In-vitro- Enzym-Messung, Test pharmakologische Chaperon Reaktionsfähigkeit in Fabry und Morbus Pompe

Es ist eine Forderung, prä-klinischen Tests für eine neuartige Klasse von "Orphan" Medikamenten, den sogenannten pharmakologischer Chaperonen reproduzierbar, schnell und effizient zu machen. Wir entwickelten einen einfache, hoch standardisiert und vielseitige Zelle kulturbasierte Assay zum Bildschirm für geeignete Patienten sowie neuartige pharmakologische Chaperon Medikamente.

Das übergeordnete Ziel dieses geänderten Zellkulturprotokolls ist es, eine schnelle phänotypische Bewertung der allelischen Varianz bei Morbus Fabry und Pompe zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der lysosomalen Speicherkrankheiten zu beantworten, wie z.B. prognostische Ergebnisse und Therapieentscheidungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochgradig reproduzierbar ist und bei der Entwicklung neuartiger Medikamente, wie z. B. Pharmako-Chaperone, helfen kann.

Um eine ortsgerichtete Mutagenese durchzuführen, verwenden Sie zunächst die Referenzsequenzen NM 00169.2 und NM 00152.4 als Matrizen für die Mutagenese der GLA- bzw. GAA-Gene. Verwenden Sie das kostenlose Primer-Design-Tool, um das Primer-Design zu unterstützen. Lassen Sie dann einen Satz hochreiner, salzfreier Primer von einem kommerziellen Anbieter synthetisieren, wobei Sense- und Antisense-Primer eine der jeweiligen Sequenzmodifikationen tragen, die zentral für ihre Länge sind, um die Mutation individuell einzuführen.

Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem Volumen von 50 Mikrolitern vor und führen Sie das PCR-Programm unter den vom Hersteller bereitgestellten und im Textprotokoll aufgeführten Standardbedingungen durch. Nach der PCR fügen Sie einen Mikroliter des Dpn1-Restriktionsenzyms hinzu und inkubieren Sie die Reaktionsgefäße eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Umwandlung der Plasma-DNA in kompetente E.coli-Zellen und der Vorbereitung von Plasmiden der gewünschten Transformation gemäß dem Textprotokoll wird ein geeignetes molekularbiologisches Werkzeug verwendet, um die Sequenz zu analysieren.

Wenn die gewünschte Mutation nachgewiesen wurde und keine weitere Sequenzanomalie im Vergleich zu NM 000169.2 für Alpha-Galactosidase A oder NM 000152.4 für saure Alpha-Galactosidase zu sehen ist, wählen Sie den Klon für die Plasmidaufreinigung in Transfektionsqualität aus. Bestimmen Sie die Reinheit der DNA, indem Sie die Extinktion in einem Spektralphotometer messen. Nach der Kultivierung HEK293H Zellen in einem T75-Kulturkolben gemäß dem Textprotokoll ist 24 Stunden vor der Transfektion PBS ohne Calcium oder Magnesium zu verwenden, um die Zellen einmal zu waschen.

Mit 0,05 % Trypsin-EDTA werden die Zellen geerntet und in den Hohlräumen einer 24-Well-Kulturplatte 500 Mikroliter DMEM mit 10 % FBS ergänzt, um die fünf Zellen 1,5 mal 10 zu säen. Führen Sie die Zelltransfektion gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers durch. Unter Verwendung einer Mischung aus einem Mikrogramm Plasmid-DNA, gelöst in 100 Mikrolitern serumfreiem DMEM und 2,5 Mikrolitern Transfektionsreagenz.

Inkubieren Sie die Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und geben Sie sie dann tropfenweise zu den Zellen. Nach einem Zeitraum von vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 entfernen Sie das Medium, das das Transfektionsreagenz enthält, und fügen Sie 500 Mikroliter frisches DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin hinzu. Fügen Sie während dieses Schritts optional DGJ oder DNJ zum Kulturmedium hinzu, wo dies beabsichtigt ist.

Am Tag der Ernte entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Aspirieren Sie dann das Medium und verwenden Sie PBS mit Calcium und Magnesium, um die Zellen zweimal vorsichtig zu waschen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, da DGJ und DNJ Inhibitoren beider Enzyme sind und daher jeder Rest den Test ungültig machen würde.

Nach dem Waschen 200 Mikroliter deionisiertes Wasser direkt auf die Zellen geben. Spülen Sie dann die Zellen von der Platte ab und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Legen Sie die Proben in ein geeignetes Schaumstoffgestell und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang, um die Lyse effizienter zu gestalten.

Wechseln Sie dann die Proben 10 Sekunden lang zwischen flüssigem Stickstoff und einem Wasserbad bei Raumtemperatur ab, bis das Auftauen abgeschlossen ist. Nachdem Sie den Homogenisierungsvorgang fünfmal wiederholt haben, drehen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 10.000 g. Dann überführen Sie den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß.

