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-positive+boutons+in+the+cerebral+cortex+of+lizards+show+glutamate+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity.</a> J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).</li>
<li>Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+localization+of+synaptic+zinc+in+the+developing+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex.</a> J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).</li>
<li>Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse.</a> Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).</li>
<li>Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+staining+for+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+Parma+wallaby+%28Macropus+parma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma).</a> Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).</li>
<li>Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interdigitated+columnar+mosaic+of+cytochrome+oxidase%2C+zinc%2C+and+neurotransmitter-related+molecules+in+cat+and+monkey+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).</li>
<li>Land, P. W., Akhtar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+alteration+of+synaptic+zinc+in+rat+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex.</a> Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).</li>
<li>Danscher, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00543951">Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds.</a> Histochemistry. 76, 281-293 (1982).</li>
<li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dithizone%2C+Timm%27s+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS%3A+a+proton+activation+%28PIXE%29+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-rich+transient+vertical+modules+in+the+rat+retrosplenial+cortex+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development.</a> J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).</li>
<li>Ichinohe, N., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+macaque+monkey+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala.</a> J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).</li>
<li>Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+callosal+connections+of+visual+areas+17%2C+18%2C+19+and+21+in+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).</li>
<li>Khalil, R., Levitt, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+histochemistry+reveals+circuit+refinement+and+distinguishes+visual+areas+in+the+developing+ferret+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex.</a> Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).</li>
<li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li>
<li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+%28Sciurus+carolinensis.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record%22%5BJournal%5D)">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li>
<li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li>
<li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li>
<li>Timm, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00665092">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorliegende Studie beschäftigt eine histochemische Technik basiert auf einer geänderten Version des Danscher (1982) Methode10, wobei synaptischen Zink Lokalisierung erkannt und im Gehirn sichtbar gemacht werden kann. Diese Methode funktioniert im Wesentlichen durch die Injektion des Tieres mit dem Zink Chelator Natriumselenit (Na2SeO-3) (15 mg/kg). Nach Injektion der Selenit reist zum Gehirn und bindet sich an freie Zink, die zur präsynaptischen Vesikel von Zink mit Neuro...

