Name: Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von Thalamocortical Axon-Verzweigung und Synapsenbildung in organotypischen Kokulturen. Diese Methode ermöglicht die simultane Beobachtung dynamischer morphologischer Veränderungen in lebenden Zellen.

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Wir danken auch Gabriel Hand für kritisches Lesen.

Alle Versuche wurden nach den Richtlinien festgelegten Tierschutz Ausschüsse von Universität von Osaka und Japan Neurowissenschaftliche Gesellschaft durchgeführt.
(1) organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde
Hinweis: Die detaillierte Vorgehensweise finden Sie in der ursprünglichen Publikationen7,8,13. Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Sprague-Dawley (SD) Ratten werden für neuronale Kulturen verwendet.
<ol><li>
Vorbereitung der Reagenzien Hinweis: Bände der folgenden Reagenzien sind für eine Rattengehirn.<ol>
<li>
Vorbereitung 10 x modifizierte N2-Ergänzung 13: Insulin (50 μg/mL), Progesteron (200 nM), Hydrocortison (200 nM), Natriumselenit (300 nM), Transferrin (1 mg/mL), Putrescin (1 mM), Glukose (60 mg/mL)</li>
		<li>
Prepare Serum-haltigen Kulturmedium (10 mL): 85 % DMEM/F12, 10 X geändert N2 Zuschlag von 10 %, 5 % fetalen bovine Serum (FBS)</li>
		<li>
Prepare serumfreien Kulturmedium (20 mL): 90 % DMEM/F12, 10 X geändert N2 Zuschlag von 10 %</li>
		<li>Bereiten Sie Ratte Schweif Kollagen Lösung (0,5 mL). In Kürze nehmen zartere Fasern aus einem Rattenschwanz unter sterilen Bedingungen und brüten in Essigsäure-Lösung über Nacht. Nach Zentrifugation den überstand (ein paar mg/mL) erheben und speichern in einem Kühlschrank-13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zubereitung von Speisen Kultur
	<ol>
<li>Legen Sie einen Membran-Einsatz in einer 35 mm Petrischale.</li>
		<li>Die Membran 40-50 μL der Ratte Schweif Kollagen-Lösung hinzu, und verbreiten Sie die Kollagen-Lösung um das Zentrum herum zu.</li>
		<li>Die Membran vollständig in einer sauberen Werkbank der Luft trocknen lassen.</li>
		<li>Setzen Sie 1,5-2 mL Serum-haltigen Kulturmedium in die Schüssel, so dass die Membran mit dem Medium getränkt ist.</li>
		<li>Legen Sie die Kulturschale in einem Inkubator (37 ° C, feuchte Luft von 95 % und 5 % CO2) vor der Beschichtung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der kortikalen Scheiben
	<ol>
<li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 % igem Ethanol für 10 min oder länger.</li>
		<li>Sezieren das ganze Gehirn schnell von einem postnatalen Tag (P) 2 Ratte eiskalte Narkose (mitten in der Eis-Chips für ein paar Minuten).</li>
		<li>Ort des Gehirns in eine 100 mm Petrischale mit 100 mL kaltem Hanks ausgewogen Salzlösung.</li>
		<li>Die Pia Angelegenheit aus dem Gehirn zu entfernen, mit feinen Zangen und kortikale Scheiben (300-400 μm Dicke) aus der visuellen und somatosensorischen Kortex mit mikrochirurgischen Schere schneiden (für Details siehe Abbildung 1). Hinweis: Die Dicke der kortikalen Scheiben wird durch das Ausmaß der Netze unter einem Binokular grob geschätzt. Hinweis: Alternativ können kortikale Scheiben mit einem Vibratome unter sterilen Bedingungen erfolgen.</li>
		<li>Ein paar kortikale Scheiben auf die Membran-Einlage mit einer Einweg-Kunststoff-Pipette zu übertragen.</li>
