Name: Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie das AGM-Explantatkulturverfahren zur Untersuchung der hämatopoetischen Stammzellentwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse regulatorischer Faktoren durch Expressionsanalysen und Koloniebildungsassays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Suwei Gao für Hilfe bei der Vorbereitung der Figur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (81530004, 31425016) und das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2016YFA0100500). J.l. die Experimente durchgeführt und das Manuskript verfasst; F.l. bearbeitet das Manuskript. Beide Autoren gelesen und genehmigt das endgültige Manuskript.

alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen von der ethischen Review Committee im Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China genehmigt worden.
 1. Material Vorbereitung <ol><li>Sterilisation der 0,65 µm Filter mit UV Strahlen produziert unter dem ultravioletten Strahl der Lampe auf die sauberen Werkbank für 4 h und die Filter nach 2 h-Kennzeichen umdrehen. 
	Hinweis: Wenn Sie mit UV-Licht arbeiten, entsprechende Verschleißschutz.</li>
	<li>Edelstahl-Netze mit dem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C für 30 Minuten sterilisieren. 
	Hinweis: Eine bestimmte Höhe Edelstahlgeflecht ist notwendig, um die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit zu unterstützen und dadurch realisiert werden, mit dem Draht auf das Stahlgitter ( Abb. 1 A).</li>
	<li>Verdünnen Fluoxetin, eine Endkonzentration von 10 µM in langfristige M5300 Kultur Medium und Mischung gleichmäßig. 
	Hinweis: Für eine sechs-Well-Platte ist 2 mL M5300 langfristige Kulturmedium für jedes gut geeignet. Hydrocortison bei 10 -6 M kann selektiv in das Medium verdünnt werden.</li>
	<li>Das Medium ergänzt mit Fluoxetin bei 10 µM in sechs-Well Platten oder Gerichte zu übertragen und setzen die sterilisierten Edelstahl-Gitter in das Medium.</li>
	<li>Waschen die 0,65 µm-Filter mit kochendem Wasser zwei Mal für 3 Minuten jedes Mal in der Kulturschale Glas Zelle für die Sterilisation. Nach jeder Wäsche, setzen die Filter in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 2 Minuten und Platz Nässe auf der Edelstahl-Filter stehen an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, Maschen wie in Abbildung 1 A [schematisch dargestellt in der Mitte]. 
	Hinweis: Kochendes Wasser kann erzeugt werden mit dem Autoklav Sterilisator, die Asepsis zu erreichen und Ausrüstung aus Autoklav Sterilisator rechtzeitig getroffen werden, um eine Abnahme der Temperatur zu vermeiden.</li>
</ol> 2. AGM Explant Kultur <ol><li>trennen Sie vorsichtig die AGM-Regionen aus den Embryonen im E10.5 oder E11 mit der Pinzette.
	<ol><li>Streifen die Gebärmutter von schwangeren Mäusen mit der sezierenden Schere und die Embryonen aus der Gebärmutter zu trennen.</li>
		<li>Der Dottersack, der Nabelschnur und Eingeweide aus dem Körper des Embryos abwischen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die dorsale Nerv Gewebe und die umliegenden Muskelgewebe.</li>
		<li>Cut off das Gewebe mit der Zange auf dem Gelände des vorderen und hinteren Gliedmaßen und die AGM-Region aus dem Embryo Körper zu trennen. Figuren 1 B-C zeigen die schematische Darstellung und Morphologie der seziert AGM.</li>
	</ol></li> <li>Explant sezierten Hauptversammlungen separat auf die Filter im Air-Liquid-Schnittstelle ( Abb. 1 A) und 5 % CO 2 bei 37 ° C für ca. 2-3 Tage. 
