Name: In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie eine reproduzierbare Zellkultur-Methode zur schnellen phänotypischen Bewertung von Fabry- und Morbus-Pompe-Varianten. Diese Technik unterstützt die Entwicklung pharmakologischer Chaperone.

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Die Autoren möchten Mandy Loebert und Tina Czajka für hervorragende technische Unterstützung zu bestätigen. Wir danken Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) für Sprache bearbeiten.

1. Vorbereitung der Mutant pcDNA3.1/GLA und pcDNA3.1/GAA Konstrukte
Hinweis: Die Klonen Strategien für die GLA und GAA Codierung Sequenzen (Cds) wurden berichtet früher15,18.
<ol>
	<li>Site-verwiesene Mutagenese mit Site-verwiesene Mutagenese
	<ol>
		<li>Verwendung der Verweis Sequenzen NM_000169.2 und NM_000152.4 als Vorlagen für die Mutagenese GLA und GAA Gene. Haben Sie eine Reihe von hochreines Salz frei Primer (25-37-Mers) synthetisiert von einem kommerziellen Anbieter mit Sense und Antisense Primer tragen eine der jeweiligen Sequenz Änderungen zentral auf ihre Länge die Mutation einzeln vorstellen. Nutzen Sie die kostenlose Grundierung-Design-Tool, um Primer Design19zu unterstützen.</li>
		<li>Verwenden Sie für das Reaktionsgemisch die Standardbedingungen für die Reaktionslösung und PCR-Bedingungen des Herstellers.<ol>
			<li>Mix 5 µL 10-fach Puffer Reaktion, 10 ng der Doppelstrang-Vorlage Plasmid DNA (pcDNA3.1/GLA oder pcDNA3.1/GAA), 125 ng jeder Grundierung, 1 µL der bereitgestellten dNTP-Gemisch, 3 µL DMSO Reagenz in einem entsprechenden Volumen von entionisiertem Wasser (endgültige Reaktionsvolumen : 50 ΜL). Zu guter Letzt 2,5 U der DNA-Polymerase und Mischen von Pipettieren rauf und runter. Als Negativkontrolle eine keine-Primer-Probe mitnehmen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Starten Sie die PCR mit dem folgenden Programm: Schritt 1: 95 ° C für 1 min, Schritt 2: 95 ° C für 50 s, Schritt 3: 60 ° C für 50 s, Schritt 4: 68 ° C 8 min, wiederholen Sie Schritt 2 bis 4 18mal und Schritt 5: 68 ° C für 10 Minuten.<ol>
			<li>Nach PCR, fügen Sie 1 µL Dpnich Restriktionsenzym (10 U/µL) und inkubieren Sie weiter die Reaktion Phiole bei 37 ° C für 1 h.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transformation und Screening für den gewünschten Klon
	<ol>
		<li>Eine aliquote ultracompetent Zellen im Einklang mit den Empfehlungen des Herstellers zu verwandeln. Einsatz-SOC-Medium (Tryptone 2 % (w/V) Hefe 0,5 % (w/V) NaCl 10 mM KCl 2,5 mM zu extrahieren, Sterilisation bei 121 ° C, und fügen Sie steril filtriert Lösungen von MgCl2 und Glukose bis Endkonzentrationen von 10 und 20 mM bzw.) anstelle des Herstellers Medium. Nach dem Eingriff Platte 250 µL Sample Mutagenese auf eine LB Platte enthält 100 µg/mL Ampicillin und Inkubation bei 37 ° C für 18 h.</li>
		<li>Versichern, dass die Anzahl der Transformanten ist &#62; 10 und die Reaktion liefert mindestens dreimal so viele Kolonien als der keine-Primer Kontrollreaktion, z.B.mit einer leuchtenden Platte Koloniezahlbestimmung zu erleichtern. Dann wählen Sie 3 Kolonien und bereiten Sie 3 mL über Nacht Kulturen in Brühe LB-Medium.</li>
		<li>Am nächsten Tag, Plasmid-Vorbereitung mit einem standard-Kit durchführen und analysieren die gesamte Sequenz mit T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) und BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) Primer über standard Sanger-Sequenzierung.</li>