		<li>Stellen Sie die Positionen der Scheiben in der Mitte des Kultur-Einsatzes mit einer feuerpolierte Pasteurpipette (für Details, siehe8,13) und entfernen Sie überschüssiges Mittel aus dem einfügen. Hinweis: Der Pegel des Mediums etwas unterhalb der Oberfläche der Scheiben, so dass die Scheiben eine ausreichende Versorgung mit Gas und Medium erhalten können. Dies ist entscheidend für die Zellviabilität.</li>
		<li>Pflegen Sie die Scheiben in der Serum-haltigen Nährmedium bei 37 ° C in einem Umfeld von befeuchtete 95 % Luft und 5 % CO2und Kultur allein für einen Tag, bevor ein Thalamische Block genommen und daneben platziert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Thalamische Blöcke
	<ol>
<li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 % igem Ethanol für 10 min oder länger.</li>
		<li>Eine schwangere Ratte (embryonale 15.Tag) durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg/kg), enthält Betäubungsmittel zu betäuben.</li>
		<li>Sezieren Sie jedes Embryo aus den uterinen Hörnern zu, und legen Sie die Embryonen in einem 100 mm Petrischale mit 100 mL kaltem Hanks ausgeglichene Salzlösung.</li>
		<li>Unter einem Binokular das Gehirn von jedem Embryo und schneiden Sie Thalamische Blöcke enthalten vor allem die Ventrobasal komplex und seitlichen gekniet Kern (ca. 0,5 mm x 3)7 mit mikrochirurgischen Schere (siehe Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur und pflegen organotypischen Kokulturen
	<ol>
<li>Mit einer Pasteurpipette, legen Sie die Thalamische Block neben der ventrikulären Oberfläche der kortikalen Schicht auf die Membranfilter erteilte.</li>
		<li>Pflegen Sie die Kokulturen in das Serum-haltigen Nährmedium bei 37 ° C in einem Umfeld von befeuchtete Luft von 95 % und 5 % CO2.</li>
		<li>Tauschen Sie die Hälfte des Mediums mit dem Kulturmedium serumfreien nach zwei Tagen in der Kultur. Danach tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage. Hinweis: Das Niveau des Mediums sollte nach den Datenträgeraustausch überprüft werden, da es wichtig für das Überleben der Zelle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Elektroporation
Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
Hinweis: Führen Sie durch Elektroporation einen Tag nach der Vorbereitung der Thalamische Blöcke, Ablösung der Blöcke zu verhindern.
<ol><li>
Plasmide
	<ol>
<li>Machen Sie eine Mischung aus Plasmide wie folgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL. Hinweis: Die beiden Plasmide mit einem Endotoxin-freie Maxiprep-Kit zu reinigen und in Hanks ausgeglichene Salzlösung auflösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroporation Gerät einrichten Die elektrischen Instrumente wie ein Stimulator und ein Isolator sollte angeschlossen werden, wie in Abbildung 2dargestellt.<ol>
<li>Verbinden Sie den Stimulator mit biphasischen Isolator.</li>
		<li>Verbinden Sie eine Elektrode (ein Silberdraht 0,2 mm Durchmesser) mit dem Minuspol des Isolators.</li>
		<li>Eine Elektrode (ein Silberdraht 1 mm Durchmesser) in Reihe zu einem 100 Ω Widerstand und der Pluspol des Isolators anschließen.</li>
		<li>Verbinden Sie den Verstärker mit dem Oszilloskop zu überwachen, ob elektrische Ströme über den Widerstand übergeben werden, durch die Messung der Spannung mit dem Verstärker.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von Glaspipetten Hinweis: Zwei Arten von Glaspipetten Auswurf der Plasmid-Lösung und Anwendung elektrischer Impulse dienen.<ol>
<li>Machen Sie die Pipetten von Glaskapillaren mit einer Elektrode Abzieher.</li>
