Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen
28. März 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, dynamische morphologische Veränderungen der Axonverzweigung und Synapsenbildung in der thalamokortikalen Projektion zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, wie z. B. die Bildung neuer neuronaler Schaltkreise. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die gleichzeitige Beobachtung des Axonwachstums und der Synapsenbildung in einzelnen lebenden Zellen.
Diese Methode kann Aufschluss über den Zusammenhang zwischen Axonverzweigung und Synapsenbildung in den thalamokortikalen Projektionen geben. Es kann auch auf andere neuronale Schaltkreise angewendet werden, wie z. B. die intrinsische Verbindung in der Großhirnrinde. Um diesen Eingriff zu beginnen, sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente 10 Minuten oder länger mit 70% Ethanol
.Als nächstes sezieren Sie schnell das gesamte Gehirn einer Ratte nach der Geburt am zweiten Tag unter eiskalter Narkose. Legen Sie dann das Gehirn in eine 100-Millimeter-Petrischale, in der sich 40 Milliliter kalte Hank's Balanced Salt Solution befinden. Entfernen Sie unter einem binokularen Mikroskop vorsichtig mit einer feinen Pinzette die Pia-Materie und schneiden Sie den primären visuellen und somatosensorischen Kortex mit einer mikrochirurgischen Schere in 300 bis 400 Mikrometer dicke Scheiben.
Übertragen Sie danach die kortikalen Scheiben mit einer Einweg-Kunststoffpipette auf den Membranfilter des Kultureinsatzes. Passen Sie die Positionen der Scheiben in der Nähe der Mitte des Kultureinsatzes mit der Einwegpipette aus Kunststoff an und entfernen Sie überschüssiges Medium aus dem Einsatz. Halten Sie die Scheiben in dem serumhaltigen Nährmedium bei 37 Grad Celsius und kultivieren Sie sie einen Tag lang alleine, bevor Sie einen Thalamusblock eines E15-Embryos daneben legen.
Stellen Sie den Füllstand des Mediums etwas unterhalb der Oberfläche der Scheibe ein, so dass die Scheiben sowohl mit dem Gas als auch mit dem Medium ausreichend versorgt werden können. Dies ist entscheidend für die Lebensfähigkeit der Scheiben. In diesem Schritt stellen Sie die Glaskapillaren mit einem Elektrodenabzieher her.
Brechen Sie dann die Spitzen der Glaskapillaren für die Plasmidinjektion. Für die Elektrodenpipetten schleifen und polieren Sie die Spitzen der Glaskapillaren mit Schleifpapier. Und dann feuerpoliert man sie, um einen Innendurchmesser von 50 bis 200 Mikrometern zu erreichen.
Befestigen Sie anschließend die Elektrodenpipette und die Auswurfpipette an den Manipulatoren. Übertragen Sie fünf Mikroliter Plasmidlösung in eine Petrischale. Ziehen Sie dann die Lösung mit Kapillarwirkung in die Elektrodenpipette.
Führen Sie die Elektrode mit einem Durchmesser von 0,2 Millimetern in die Elektrodenpipette ein. Nachdem Sie die Ejitionspipette mit einer Ein-Milliliter-Spritze mit einem Kunststoffröhrchen verbunden haben, geben Sie erneut fünf Mikroliter Plasmidlösung in eine Petrischale. Ziehen Sie dann die Lösung langsam mit der Spritze in die Ejektpette.
Anschließend übertragen Sie die Kokultur auf den Elektroporationstisch und führen die Elektrode mit einem Durchmesser von einem Millimeter in das Kulturmedium ein. Platzieren Sie anschließend die Ejemalpipette auf dem kultivierten Thalamusblock. Drücken Sie die Spritze manuell, nachdem die Spitze die Oberfläche des Thalamusblocks berührt hat.
Setzen Sie die Elektrodenpipette unmittelbar nach dem Zurückziehen der Eduktionspipette auf den Thalamusblock. Geben Sie nun die elektrischen Impulse ab. Überwachen Sie die Amplitude und die Anzahl der Züge auf dem Oszilloskop.
Ziehen Sie anschließend die Elektrodenpipette zurück und stellen Sie die Schale wieder in den Inkubator. Um die Probe zu beobachten, stellen Sie die Kulturschale auf den Tisch eines aufrechten konfokalen Mikroskops, das mit zwei Filtersets für EGFP und DsRed ausgestattet ist. Nehmen Sie dann Bilder von 10 bis 25 optischen Abschnitten in Schritten von einem bis sieben Mikrometern mit einem Objektiv mit 20-fach langem Arbeitsabstand auf.