		<li>Verwenden Sie ein geeigneter Molekularbiologie-Tool, um die Sequenz zu analysieren. Wenn die gewünschte Mutation erkannt wird und keine weitere Anomalie im Vergleich zu NM_000169.2 (α-Galaktosidase A) Sequenz oder NM_000152.4 (saure α-Glucosidase) ist zu sehen, wählen Sie den Klon zur Transfektion-Grade Plasmid Reinigung.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Reinheit der DNA durch Messung der Absorption in einem Spektrophotometer. Hinweis: Lassen Sie nur Vorbereitungen, die eine Plasmid-Reinheit mit einem 260/280 Extinktion Verhältnis von ergeben &#62; 1,8 für Zelle Kultur Experimente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Anbau von HEK293H Zellen
<ol>
	<li>Halten Sie HEK293H Zellen in hohe Glukose (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Halten Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C unter einer 5 % CO2 Atmosphäre Waterjacket.</li>
	<li>Pflegen Sie die Zellen, die eine Dichte von 80-90 %.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie einmal mit Phosphat Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + und Mg2 gepufferte +.</li>
	<li>Durchgang durch das Hinzufügen von 0,05 % Trypsin-EDTA und 5 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Die Zellen 01:15 in frisches Medium und Samen in einem neuen T75 Kolben, die permanente Kultur beizubehalten aufgeteilt. Verwenden Sie Zellen nicht mit mehr als 25 Passagen.</li>
</ol>
(3) pcDNA3.1/GLA und pcDNA3.1/GAA Plasmid Transfection und Behandlung von HEK293H
<ol>
	<li>24 h vor der Transfektion waschen die HEK293H Zellen in einem T75 Zelle Kultur Kolben einmal mit PBS mit Ca2 +, Mg2 +. Ernte der Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA als oben angegeben und 1,5 x 105 Samenzellen in die Hohlräume einer 24 gut Kultur-Platte mit 500 µL DMEM Medium ergänzt mit 10 % FBS ohne Antibiotika.</li>
	<li>Führen Sie ein Protokoll der Transfektion laut Handbuch des Herstellers. In der Regel verwenden Sie eine Mischung aus 1 µg Plasmid-DNA und 2,5 µL Transfection Reagens in 100 µL serumfreien DMEM. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie und verleihen Sie den Zellen in einer drop-wise Weise danach.</li>
	<li>Die Transfektion Reagenz nach einem Zeitraum von 4 h bei 37 °C/5% CO2 -haltigem Medium entfernen und hinzufügen 500 µL frische DMEM mit 10 % FBS / 1 % Penicillin/Streptomycin. Hinweis: Bei diesem Schritt 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochlorid (DGJ) oder 1-Deoxynojirimycin-Hydrochlorid (DNJ) möglicherweise hinzugefügt dem Kulturmedium wo bestimmt (eine wässrige Stammlösung von 10 mM zu verwenden, um eine Endkonzentration von 20 µM zu erhalten DGJ und DNJ ). Frisch DGJ oder DNJ wurde 42 h nach Plasmid Transfektion hinzugefügt.</li>
</ol>
4. Handy-Ernte und α-Galaktosidase A oder saure α-Glucosidase Aktivitätsmessung
<ol>
	<li>Zellernte
	<ol>
		<li>Am Tag der Ernte entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie sorgfältig die Zellen 2 Mal mit PBS mit Ca2 + und Mg2 +. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, weil DGJ und DNJ potente Inhibitoren der α-Galaktosidase und α-Glucosidase sind und gebliebene würde den Test ungültig.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL deionisiertes Wasser direkt auf die Zellen. Spülen Sie die Zellen aus der Platte und auf eine 1,5 mL Reaktionsgefäß übertragen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenisierung durch Einfrieren und Auftauen
	<ol>
		<li>Setzen Sie die Proben in einem geeigneten Schaum Rack und Wirbel für 5 s, um die Lyse effizienter zu gestalten. Setzen Sie die Proben abwechselnd in flüssigem Stickstoff für 10 s und in einem Wasserbad von Raumtemperatur bis das Auftauen war komplett (5 min).</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang 5 Mal und dann drehen Sie die Proben 5 min bei 10.000 x g.</li></ol></li></ol>Bewahren Sie den Überstand und Pipette in ein neues Reaktionsgefäß.