Histologischen Flecke haben traditionell verwendet, um bei der Identifizierung von kortikalen Areale in der verschiedenen Sorte zu unterstützen, durch die Hervorhebung der Unterschiede in der architektonischen Merkmale. Der kombinierte Einsatz von histochemische Techniken wie z. B. Nissl Substanz, Cytochrom-Oxidase (CO) Reaktivität oder Myelin kann fruchtbare beweisen, wie sie ähnliche areal Grenzen im erwachsenen Gehirn offenbaren. Diese histochemische Flecken zeigen jedoch nicht immer ausreichend klare Grenzen zwischen kortikalen Bereiche und Ebenen im unreifen Gehirn.
In das zentrale Nervensystem hat Zink mehrere wichtige Funktionen, die Stabilisierung der DNA-Struktur, als ein Enzym-Cofaktor, Teilnahme an zahlreichen regulatorischen Funktionen, und als ein Neuromodulator durch seine Präsenz in synaptischen Vesikel enthalten 1. Synaptic Zink ist einzigartig, da es kann mit histologischen Methoden visualisiert werden kann nicht proteingebundene Zink visualisierte2vorzusehen. Diese Funktion wurde um die synaptischen Zink-Muster in verschiedenen kortikalen Regionen offenbaren ausgeschöpft und synaptischen Zink Histochemie wurde in einer Reihe von Studien verwendet. Eine Teilmenge der glutamatergen Neuronen in der Großhirnrinde enthalten Zink in die präsynaptischen Vesikel innerhalb ihrer Axon Klemmen3,4. Histochemische Untersuchungen ergaben eine heterogene Verteilung der synaptischen Zink in der Großhirnrinde5,6,7. Es scheint eine andere areal und flächige Verteilung der histochemically reaktive Zink in unterschiedlichen kortikalen Regionen (z.B., visuellen und somatosensorischen Cortex) oder Schichten (z.B.Zink-Spiegel in den Supragranular und Infragranular Schichten der primären visuellen Cortex sind wesentlich höher als in Thalamocortical Eingabeebene IV mit relativ niedrigen synaptischen Zinkspiegel)5,8,9. Die Heterogenität in der synaptischen Zink Färbung beobachtet im Kortex ist besonders vorteilhaft, da es areal und laminar Identifizierung erleichtert.
Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung eines synaptischen Zink histochemische Verfahrens eine modifizierte Version des Danschers 1982 Methode10 ist. Diese Methode nutzt Selenit intraperitoneal injiziert (IP) in Tiere als ein Chelatbildner. Der Selenit reist zum Gehirn reagieren mit Pools von freien Zink in Vesikeln mit einer Teilmenge der glutamatergen Synapsen im Gehirn gefunden. Diese Reaktion liefert einen Niederschlag, der anschließend durch Silber Entwicklung2,10,11gesteigert werden kann.
Dieses Verfahren zeigt laminar und räumlichen Muster der synaptischen Zink Färbung; densitometrische Analysen kann verwendet werden, um diese Muster im Erwachsenen- und unreifen Gehirn Studie zu Auswirkungen von anderen Interventionen, wie sensorische, Umwelt, pharmakologische oder genetische Manipulationen sowohl qualitativ als auch quantitativ zu bewerten. Darüber hinaus kann man auch mögliche Entwicklungs Veränderungen in der Verteilung der synaptischen Zink in anderen kortikalen und subkortikalen Strukturen in anderen Modellsystemen bewerten wollen. Die quantitative Angaben, die densitometrische Analysen in dieser Methode bietet kann für folgende Entwicklung des Gehirns im Laufe der Zeit vorteilhaft sein. Dieses Protokoll stellt eine Ergänzung zu anderen Immuno und histochemische Marker um laminar und räumlichen Grenzen hinweg sichtbar zu machen.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (Euthanasielösung)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml injizierbare Mittel</td></tr><tr><td>Xylazin (anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml injizierbare Mittel</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>verdünnt bis 4%</td></tr><tr><td>Gummi arabicum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Silberlactat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Fischgelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td> <td>(Typ III, aus Pferdeherzen)</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher</td><td>Scientific X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Wird zur Dehydrierung vor der Diamontage verwendet</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Mattierte Objektträger ohne Untertitel</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Zur Zusammenstellung von Bildern</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Kostenlose Software kann heruntergeladen werden unter http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>Für densometrische Messungen</td></tr><tr><td>Kunststoffschale</td><td>Jede Standard-Kunststoffschale kann zum</td><td>Eintauchen von Dias in die Entwicklerlösung</td>verwendet <td></td> werden</tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Jede Standardkochplatte kann verwendet werden</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von synaptischen zink histochemie, verschiedene regionen und schichten im entwicklungs- und erwachsenen gehirn zu offenbaren

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Charakterisierung der anatomischen und funktionellen Gehirn Organisation und Entwicklung erfordert genaue Identifizierung unterschiedliche neuronale Schaltkreise und Regionen im unreifen und Erwachsenen Gehirn. Hier beschreiben wir eine Zink histochemische Färbeverfahren, die Unterschiede in der Färbung Muster zwischen den verschiedenen Schichten und Hirnregionen offenbart. Andere haben dieses Verfahren nicht nur um die Verteilung von Zink-haltige Neuronen und Schaltkreise im Gehirn zu offenbaren, sondern auch erfolgreich areal und laminare Grenzen im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn in mehrere Arten abgrenzen genutzt. Hier zeigen wir dies Färbeverfahren mit Bildern aus den Entwicklungsländern und Erwachsene Frettchen Gehirne. Wir offenbaren eine Zink-Färbung Muster, die als eine anatomische Marker von Bereichen und Schichten dient und visuelle kortikale Arealen in der Entwicklungs- und Erwachsenen Sehrinde unterscheiden zuverlässig einsetzbar. Das wichtigste Ziel dieses Protokolls ist es, eine histochemische Methode vorzustellen, die erlaubt die genaue Identifikation von Schichten und Regionen im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn wo andere Methoden versagen, dies zu tun. Diese Methode ermöglicht in Verbindung mit densitometrische Bildanalyse, sekundär, zu beurteilen, die Verteilung der synaptischen Zink, mögliche Änderungen in der gesamten Entwicklung zu offenbaren. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Reagenzien, Tools und erforderlichen Schritte zum gefrorenen Gehirn Abschnitte nacheinander zu beflecken. Obwohl dieses Protokoll mit Frettchen Hirngewebe beschrieben ist, kann es leicht für Nagetiere, Katzen oder Affen ebenso wie in anderen Hirnregionen angepasst werden.