Um den BCA-Assay durchzuführen, bereiten Sie für jede Probe mit 40 Mikrolitern deionisiertem H20 ein frisches Röhrchen vor und fügen Sie 10 Mikroliter Probe hinzu. Mischen Sie jede Lösung durch kurzes Vortexen und überführen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in dreifacher Ausfertigung in die Hohlräume einer 96-Well-Platte. Um eine Standardkurve herzustellen, verdünnen Sie eine BSA-Stammlösung von 2 Milligramm pro Milliliter und deionisiertes H2O gemäß dem Textprotokoll.

Nach dem Kombinieren von Reagenz A und Reagenz B starten Sie die Reaktion, indem Sie 200 Mikroliter der BCA-Reagenzlösung hinzufügen und die Proben im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 300 U/min auf einem Orbitalschüttler eine Stunde lang inkubieren. Messen Sie dann die Absorption bei 560 Nanometern in einem Plattenleser. Die Proben enthalten typischerweise zwischen einem und 1,5 Mikrogramm Protein pro Mikroliter.

Verdünnen Sie die berechnete Menge jeder Probe und pipettieren Sie sie in frische 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen, um 0,05 Mikrogramm Alpha-Galactosidase A oder 0,5 Mikrogramm saure Alpha-Glucosidase pro Mikroliter Lösung zu erhalten. Die Proben werden erneut fünf Sekunden lang vortexiert und 10 Mikroliter dieser Verdünnung in doppelter Ausführung in eine 96-Well-Platte pipettiert. Starten Sie die Reaktionen durch Zugabe von 20 Mikrolitern der jeweiligen Substratlösung.

Für Alpha-Galactosidase A fügen Sie zwei millimolare 4-Methylumbelliferyl-alpha-D-Galactopyranosid oder 4-MU-gal in 0,06 molaren Phosphatcitratpuffer mit einem pH-Wert von 4,7 hinzu. Für saure Alpha-Glucosidase fügen Sie 2 Millimolare 4-Methylumbelliferyl alpha-D-Glucopyranosid oder 4-MU-glu in 0,025 molaren Natriumacetat, pH 4,0, hinzu. Inkubieren Sie die Enzymreaktionen eine Stunde lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius und 300 U/min auf einem Orbitalschüttler.

Beenden Sie dann die Reaktion, indem Sie 200 Mikroliter 1,0 molaren pH-angepassten Glycin-Natriumhydroxid-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie eine Standardkurve von 4-MU aus einem Stamm von 0,01 Milligramm pro Milliliter gemäß dem Textprotokoll vor und pipettieren Sie 10 Mikroliter der Lösungen in zweifacher Ausführung in eine 96-Well-Platte. Geben Sie 200 Mikroliter des 1,0-molaren Glycin-Natriumhydroxid-Puffers in jede Vertiefung, um das Volumen und den pH-Wert einzustellen.

Messen Sie abschließend die Enzymaktivität in einem Fluoreszenz-Reader, der mit dem entsprechenden Filterset ausgestattet ist. Und analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software für das Fluoreszenz-Lesegerät. Um die Effizienz der GLA-Genmutagenese zu bewerten, wurden die Mutationen in drei Kategorien eingeteilt und es zeigte sich, dass etwa 66,5% im ersten Versuch erreicht wurden.

Weitere 25 % konnten nach einer leicht modifizierten zweiten PCR gewonnen werden. In Kategorie drei mussten mehr Anstrengungen unternommen werden, wie z. B. die Neugestaltung des Primers, um den gewünschten Klon zu erhalten. Diese Tabelle bezieht sich auf die Messergebnisse der Enzymaktivität für drei Alpha-Galactosidase A- und drei saure Alpha-Glucosidase-Mutationen, die entweder unbehandelt oder mit DGJ und DNJ behandelt wurden.

Die Daten werden als absolute Werte für den Substratumsatz dargestellt und haben relative Werte, die auf das Wildtyp-Enzym normiert sind. Die absoluten Enzymaktivitätsdaten wurden um die endogene Enzymaktivität der HEK293H Zellen korrigiert, wobei Zellen verwendet wurden, die mit einem leeren pcDNA 3.1-Vektor transfiziert wurden. Die Enzymaktivitätswerte wurden auf Wildtyp-Enzyme aus entsprechenden Experimenten normiert, was die Abweichung der relativen Werte zwischen den verschiedenen Mutanten erklärt.

Nach der Beherrschung kann die Nachzellkulturfraktion dieses Experiments, die den größten Teil der praktischen Zeit ausmacht, innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der lysosomalen Speicherkrankheiten, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei Morbus Fabry und Pompe zu untersuchen. Dieses Protokoll kann bei der Entwicklung neuartiger Medikamente gegen lysosomale Speicherkrankheiten helfen.