	
	
	<li>Protein-Konzentrationsbestimmung mit Bicinchoninic Säure (BCA) assay
	<ol>
		<li>Zubereiten einer frischen Röhre für jede Probe mit 40 µL entionisiertem H2O und 10 µL der Probe. Lösung durch Vortexen kurz mischen und 10 µL in einen Hohlraum einer 96-well-Platte (jede Probe in dreifacher Ausfertigung) zu übertragen. Verdünnen Sie eine Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung 2 mg/mL entionisiertem H2O wie folgt zu einer Standardkurve: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.</li>
		<li>Starten die Reaktion durch Zugabe von 200 µL des BCA Reagenz (Reagenz A und Reagenz B gemischt im Verhältnis 50: 1) und inkubieren Sie für 1 h im Dunkeln bei 37 ° C unter leichte Erregung auf einem Orbitalschüttler (300 u/min). Messung der Extinktion bei 560 nm in einem Teller-Reader. Hinweis: Die Proben enthalten in der Regel zwischen 1 und 1,5 µg Protein pro Mikroliter.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Enzym-Aktivitätsmessung mit künstlichen 4-Methylumbelliferyl-Substraten (4-Becher)
	<ol>
		<li>Verdünnen Sie die berechnete Menge von jeder Probe und Pipettieren in frischen 1,5 mL Reaktionsgefäße auf 0,05 (für α-Galaktosidase A) oder (für saure α-Glucosidase) 0,5 µg Protein/µL Lösungen zu erhalten. Wirbel auch die Proben für 5 s wieder und Pipettieren 10 µL dieser Verdünnung in einem 96 Platte (jede Probe in zweifacher Ausfertigung).</li>
		<li>Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 20 µL der jeweiligen Substrat-Lösung: Für α-Galaktosidase A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-Galactopyranoside (4-MU-gal) in 0,06 M Phosphatpuffer Citrat, pH 4,7. Für saure α-Glucosidase: 2 mM 4-Methylumbelliferyl α-D-Glucopyranoside (4-MU-Glu) in 0,025 M Natriumacetat, pH 4.0.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Enzymreaktionen für 1 h im Dunkeln bei 37 ° C unter leichte Erregung auf einem Orbitalschüttler (300 u/min). Beenden Sie die Reaktion durch die Zugabe von 200 µL von 1,0 M, pH 10,5 eingestellte Glycin-NaOH Puffer.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Standardkurve des 4-Methylumbelliferone (4-MU) aus einem 0,01 mg/mL bestand wie folgt: 100 µL H2O / Nein 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; H2O / 100 µL 4-MU, Pipettieren 10 µL jeder Verdünnung in den 96 Brunnen Platte (in Duplikate) und jedes gut 200 µL des Puffers 1,0 M Glycin-NaOH hinzufügen, um die Lautstärke oder pH.</li>
		<li>Maßnahme der Enzym-Aktivität in einem Fluoreszenz-Reader ausgestattet mit dem entsprechenden Filter-Set und analysieren die Daten mit Hilfe der entsprechenden Software für die Fluoreszenz-Lesegerät. Hinweis: Beide 4-Tasse-Substrate werden auf 4-MU während der Belichtung zu α-Galaktosidase A oder saure α-Glucosidase reduziert. Veröffentlicht 4-MU ist ein Fluorochrom, die bei 360 und 465 nm als die Anregung und Emission Wellenlängen bzw. gemessen werden kann mit einer Mikrotestplatte Fluoreszenz-Reader.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Cardiff University. , 
 <a target="_blank" href="http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.">http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.</a> (2017).</li>
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<li>Parenti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chaperone+Enhances+Blood+%CE%B1-Glucosidase+Activity+in+Pompe+Disease+Patients+Treated+With+Enzyme+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy.</a> Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die hierin beschriebene Protokoll liefert robuste Ergebnisse für Enzym Schadensfeststellung in erbliche lysosomale Krankheiten des Stoffwechsels. Diese Handschrift ist eine Änderung des Protokolls früheren15veröffentlicht. Die wichtigsten Änderungen betreffen Stringenz (d. h., in den Prozess der mutierten Vektor Konstrukt Vorbereitung), Standardisierung von der Zelle Kultur Protokoll (d.h., HEK293H Zelle Wartungs- und Transfektion Bedingungen) und die hohe Anzahl der experimentel...