Die wichtigsten Schritte dieses Protokoll zum Gehirn Abschnitte für synaptische Zink Fleck beteiligt werden in Form eines Flussdiagramms in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll kann in drei Phasen unterteilt werden: (1) Perfusion und Gewebe Sammlung, Gewebe (2) Vorbereitung und Färbung und (3) Zink Histochemie. Kurz, in der ersten Phase des Protokolls, das Tier wird betäubt und IP mit der entsprechenden Dosis von Natriumselenit injiziert. Nach einer ausreich...

Wir beschreiben eine histochemische Prozedur, die charakteristische laminar und areal Zink Muster in verschiedenen Gehirnregionen Färbung zeigt. Das Zink-Färbung Muster kann in Verbindung mit anderen anatomischen Markierungen verwendet werden, um Schichten und Regionen im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zuverlässig zu unterscheiden.

Verwendung von synaptischen Zink Histochemie, verschiedene Regionen und Schichten im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zu offenbaren

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Durchführung histochemischer Färbungen an gefrorenen Hirnschnitten von Frettchen, um die Verwendung von synaptischen Zinkfärbemustern bei der Unterscheidung verschiedener Regionen und Schichten im sich entwickelnden und erwachsenen Gehirn zu veranschaulichen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zu beantworten, wie z. B. die qualitativen und quantitativen Unterschiede im synaptischen Zinkfärbemuster zwischen verschiedenen Hirnregionen und -schichten. Der Hauptvorteil besteht darin, dass diese Technik einfach und zuverlässig ist und es ermöglicht, verschiedene Regionen und Schichten im sich entwickelnden und erwachsenen Gehirn anhand einzigartiger Färbemuster zu identifizieren.Obwohl diese Methode verwendet wurde, um Einblicke in die Abgrenzung von Bereichen und Schichten im wilden visuellen Kortex zu erhalten, kann sie auch zur Unterscheidung von Schichten in verschiedenen Gehirnregionen von Nagetieren, Katzen oder Primaten verwendet werden. Um 200 Milliliter der Entwicklerlösung herzustellen, fügen Sie 40 Gramm Gummi arabicum langsam zu 120 Millilitern heißem Wasser hinzu und rühren Sie es mit einem Glasstab um, bis es sich vollständig auflöst. Dann lässt es es einige Minuten abkühlen und filtriert es dann durch sechs bis acht Schichten Mulltuch in einem Trichter.Als nächstes 5,04 Gramm Zitronensäure und 4,7 Gramm Natriumcitrat in 20 Milliliter destilliertes Wasser geben und auflösen, um den Citratpuffer herzustellen. Geben Sie dann 1,7 Gramm Hydrochinon in 30 Milliliter erhitztes destilliertes Wasser. Fügen Sie 0,22 Gramm Silberlactat zu 30 Millilitern Wasser hinzu, um Silberlactatlösung herzustellen.Mischen Sie in der folgenden Reihenfolge das Gummi arabicum, den Citratpuffer, das Hydrochinon und schließlich die Silberlactatlösungen, um die Entwicklerlösung vorzubereiten und im Dunkeln zu halten. Um dieses Verfahren zu starten, injizieren Sie dem anästhesierten Frettchen intraperitoneal eine Dosis von 15 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Natriumselenitlösung, einen Zinkchelator. Warten Sie dann 60 bis 90 Minuten, bis die Natriumselenitlösung das Gehirn erreicht.Injizieren Sie dann intraperitoneal eine Überdosis von 100 Milligramm pro Kilogramm Phenobarbital, um das Tier einzuschläfern, und warten Sie einige Minuten, bis Euthasol wirkt. Führen Sie eine transkardiale Perfusion an dem euthanasierten Frettchen zuerst eine Minute lang mit normaler Kochsalzlösung und dann 20 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd durch. Verwenden Sie dann ein Fixiermittel mit Saccharose, um die vollständige Fixierung in einer Stunde abzuschließen.Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt in der Mittellinie von der Nase bis zum Hals zu machen, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn und verwenden Sie dann eine Skalpellklinge, um die Hemisphären zu trennen. Schneiden Sie dann den hinteren Teil ab, trennen Sie ihn vom Rest des Gehirns und fixieren Sie ihn zwei bis vier Stunden lang.Lassen Sie das Gehirn sinken, indem Sie das Gewebe in 30%iger Saccharoselösung in 0,1 molaren Phosphatpuffer aufbewahren. Nachdem das Gehirn abgesunken ist, verwenden Sie ein eiskaltes Gleitmikrotom, um halbtangentiale 40 Mikrometer dicke Schnitte durch den visuellen Kortex zu machen. Sammeln Sie mit einem Pinsel alle Gehirnteile und legen Sie sie in eine Angelbox, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gefüllt ist.Montieren Sie dann schnell