		<li>Die Tipp für die Auswurf-Pipette (der Kopfkreis sollte 20-50 μm) zu brechen.</li>
		<li>Schleifen Sie und Polieren Sie der Elektrode Pipettenspitze mit Sandpapier gefolgt von Feuer-polieren (der innere Durchmesser sollte 50-200 µm). Hinweis: Die Elektrodenspitze sollte flach und glatt, wie es das Gewebe direkt berührt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verfahren der Elektroporation
	<ol>
<li>Verbinden Sie die Auswurf und Elektrode Pipetten mit der Manipulatoren.</li>
		<li>Legen Sie ein Silberdraht (0,2 mm Durchmesser) in die Elektrode Pipette.</li>
		<li>Legen Sie die Auswurf-Pipette auf eine 1 mL Spritze mit einem Kunststoffrohr.</li>
		<li>Nehmen Sie > 5 μl Plasmid-Lösung in die Auswurf-Pipette durch Spritze absaugen.</li>
		<li>Legen Sie die Coculture auf der Bühne Elektroporation, und legen Sie die 1 mm Durchmesser Elektrode in das Kulturmedium.</li>
		<li>Legen Sie die Auswurf-Pipette auf die Thalamische Explant.</li>
		<li>Schieben Sie die Spritze manuell, nachdem die Spitze die Oberfläche des Thalamische Blocks berührt. Hinweis: Über 0,5 μL des Plasmids wird die Lösung in der Regel pro Thalamische blockweise eingesetzt.</li>
		<li>Legen Sie die Elektrode Pipette auf Thalamische Block unmittelbar nach der Rücknahme der Auswurf Pipette.</li>
		<li>Elektrische Impulse (50-400 μA, 3 bis 5 Züge der 200 Quadratmeter Impulse von 1 ms Dauer bei 200 Hz) zu liefern. Die Amplitude und die Anzahl der Züge auf dem Oszilloskop zu überwachen. Hinweis: Die Amplitude der elektrischen Ströme hängt von der Innendurchmesser eine Elektrode Pipette13.</li>
		<li>Die Elektrode Pipette zurückziehen und das Gericht in den Inkubator zurück.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikroskopische Beobachtung
	<ol>
<li>Setzen der Kulturschale auf einer mikroskopischen Bühne eine aufrechte confocal Mikroskop, ausgestattet mit zwei Filter-Sets für EGFP (Erregung, 488 nm, Emission, 515 nm) und DsRed (Erregung, 514 nm, Emission, 565 nm).</li>
		<li>Nehmen Sie Bilder von 10-25 optischen Abschnitte am 1-7 µm-Schrittweiten mit einem 20 X lange arbeitende Abstand Objektiv. Wählen Sie individuell unterscheidbar beschrifteten Axone die DsRed und SYP-EGFP ausdrücken. Hinweis: Die beobachteten Bereich ist ca. 0,7 x 0,7 mm (entspricht 1024 x 1024 Pixel, d. h., 0,68 μm/Pixel).</li>
		<li>Die Aufnahmen Sie alle 24 h für die tägliche Bildgebung. Innerhalb von 10 min bei Raumtemperatur, und schicken Sie die Kulturen in den Inkubator. Halten Sie für kurz-Intervallzeit Zeitraffer Bildgebung die Kultur in einer Kultur-Kammer, die behauptet, dass die Umwelt von 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 ° c befeuchtet</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
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<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
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<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das aktuelle Protokoll ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, Entwicklungsaspekte der wachsenden Axone anders als der TC Projektion11zu studieren. Zum Beispiel ermöglicht eine Kombination der kortikalen Stück Kultur und die Elektroporation Technik Visualisierung einzelner axonalen Morphologie der kortikalen Neuronen und langfristige Beobachtung9,18.
Mithilfe des aktuellen Protokolls können die Rollen von intere...