Es gibt über ein Dutzend Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) im Zusammenhang mit Glucosidase Dysfunktion durch primäre Genmutationen. Fabry (OMIM #301500) und Morbus Pompe (OMIM #232300), mehr als 500 und 200 Missense-Mutationen,1,2,3 gemeldet wurden, beziehungsweise, was etwa 60 % des gesamten Mutation Grafen entspricht. Sind noch zahlreiche neue Genvarianten identifiziert, von denen viele haben unbekannte Bedeutung. Umfangreiche biochemische Untersuchungen ergeben, dass bestimmte Genotypen nicht zu einer vollständigen Verlustfunktion des GLA -Gens führen (OMIM * 300644) in Fabry-Krankheit, aber dazu führen, dass das entsprechende Enzym zum Scheitern verurteilt, einen thermodynamisch favorisierten klappbaren Zustand4 erreichen . Dadurch wird ER Retention und vorzeitigen Abbau des ansonsten funktional Enzyms. Ähnliche Schlussfolgerungen wurden in anderen LSDs einschließlich Pompe-Krankheit5gezogen. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung Enzymvarianten erleichtern klinische Interpretation der Mutationen zum Zeitpunkt der Diagnose6, was darauf hindeutet, dass LSD Progression ein individueller Prozess ist, basierend auf der Art der Mutation. Die herkömmliche Einteilung in verschiedene klinische Typen in der Regel 2 bis 3 sollte daher überprüft werden, um klinische Beratung und therapeutische Entscheidungen zu straffen.
Enzym-Ersatz-Therapie (ERT) ist für beide Krankheiten verfügbar. ERT, hat jedoch nur begrenzte Wirksamkeit im betroffenen Gewebe/Organe wie das Gehirn und Skelettmuskulatur. Darüber hinaus kann ERT eine immunogen Reaktion auslösen, die die therapeutischen Vorteile gefährdet. Pharmakologische Chaperonen (PCs) sind eine attraktive Behandlungsalternative für Patienten mit so genannten reagieren Mutationen. PCs dienen als molekulare Gerüst für korrekte Proteinfaltung und Stabilisierung, die wiederum endoplasmatische Retikulum (ER) Aufbewahrung und ER verbundenen Abbau des Enzyms verhindert. Darüber hinaus PCs können oral verabreicht werden und sind möglicherweise in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke. Daher möglicherweise PCT eine praktikable Option für die Behandlung von Patienten mit bestimmten Genotypen. Für eine umfassende Überprüfung auf PC-Anwendung in LSDs beziehen sich auf die ausgezeichnete Bewertung von Parenti7.
Die Entdeckung von Hunderten von krankmachenden mutierten Allele fordert prä-klinischen Drogentests und erfordert eine einfache, schnelle und hoch standardisierte Bewertung zugänglich Patienten für eine personalisierte Medizin-Ansatz. Bei der Beurteilung der schädlichen Auswirkungen von LSD-Gen-Mutationen und Kandidat Mutationen zu zugänglich Patienten für PCT Vorhersagen zu testen, war ein hoch standardisierten Überexpression System in HEK293H Zellen, die für schnelle und zuverlässige Enzym Aktivitätsmessung ermöglicht entwickelt. Ähnliche Überexpression Systeme für Fabry und Pompe-Krankheit mit COS-78,9,10,11, HeLa Zellen12oder HEK293 beschriebenen13 ,14,15,16 Zellen für die gen-Glucosidase.