ein oder zwei Serien von Gehirnabschnitten auf mit Eiweiß überzogene Objektträger. Bewahren Sie die Objektträger zum Trocknen über Nacht bei Raumtemperatur auf. Nachdem die Objektträger getrocknet sind, tauchen Sie sie 15 Minuten lang in absoluten Alkohol.Warten Sie dann eine Stunde, um die Objektträger vollständig bei Raumtemperatur trocknen zu lassen. Tauchen Sie die Abschnitte schnell 10 Sekunden lang in 1%ige Gelatinelösung und lassen Sie sie dann vorsichtig abtropfen. Bewahren Sie die Abschnitte über Nacht bei Raumtemperatur zum Trocknen auf.Verwenden Sie eine Plastikschale, um die Objektträger nebeneinander anzuordnen. Gießen Sie dann die Entwicklungslösung darüber und stellen Sie sicher, dass die Objektträger vollständig darin eingetaucht sind. Denken Sie daran, die Abschnitte alle 30 Minuten auf die Entwicklung der Reaktion zu überprüfen.Wenn die Objektträger entsprechend fleckig geworden sind, entfernen Sie die auf den Objektträgern montierten Abschnitte aus dem Fach und bewahren Sie die Objektträger auf einem Objektträgergestell auf. Waschen Sie die Objektträger im Objektträgergestell mit einer großen Glasfärbeschale 10 Minuten lang unter fließendem warmem Wasser, um die Gelatineschicht und die äußere Silberablagerung zu waschen. Nachdem Sie die Objektträger bei Raumtemperatur getrocknet haben, dehydrieren Sie sie fünf Minuten lang in 100 % Ethanol und klären Sie sie fünf Minuten lang in Xylol.Legen Sie abschließend ein Deckglas mit Montagemedium auf die Folie. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um die Schnitte zu untersuchen und Bilder von den interessierenden Bereichen zu machen. Wählen Sie zinkgefärbte Schnitte aus Mikroaufnahmen von interessanten Regionen aus, um nach dem Zufallsprinzip kortikale Säulen mit einer Breite von etwa 450 Mikrometern auszuwählen.Wählen Sie in jeder interessierenden Region eine geeignete Anzahl von Probensäulen aus mehreren verschiedenen Gehirnschnitten. Übertragen Sie dann die Spaltenbilder in eine Bildverarbeitungssoftware. Verwenden Sie in der Software das Werkzeug für rechteckige Schnitte, um die gesamte kortikale Spalte zu umfassen.Verwenden Sie als Nächstes das Umkehrwerkzeug, um den Kontrast des Bildes umzukehren. Verwenden Sie dann das Plot-Profil-Werkzeug, um ein zweidimensionales Diagramm der Pixelintensitäten entlang der Linie zu erstellen und optische Dichteprofile aus den Bildern zu erstellen. Verwenden Sie abschließend die Optionen für das Zeichnungsprofil, um das Diagramm des Zeichnungsprofils in ein vertikales Profil umzuwandeln.Klicken Sie dann erneut auf Plotprofil. Mikromikroskopische Aufnahmen von semitangentialen Zink-gefärbten Schnitten des juvenilen Frettchenhirns zeigen die Charakterisierung von über- und untergefärbtem Gewebe. Überfärbtes Gewebe entwickelt eine sehr dunkelbraune Farbe mit unzureichender laminarer Variation und dicht gefärbter weißer Substanz.Im Gegensatz dazu entwickeln unterfärbte Gewebe eine hellbraune Farbe mit minimal fleckiger weißer Substanz. Mikromikroskopische Aufnahmen von semitangentialen Schnitten zeigen die Färbung von synaptischem Zink in der Cytochromoxidase in den visuellen kortikalen Bereichen eines erwachsenen Frettchens. Die Intensität der synaptischen Zinkfärbung ist in den supragranularen und infragranularen Schichten der Bereiche 17 und 18 hoch, während die vierte Schicht leicht färbt.Umgekehrt ist Schicht vier, im Bereich 17 und 18, stark gefärbt, wenn sie auf Cytochromoxidase-Reaktivität gefärbt wird. Säulenmikroskopische Aufnahmen zeigen die laminare Verteilung von synaptischem Zink in allen kortikalen Schichten mit ihren komplementären normierten optischen Dichtewerten. Um die Veränderungen der synaptischen Zinkfärbung in Abhängigkeit von der kortikalen Tiefe widerzuspiegeln, wurden normierte Diagramme der optischen Dichtewerte in jedem visuellen kortikalen Bereich erstellt.Die in den Parzellenprofilen vorhandene Mulde zeigt eine geringe synaptische Zinkfärbung in Schicht vier der Areale 17 und 18. Dieses Verfahren kann helfen zu erklären, ob es im Laufe der Zeit Veränderungen der Entwicklung und der Färbeintensität in bestimmten Hirnregionen gibt. Diese Technik erwies sich für Neuroanatomieforscher als nützlich, um zu untersuchen, wie sensorische, umweltbedingte, pharmakologische oder genetische Manipulationen die Verteilung der synaptischen Zinkfärbung im erwachsenen und unreifen Gehirn bei einer Reihe von Spezies beeinflussen können.Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