Die Thalamocortical (TC) Projektion in das Gehirn von Säugetieren ist ein geeignetes System, Axon Guidance und targeting Mechanismen zu untersuchen. Während der Entwicklung wachsen sensorische TC Axone in die kortikale Platte und Form Zweige und Synapsen bevorzugt in Schicht IV der primären sensorischen Bereiche in der Großhirnrinde1,2. Auch nach Gründung der grundlegenden Verbindungen sind abhängig von Veränderungen der Umwelt3,4axonalen Lauben und synaptischen Terminals umgebaut. Jedoch wie TC Axon Morphologie dynamisch geändert ist schlecht verstanden. Einer der Hauptgründe ist das Fehlen einer angemessenen Technik, strukturelle Veränderungen auf eine einzelne Zellenebene zu beobachten. Obwohl jüngste Entwicklungen in der Mikroskopie, wie zwei-Photonen-Mikroskopie, direkten Beobachtung von lebenden kortikale Neuronen in Vivoerlaubt haben, gibt es noch technische Einschränkungen für die Erfassung der gesamten TC Trajektorien5, 6. daher, in-vitro- Methoden für live Aufnahmen von TC Axone böte leistungsstarke Tools für Strukturanalysen der Axon verzweigen und Synapse Formation.
Unsere Gruppe zum ersten Mal gegründet eine statische Slice-Kultur-Methode mit durchlässige Membran7. Mit dieser Methode eine Ratte kortikalen Scheibe war mit einem sensorischen Thalamische Block cocultured und Lamina-spezifische TC Verbindungen wurden in diesem organotypischen Kokulturen7,8zusammengefaßt. Spärliche Beschriftung mit einem fluoreszierenden Protein weiter konnten wir beobachten, TC Axon Wachstum und Zweig Bildung9,10,11. Vor kurzem haben wir eine neuartige Methode zur gleichzeitigen Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in die organotypischen cocultures12. Um TC Axone und präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren, waren DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation organotypischen Coculture. Die aktuelle Methode morphologische Analyse des TC Axone erleichtert und ermöglicht eine langfristige Beobachtung, die verwendet werden können, um den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung zu zeigen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyklon</td></tr><tr><td></td><td>Insulin Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma& nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Wako Pure Chemische Industrie</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM Einsatz</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>Petrischale sterrile</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>Sterile Einwegpipetten aus Kunststoff</td><td>202-IS</td><td>Transferpipetten</td><td></td> steril</tr><tr><td>Glaskapillare: AD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; G-1.2</td><td>Innendurchmesser, 1.2 mm</td></tr><tr><td>Silberdraht: 0.2 und 1 mm&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (Durchmesser, 0,2 mm), AG-401485 (Durchmesser, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>Biphasischer Isolator&nbsp;</td><td>BAK ELECTRONICS</td><td>BSI-2</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker&nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Modell 1800</td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Universal-Standfuß</td><td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbeleuchtungssystem&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Digital Eclipse C1 Laser</td><td></td></tr><tr><td>x20 Objektiv</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0,45</td><td></td></tr><tr><td>Kulturkammer</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) Ratte</td><td>Japan SLC und Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgie-Schere</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von thalamocortical axon verzweigung und synapse bildung in organotypischen kokulturen