Eine sehr ähnliche Methode wurde sogar als "Methode zur Reaktion auf die pharmakologische Chaperon Behandlung von Krankheiten Vorhersagen" patentiert17 zeigt die Relevanz einer Zelle Kultur System integrierbar in die klinische Praxis.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL Site-Directed Mutagenese Kit&nbsp;</td><td>Stratagene, La Jolla, CA, USA</td><td>#200522</td><td></td></tr><tr><td>Primer GLA[R301Q]-frw: 5&akut;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&akut;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[R301Q]-rev: 5&acute;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-rev: 5&acute;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A156V]-frw: 5&acute;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GLA[A143T]-rev: 5&acute;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-frw: 5&acute;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[F455Y]-rev: 5&acute;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-frw: 5&acute;-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[L552P]-frw: 5&acute;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>GAA[P545L]-rev: 5&acute;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>T7: 5&acute;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Primer</td><td></td></tr> <tr><td>BGHrev: 5&acute;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&acute;</td><td>MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Deutschland</td><td>n.a.Trypton</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>103.753</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.064.041.000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.049.360.500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.058.330.250</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-Glukosemonohydrat</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.083.422.500</td><td></td></tr><tr><td>Natronlauge</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.064.980.500</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>3908,2</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>X863.3</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.065.860.500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1.062.640.050</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma Aldrich, München, Deutschland</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>ZymoResearch, Freiburg, Deutschland</td><td>D4020</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>HEK293H Zelllinie</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland</td><td>11631-017&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&akut; s modifizierter Eagle Medium&nbsp;</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>HyClone fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>GE Healthcare, South Logan, Utah, USA</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Standard Zellkulturflaschen, Greiner Bio One</td><td>VWR International GmbH, Hannover, Deutschland</td><td>82050-854</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten (24 Well)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>831.836</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Platte</td><td>Greiner bio one, Frickenhausen, Deutschland</td><td>655185</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Reaktionsgefäße, 1,5mL&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>1-Desoxygalactonojirimycinhydrochlorid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, München, Deutschland</td><td>D9641</td><td></td></tr><tr><td>1-Desoxygalactonojirimycin-Hydrochlorid</td><td>Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada</td><td>D236500</td><td></td></tr><tr><td>1-Desoxynojirimycin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, München, Deutschland</td><td>D9305</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco ohne Calcium, ohne Magnesium</td><td>Biochrom, Berlin, Deutschland</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Deutschland</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific, Braunschweig, Deutschland</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferon</td><td>Sigma Aldrich, München, Deutschland</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &alpha;-D-Galactopyranosid</td><td>Sigma Aldrich, München, Deutschland</td><td>M7633</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &alpha;-D-Glucopyranosid</td><td>Sigma