Quelle: McLeod, F., et al. Bewertung der Synapsendichte in Hirnschnitten von Hippocampus-Nagetieren. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video demonstriert eine Methode zur Visualisierung synaptischer Marker in hippokampalen Hirnschnitten mittels konfokaler Immunfluoreszenzanalyse. Die Scheiben werden mit primären Antikörpern immungefärbt, die auf präsynaptische und postsynaptische Marker abzielen, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern. Die markierten Marker werden dann mit Hilfe der...

Mikroskopische Analyse von Synapsen in Hippocampusschnitten der Maus mittels Immunfluoreszenz

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Das Protokoll hier skizzierten beschreibt die Immunfluoreszenz-Analyse, Biocytin Erholung und qualitativ hochwertige Rekonstruktionen der hippocampalen CA2 Interneuronen nach der intrazellulären elektrophysiologische Aufnahmen in-vitro- so dass neuronale Charakterisierung und letztlich feine neuronalen Anatomie studiert werden.

Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen

Die Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie und in der Gebärmutter Transduktion ist ein leistungsfähiger Ansatz für das Studium der morphologischer Veränderungen in den feinen Ultrastruktur des Nervensystems während der Entwicklung. Diese kombinierte Methode ermöglicht tiefe Einblicke in Änderungen in Strukturdetails Neuroplastizität in Bezug auf ihre topographische Darstellung zugrunde liegen.

Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Die Kryoschnitt-Dissektion ermöglicht die frische, gefrorene Vorbereitung der größten neurogenen Nische im murinen Gehirn für eine tiefe quantitative Proteomanalyse. Die Methode ist präzise, effizient und verursacht minimale Gewebestörungen. Daher eignet es sich ideal für die Untersuchung der molekularen Mikroumgebung dieser Nische sowie anderer Organe, Regionen und Arten.

Kryoschnitt-Dissektion der adulten subependymalen Zone für genaue und tiefe quantitative Proteomanalyse

Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Quantifizierung zirkadianer Veränderungen im Zylinderkortex der Maus, wobei der Schwerpunkt auf der Synapsenzahl und der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule liegt.

Transmissionselektronenmikroskopie als Visualisierungstechnik zur Analyse der zirkadianen synaptischen Plastizität im Fasskortex der Maus

Lernen Sie die synaptische Zink-Histochemie zur Darstellung von Schichten und Regionen im sich entwickelnden und erwachsenen Gehirn. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Unterscheidung kortikaler Areale im Frettchenmodell.

Verwendung von synaptischen Zink Histochemie, verschiedene Regionen und Schichten im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zu offenbaren (Video) | JoVE Journal

Verwendung von synaptischen Zink Histochemie, verschiedene Regionen und Schichten im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zu offenbaren

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