Wählen Sie einzeln unterscheidbare markierte Axone aus, die sowohl DsRed als auch Syp-EGFP exprimieren. Hier ist eine organotypische Kokultur von thalamischen und kortikalen Schnitten nach 12 DIV zu sehen. Hier sehen Sie ein vergrößertes Bild des eingerahmten Bereichs.
Und hier ist eine DsRed-markierte Thalamuszelle, die ein Axon in den kortikalen Slice ausdehnt und Äste in den oberen Schichten bildet. Diese Bilder zeigen das DsRed-markierte thalamokortikale Axon und Syp-EGFP puncta. Eine diskrete Akkumulation von Syp-EGFP wurde entlang eines einzelnen thalamokortikalen Axons beobachtet.
DsRed plus Syp-EGFP Plasmide wurden bei einem DIV mittels Elektroporation in kultivierte Thalamuszellen eingebracht. Dieses Axon wurde über einen Zeitraum von vier Tagen täglich abgebildet. Die Axonverzweigung und die Synapsenbildung verliefen dynamisch, mit Addition und Eliminierung.
Im Anschluss an diese Verfahren kann eine Elektroporation mit interessanten Genen zusammen mit Syp-EGFP und DsRed durchgeführt werden, um die Rolle des Gens bei der Axonverzweigung und Synapsenbildung zu untersuchen. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg, um die Mechanismen dynamischer Veränderungen neuronaler Schaltkreise zu erforschen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die simultane Abbildung der Verzweigung thalamokortikaler Axone und der Synapsenbildung in organotypischen Kokulturen aus Thalamus und Großhirnrinde vor. Sie konzentriert sich auf dynamische morphologische Veränderungen in der thalamokortikalen Projektion und liefert Einblicke in die Bildung neuer neuronaler Schaltkreise sowie in den Zusammenhang zwischen Axonwachstum und Synapsenentwicklung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neurobiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Thalamokortikale Projektionen spielen eine entscheidende Rolle bei der sensorischen Verarbeitung.
- Das Verständnis von Axonverzweigungen und Synapsenbildung ist entscheidend, um Einblicke in die Entstehung neuronaler Schaltkreise zu gewinnen.
- Bisherige Methoden weisen Einschränkungen bei der gleichzeitigen Beobachtung dieser Veränderungen auf zellulärer Ebene auf.
- Die Studie verbessert Techniken zur Bildgebung in lebenden Zellkontexten.
Zweck der Studie
- Um dynamische morphologische Veränderungen während der Axonverzweigung und Synapsenbildung zu untersuchen.
- Um eine Methode bereitzustellen, die die Beobachtung einzelner lebender Zellen in einer Kokultur ermöglicht.
- Um die Beziehung zwischen Axonwachstum und synaptischer Entwicklung in thalamokortikalen Neuronen zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Es wurden organspezifische Kokulturen von thalamischen und kortikalen Schnitten verwendet.
- Gewebeproben vom zweiten postnatalen Tag der Ratte dienten zur Erstellung des biologischen Modells.
- Elektroporation wurde durchgeführt, um fluoreszierende Marker für die Bildgebung einzuführen.
- Die Kulturen wurden bei 37 Grad Celsius gehalten und zu bestimmten entwicklungsbedingten Zeitpunkten beobachtet.
- Die Bildgebung erfolgte mittels konfokalem Mikroskop, um axonale Dynamiken aufzuzeichnen.
Hauptergebnisse
- Es wurden dynamische Veränderungen in der Axonverzweigung und Synapsenbildung beobachtet, die die Plastizität thalamokortikaler Projektionen verdeutlichen.
- Es wurde eine diskrete Anreicherung synaptischer Marker entlang der Axone festgestellt, was auf eine andauernde synaptische Entwicklung hinweist.
- Mithilfe der Technik war eine Echtzeitbeobachtung morphologischer Veränderungen einzelner Zellen möglich.
- Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial, die Rolle von Genen bei der Dynamik von Axonen und Synapsen zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine neuartige Methode zur Erforschung der Dynamik und Plastizität neuronaler Schaltkreise.