Aldrich, München, Deutschland</td><td>M9766</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer </td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Typ T6</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland</td><td>n.a.Leuchtplatte</td><td></td></tr> <tr><td>Gr. 2 E</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>P265.1</td><td></td></tr><tr><td>3130 xl Genetischer Analysator&nbsp;</td><td>Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland</td><td>n.a.GFL-3032</td><td></td></tr> <tr><td>Bakterienschüttler</td><td>GFL, Burgwedel, Deutschland&nbsp;</td><td>n.a.Avanti</td><td></td></tr> <tr><td>J-25 Zentrifuge</td><td>Beckman/Coulter, Krefeld, Deutschland</td><td>n.a.Ultraspec</td><td></td></tr> <tr><td>3100 pro Spektralphotometer</td><td>Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Großbritannien</td><td>n.a.Inkubator</td><td></td></tr> <tr><td>für Wassermantel</td><td>Binder, Tuttlingen, Deutschland</td><td>n.a.Vortex</td><td></td></tr> <tr><td>Genie 1 Touch Mixer</td><td>Scientific Industries, Bohemia, NY, USA</td><td>n.a.Z</td><td></td></tr> <tr><td>233 MK-2 gekühlte Mikroröhrchenzentrifuge</td><td>Hermle, Tuttlingen, Deutschland&nbsp;</td><td>n.a.LaboStar</td><td></td></tr> <tr><td>Reinstwassergerät</td><td>Siemens, Berlin, Deutschland</td><td>n.a.Thermoschüttler</td><td></td></tr> <tr><td>PST-60HL-4 Orbitalschüttler</td><td>Biosan, Riga, Lettland</td><td>n.a.Tecan</td><td></td></tr> <tr><td>GENios Reader</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Schweiz</td><td>n.a.HI</td><td></td></tr> <tr><td>223 Mikroprozessor pH</td><td>Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal</td><td>n.a.CASY</td><td></td></tr><<tr><td>br/> Zellzähler + Analysesystem Modell TT</td><td>Innovatis AG, Cham/Zug, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</strong</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magellan Datenanalysesoftware v6.6</td><td>Tecan, M&auml; nnedorf, Schweiz</td><td>n.a.GraphPad</td><td></td></tr> <tr><td>Prism 5.04</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA</td><td>n.a.Microsoft</td><td></td></tr> <tr><td>Office 2010</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA</td><td>n.a.BioEdit</td><td></td></tr> <tr><td>Alignment Editor, V7.0.1</td><td>http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Abkürzungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>frw = forward; rev = reverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n.a. = nicht zutreffend</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro- enzym-messung, test pharmakologische chaperon reaktionsfähigkeit in fabry und morbus pompe

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

Die Nutzung der personalisierten Medizin zur Behandlung von seltener monogenen Krankheiten wie Lysosomale Speichererkrankungen (LSDs) wird durch komplexe klinische Versuch-Designs, hohe Kosten und geringen Patientenzahlen herausgefordert. Hunderte von mutierten Allelen sind in den meisten der LSDs verwickelt. Die Krankheiten sind in der Regel in 2 bis 3 verschiedene klinische Typen nach Schweregrad eingestuft. Darüber hinaus kann molekulare Charakterisierung des Genotyps helfen, vorherzusagen, klinische Ergebnisse und Patientenversorgung zu informieren. Daher haben wir einen einfache Zelle Kultur Assay basierend auf HEK293H Zellen heterologously Ausdruck über die Mutationen identifiziert Fabry und Pompe-Krankheit entwickelt. Eine ähnliche Test wurde vor kurzem als präklinischen Prüfung zugänglich Mutationen für pharmakologische Chaperon Therapy (PCT) im Fabry-Krankheit zu identifizieren eingeführt. Dieses Manuskript beschreibt eine geänderte Zelle-Kultur-Probe, die ermöglicht schnelle phänotypische Beurteilung der allelischen Varianten Fabry und Pompe-Krankheit, geeignete Patienten für PCT zu identifizieren und möglicherweise Hilfe bei der Entwicklung von neuartigen Pharmacochaperones.

Die Mutagenese-Verfahren Zur Bewertung der Effizienz der GLA -gen Mutagenese wurden Mutationen in einer der folgenden Kategorien eingestuft. Dieser Ansatz um Mutationen zu erzeugen ergab, dass etwa 66,5 % der GLA Mutationen im ersten Versuch erhalten wurden. Weitere 25 % konnte nach einem leicht modifizierten zweiten PCR abgerufen werden.
Kategorie 1: Die Mutagenese PCR wirksam war beim erst...

Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von "Orphan" Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

Das übergeordnete Ziel dieses geänderten Zellkulturprotokolls ist es, eine schnelle phänotypische Bewertung der allelischen Varianz bei Morbus Fabry und Pompe zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der lysosomalen Speicherkrankheiten zu beantworten, wie z.B. prognostische Ergebnisse und Therapieentscheidungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochgradig reproduzierbar ist und bei der Entwicklung neuartiger Medikamente, wie z. B. Pharmako-Chaperone, helfen kann.Um eine ortsgerichtete Mutagenese durchzuführen, verwenden Sie zunächst die Referenzsequenzen NM 00169.2 und NM 00152.4 als Matrizen für die Mutagenese der GLA- bzw. GAA-Gene. Verwenden Sie das kostenlose Primer-Design-Tool, um das Primer-Design zu unterstützen. Lassen Sie dann einen Satz hochreiner, salzfreier Primer von einem kommerziellen Anbieter synthetisieren, wobei Sense- und Antisense-Primer eine der jeweiligen Sequenzmodifikationen tragen, die zentral für ihre Länge sind, um die Mutation individuell einzuführen.Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem Volumen von 50 Mikrolitern vor und führen Sie das PCR-Programm unter den vom Hersteller bereitgestellten und im Textprotokoll aufgeführten Standardbedingungen durch. Nach der PCR fügen Sie einen Mikroliter des Dpn1-Restriktionsenzyms hinzu und inkubieren Sie die Reaktionsgefäße eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Umwandlung der Plasma-DNA in kompetente E.coli-Zellen und der Vorbereitung von Plasmiden der gewünschten Transformation gemäß dem Textprotokoll wird ein geeignetes molekularbiologisches Werkzeug verwendet, um die Sequenz zu analysieren.Wenn die gewünschte Mutation nachgewiesen wurde und keine weitere Sequenzanomalie im Vergleich zu NM 000169.2 für Alpha-Galactosidase A oder NM 000152.4 für saure Alpha-Galactosidase zu sehen ist, wählen Sie den Klon für die Plasmidaufreinigung in Transfektionsqualität aus. Bestimmen Sie die Reinheit der DNA, indem Sie die Extinktion in einem Spektralphotometer messen. Nach der Kultivierung HEK293H Zellen in einem T75-Kulturkolben gemäß dem Textprotokoll ist 24 Stunden vor der Transfektion PBS ohne Calcium oder Magnesium zu verwenden, um die Zellen einmal zu waschen.Mit 0,05 % Trypsin-EDTA werden die Zellen geerntet und in den Hohlräumen einer 24-Well-Kulturplatte 500 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS ergänzt, um die fünf Zellen 1,5 mal 10 zu säen. Führen Sie die Zelltransfektion gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers durch. Unter Verwendung einer Mischung aus einem Mikrogramm Plasmid-DNA, gelöst in 100 Mikrolitern serumfreiem DMEM und 2,5 Mikrolitern Transfektionsreagenz.Inkubieren Sie die Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und geben Sie sie dann tropfenweise zu den Zellen. Nach einem Zeitraum von vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 entfernen Sie das Medium, das das Transfektionsreagenz enthält, und fügen Sie 500 Mikroliter frisches DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin hinzu. Fügen Sie während dieses Schritts optional DGJ oder DNJ zum Kulturmedium hinzu, wo dies beabsichtigt ist.Am Tag der Ernte entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Aspirieren Sie dann das Medium und verwenden Sie PBS mit Calcium und Magnesium, um die Zellen zweimal vorsichtig zu waschen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da DGJ und DNJ Inhibitoren beider Enzyme sind und daher jeder Rest den Test ungültig machen würde.Nach dem Waschen 200 Mikroliter deionisiertes Wasser direkt auf die Zellen geben. Spülen Sie dann die Zellen von der Platte ab und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Legen Sie die Proben in ein geeignetes Schaumstoffgestell und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang, um die Lyse effizienter zu gestalten.Wechseln Sie dann die Proben 10 Sekunden lang zwischen flüssigem Stickstoff und einem Wasserbad bei Raumtemperatur ab, bis das Auftauen abgeschlossen ist. Nachdem Sie den Homogenisierungsvorgang fünfmal wiederholt haben, drehen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 10.000 g. Dann überführen Sie den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß.Um den BCA-Assay durchzuführen, bereiten Sie für jede Probe mit 40 Mikrolitern