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon verzweigen und Synapse Bildung sind entscheidende Prozesse für die Festlegung der genauen neuronale Schaltkreise. Während der Entwicklung bilden sensorische Thalamocortical (TC) Axone Zweige und Synapsen in bestimmten Schichten der Großhirnrinde. Trotz der offensichtlichen räumliche Korrelation zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung ist die kausale Beziehung zwischen ihnen kaum verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir vor kurzem eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in organotypischen Kokulturen entwickelt.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode besteht aus einer Kombination von organotypischen Coculture und Elektroporation. Organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde erleichtern, Genmanipulation und Beobachtung der axonalen Prozesse, Erhaltung der charakteristischen Strukturen wie laminar Konfiguration. Zwei unterschiedliche Plasmide Codierung DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) wurden Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation-Technik. Diese Methode erlaubt uns, individuelle axonalen Morphologien von TC Neuronen und ihren präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren. Die Methode aktiviert auch Langzeit-Beobachtung, der den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung offenbart.

Das Experiment beschriebenen hier zielt darauf ab, die Beziehung zwischen TC Axon verzweigen und Synapse Bildung zu offenbaren. Um gleichzeitig visualisieren axonalen Flugbahnen und Standorte der präsynaptischen Seiten, einzelne oder wenige Thalamische Zellen in organotypischen Kokulturen wurden mit zwei Plasmide Codierung SYP-EGFP und DsRed mit Elektroporation transfiziert. In der zweiten Woche in Kultur wurden individuell unterscheidbar TC Axone durch DsRed (Abbildu...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, dynamische morphologische Veränderungen der Axonverzweigung und Synapsenbildung in der thalamokortikalen Projektion zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, wie z. B. die Bildung neuer neuronaler Schaltkreise. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die gleichzeitige Beobachtung des Axonwachstums und der Synapsenbildung in einzelnen lebenden Zellen.Diese Methode kann Aufschluss über den Zusammenhang zwischen Axonverzweigung und Synapsenbildung in den thalamokortikalen Projektionen geben. Es kann auch auf andere neuronale Schaltkreise angewendet werden, wie z. B. die intrinsische Verbindung in der Großhirnrinde. Um diesen Eingriff zu beginnen, sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente 10 Minuten oder länger mit 70% Ethanol.Als nächstes sezieren Sie schnell das gesamte Gehirn einer Ratte nach der Geburt am zweiten Tag unter eiskalter Narkose. Legen Sie dann das Gehirn in eine 100-Millimeter-Petrischale, in der sich 40 Milliliter kalte Hank's Balanced Salt Solution befinden. Entfernen Sie unter einem binokularen Mikroskop vorsichtig mit einer feinen Pinzette die Pia-Materie

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

Quelle: Winkle, C. C., et al. Unter Verwendung kombinierter Methoden zur Definition der Rolle der Plasmamembranabgabe während der Axonverzweigung und der neuronalen Morphogenese. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine Live-Imaging-Technik mit Hilfe der Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC), um die axonale Verzweigung in kortikalen Neuronen in Echtzeit zu beobachten. Zeitraffervideos zeigen die Auswirkungen der Behandlung mit Netrin-1, einem Signalmolekül, das lokalisierte...

Echtzeit-In-vitro-Bildgebung der axonalen Verzweigung in kortikalen Neuronen der Maus

Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Verwenden von mehreren Winkeln Sie die Maus pup Gehirn zu schneiden, verbessern wir die auf einem zuvor beschriebenen akuten Hirnschnitt, die die Verbindungen zwischen den meisten der großen auditorischen Mittelhirn und Vorderhirnstrukturen erfasst.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das am Rückenmark Scheiben auf Multielektrodenarrays kultiviert, um funktionelle Regeneration propriospinale Verbindungen in vitro-Studie basiert.

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.

Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten Säugetier-Rinde

In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Primäre sensorische Areale im Neokortex zeigen während der Entwicklung einzigartige spontane Aktivitäten. In diesem Artikel wird beschrieben, wie einzelne Neuronenaktivitäten und primäre sensorische Areale visualisiert werden können, um bereichsspezifische synchrone Aktivitäten bei neugeborenen Mäusen in vivo zu analysieren.

In vivo Visualisierung der spontanen Aktivität im sensorischen Kortex von Neonatalen Mäusen mit einer Auflösung von einzelnen Neuronen

Erfahren Sie die Visualisierung von Thalamocortical Axon-Verzweigung und Synapsenbildung in organotypischen Kokulturen. Diese Methode ermöglicht die simultane Beobachtung dynamischer morphologischer Veränderungen in lebenden Zellen.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

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