- Sie liefert Einblicke in die Kopplung von Axonwachstum und Synapsenbildung.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf das Verständnis der Mechanismen neuronaler Vernetzung und Plastizität in Gesundheit und Krankheit.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Diese Methode ermöglicht die simultane Visualisierung von Axonverzweigungen und Synapsenbildung in lebenden neuronalen Schaltkreisen und schließt damit eine wichtige mechanistische Lücke bei der Zielvalidierung in der neurodevelopmentalen Forschung. Durch die Bereitstellung dynamischer, zellulärer Einzelzell-Daten zur strukturellen Plastizität unterstützt sie die Vorhersagegenauigkeit in frühen Entwicklungsphasen, in denen die mechanistische Risikominimierung synaptischer Zielstrukturen entscheidend ist. Der Ansatz bietet eine translationale Kontinuität von mechanistischen Erkenntnissen hin zur präklinischen Bewertung phänotypischer Veränderungen auf Ebene des Schaltkreises in Modellen neuropsychiatrischer Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die eine Verbindung zwischen Axonmorphologie und synaptischer Konnektivität in thalamokortikalen Bahnen herstellen.
- Operativer Wert: Erhält die laminare Architektur und neuronale Vitalität, um eine longitudinale Beobachtung dynamischer struktureller Veränderungen zu ermöglichen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem kausale Zusammenhänge zwischen strukturellem Wachstum und funktioneller Synaptogenese geklärt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, multiplexe Messgrößen zur axonalen Verzweigung und Akkumulation präsynaptischer Marker für die Assay-Standardisierung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Analyse neurodevelopmentaler Signalwege.
- Operativer Wert: Erleichtert skalierbare, reproduzierbare Bildgebungsaufarbeitungen, die mit multiplexen fluoreszierenden Messgrößen kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung krankheitsrelevanter Systeme, bei denen eine Dyskonnektivität zwischen Thalamus und Cortex zu sensorischen und kognitiven Phänotypen beiträgt.
- Operativer Wert: Schafft eine lückenlose Übertragung von der entdeckungsorientierten mechanistischen Untersuchung bis zur präklinischen Validierung einer funktionellen Wiederherstellung auf Schaltwerkebene.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem strukturelle Dynamiken mit funktionellen synaptischen Ergebnissen verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie die direkte Beobachtung struktureller Plastizität vor funktionellen Assayergebnissen in Modellen neuronaler Schaltkreise ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Genen, die die Dynamik der Axonverzweigung und die Bildung synaptischer Stellen in lebenden Schaltkreisen regulieren.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative morphologische Daten und Daten zu fluoreszierenden Pünktchen für die Profilierung von Substanzeffekten.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich der Verzweigungshäufigkeit und der Synapsendichte unter verschiedenen experimentellen Bedingungen über die Zeit.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischen Modellen neuroentwicklungsbedingter Störungen, die Veränderungen der thalamokortikalen Bahnen aufweisen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform für die multiparametrische Bewertung von Neuritogenese und Synaptogenese in verschiedenen neuronalen Modellen.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Mehrdeutigkeit bei Struktur-Funktions-Beziehungen während der neuronalen Schaltkreisbildung verringert wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert Zweikanal-Bildgebungsabläufe für eine konsistente, langfristige Verfolgung axonaler und synaptischer Dynamiken.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch mechanistische Belege zur Zielstruktureinbindung in Signalwege der strukturellen Plastizität.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Effekten auf die Kopplung von Axon und Synapse in für den Menschen relevanten Schaltkreisen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von organspezifischen Kokulturen, Elektroporation und konfokaler Mikroskopie.
- Abhängig von steriler chirurgischer Ausrüstung, der Herstellung von Mikropipetten und der Qualität der Plasmid-DNA für eine effiziente Transfektion.
- Benötigt eine Umweltkontrolle bei 37 °C und ein serumhaltiges Medium, um die Lebensfähigkeit der Schnitte über mehrere Tage hinweg aufrechtzuerhalten.
- Die Anpassung an alternative neuronale Schaltkreise erfordert die Validierung der Gewebeverträglichkeit und der Elektroporationseffizienz.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität der Transfektionseffizienz sowie die Notwendigkeit einer nachträglichen Bildanalyse zur Quantifizierung der Verzweigungs- und Punktadynamik.