deionisiertem H20 ein frisches Röhrchen vor und fügen Sie 10 Mikroliter Probe hinzu. Mischen Sie jede Lösung durch kurzes Vortexen und überführen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in dreifacher Ausfertigung in die Hohlräume einer 96-Well-Platte. Um eine Standardkurve herzustellen, verdünnen Sie eine BSA-Stammlösung von 2 Milligramm pro Milliliter und deionisiertes H2O gemäß dem Textprotokoll.Nach dem Kombinieren von Reagenz A und Reagenz B starten Sie die Reaktion, indem Sie 200 Mikroliter der BCA-Reagenzlösung hinzufügen und die Proben im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 300 U/min auf einem Orbitalschüttler eine Stunde lang inkubieren. Messen Sie dann die Absorption bei 560 Nanometern in einem Plattenleser. Die Proben enthalten typischerweise zwischen einem und 1,5 Mikrogramm Protein pro Mikroliter.Verdünnen Sie die berechnete Menge jeder Probe und pipettieren Sie sie in frische 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen, um 0,05 Mikrogramm Alpha-Galactosidase A oder 0,5 Mikrogramm saure Alpha-Glucosidase pro Mikroliter Lösung zu erhalten. Die Proben werden erneut fünf Sekunden lang vortexiert und 10 Mikroliter dieser Verdünnung in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte pipettiert. Starten Sie die Reaktionen durch Zugabe von 20 Mikrolitern der jeweiligen Substratlösung.Für Alpha-Galactosidase A fügen Sie zwei millimolare 4-Methylumbelliferyl-alpha-D-Galactopyranosid oder 4-MU-gal in 0,06 molaren Phosphatcitratpuffer mit einem pH-Wert von 4,7 hinzu. Für saure Alpha-Glucosidase fügen Sie 2 Millimolare 4-Methylumbelliferyl alpha-D-Glucopyranosid oder 4-MU-glu in 0,025 molaren Natriumacetat, pH 4,0, hinzu. Inkubieren Sie die Enzymreaktionen eine Stunde lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 300 U/min auf einem Orbitalschüttler.Beenden Sie dann die Reaktion, indem Sie 200 Mikroliter 1,0 molaren pH-angepassten Glycin-Natriumhydroxid-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie eine Standardkurve von 4-MU aus einem Stamm von 0,01 Milligramm pro Milliliter gemäß dem Textprotokoll vor und pipettieren Sie 10 Mikroliter der Lösungen in zweifacher Ausführung in eine 96-Well-Platte. Geben Sie 200 Mikroliter des 1,0-molaren Glycin-Natriumhydroxid-Puffers in jede Vertiefung, um das Volumen und den pH-Wert einzustellen.Messen Sie abschließend die Enzymaktivität in einem Fluoreszenz-Reader, der mit dem entsprechenden Filterset ausgestattet ist. Und analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software für das Fluoreszenz-Lesegerät. Um die Effizienz der GLA-Genmutagenese zu bewerten, wurden die Mutationen in drei Kategorien eingeteilt und es zeigte sich, dass etwa 66,5% im ersten Versuch erreicht wurden.Weitere 25 % konnten nach einer leicht modifizierten zweiten PCR gewonnen werden. In Kategorie drei mussten mehr Anstrengungen unternommen werden, wie z. B. die Neugestaltung des Primers, um den gewünschten Klon zu erhalten. Diese Tabelle bezieht sich auf die Messergebnisse der Enzymaktivität für drei Alpha-Galactosidase A- und drei saure Alpha-Glucosidase-Mutationen, die entweder unbehandelt oder mit DGJ und DNJ behandelt wurden.Die Daten werden als absolute Werte für den Substratumsatz dargestellt und haben relative Werte, die auf das Wildtyp-Enzym normiert sind. Die absoluten Enzymaktivitätsdaten wurden um die endogene Enzymaktivität der HEK293H Zellen korrigiert, wobei Zellen verwendet wurden, die mit einem leeren pcDNA 3.1-Vektor transfiziert wurden. Die Enzymaktivitätswerte wurden auf Wildtyp-Enzyme aus entsprechenden Experimenten normiert, was die Abweichung der relativen Werte zwischen den verschiedenen Mutanten erklärt.Nach der Beherrschung kann die Nachzellkulturfraktion dieses Experiments, die den größten Teil der praktischen Zeit ausmacht, innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der lysosomalen Speicherkrankheiten, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei Morbus Fabry und Pompe zu untersuchen. Dieses Protokoll kann bei der Entwicklung neuartiger Medikamente gegen lysosomale Speicherkrankheiten helfen.

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Forschung

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Medicine

Medizin

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In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

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