	Hinweis: Nicht legen Sie seziert AGM auf den Draht von der Stahlgitter und sicherstellen Sie, dass die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit während der Kultur sind. Neben der Jahreshauptversammlung, Dottersack und fetalen Leber können auch gezüchtet werden mit diesem System 7.</li>
</ol> 3. Expressionsanalysen <ol><li>mRNA-Ebene <ol><li>sammeln die kultivierten Hauptversammlungen in 1 mL PBS und Zentrifugieren bei 4 ° C, 310 X g für 6 min.</li>
		<li>Nach dem Entfernen des Überstands, Gesamt-RNS wird extrahiert aus den gesammelten Hauptversammlungen mit einer monophasischen Lösung aus Phenol, nach Angaben des Herstellers &#39; Anweisungen s.</li>
		<li>Gesamt-RNS (2 µg) ist dann umgekehrt transkribiert, mit M-MLV Reverse Transkriptase cDNA als Vorlage zu erhalten. Die quantitative Echtzeit-PCR-Assays erfolgen mit SYBR Green und Gapdh dient als interne Kontrolle.</li>
	</ol></li> <li>Protein-Ebene <ol><li>der kultivierten AGM zu sammeln, wie oben beschrieben in Schritt 3.1.1.</li>
		<li>Bereiten das Protein von der kultivierten GV mit der Zelle Lysis Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 0,5 % NP-40) mit Protease-Inhibitor und Einsatz für das westliche Beflecken um die Protein-Ebene erkennen, wie zuvor beschrieben 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Koloniebildenden Einheiten in der Kultur (KBE-C) Assay <ol><li>nach Kultivierung für 2-3 Tage, sammeln die AGM-Regionen in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Zentrifuge bei 4 ° C, 310 X g für 6 Minuten und mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) bei 37 distanzieren ° C 
	Hinweis: Der Zeitaufwand für die Kollagenase, einzelne Zellsuspensionen zu generieren ist etwa 20 Minuten. Schütteln das Röhrchen mit AGM können alle 5 Minuten die Verdauung beschleunigen. 200 µL 0.1 % Kollagenase dient jedes AGM und 200 µL 10 % Serum wird verwendet, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Kultur einzelne Zellsuspensionen in M3434 Medium in ultra-niedrigen Anlage 24-Well Platten. 
	Hinweis: Zur Vermeidung von Kontaminationen kann Penicillin-Streptomycin-Lösung gezielt in das Medium hinzugefügt werden. Weil das M3434 Medium zähflüssig ist, eine 1,0 cc Spritze ohne Nadel wird verwendet, um die Zellen und Medium mix.</li>
	<li>Nach 7 - 10 Tagen Kultivierung bei 37 ° C in 5 % CO 2, die Zahl für jede Art von Kolonien einschließlich Burst bilden Einheit--erythroiden (BFU-E), KBE-Granulo-Monocyte (CFU-GM) und KBE-Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryocyte (KBE-GEMM) Zeichnen auf die Morphologie und erzielte mit einem inversen Mikroskop ( Abbildung 2 C).</li>
</ol> 5. In Vivo Transplantation-Assay <ol><li>Koloniebildenden Einheiten-Milz (KBE-S) Assay <ol><li>nach 2 - 3 Tage der modellabhängigen Kultivierung, sammeln die Hauptversammlungen und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.</li>
		<li>Führen Sie tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5h vor der Zelle Injektion.</li>
		<li>Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.</li>
		<li>Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.</li>
		<li>Injizieren 0,5 Embryo entspricht (Ee) oder 1 Ee einzelne Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene des bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze. 
		Hinweis: Zellen sind mit PBS suspendiert und 0,5 mL PBS pro Empfänger ist eine angemessene Lautstärke. Eine Nadel von 25 Gauge oder 26 Gauge Größe wird für die Injektion mit einer 1,0 cc Spritze verwendet. Keine Luft kann in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen.</li>
		<li>Elf Tage nach Transplantation, sammeln und reparieren die Milz der Empfänger Mäuse in Bouin &#39; s Lösung (15 mL 1,22 % Pikrinsäure gesättigte wässrige Lösung, 2 mL 40 % Methanol und 1 mL Essigsäure) für 1-2 Tage und waschen mit 80 % Alkohol für weitere 1-2 Tage. Zählen Sie Makroskopisch sichtbaren Kolonien in der Milz und bestimmen Sie die Anzahl der Kolonien pro Ee. 
		&#8203; Hinweis: Bouin &#39; s Fixiermittel, geeignete Verschleißschutz.</li>
	</ol></li> <li>Langfristige Transplantation Assay <ol><li>nach 2-3 Tagen explant Kultivierung, die Hauptversammlungen zu sammeln und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.</li>
		<li>Tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5 Std. vor der Zelle Injektion durchführen.</li>
		<li>Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.</li>
		<li>Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.</li>
		< lich > injizieren entspricht 0,5 Embryo (Ee) oder 1 Ee single Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene einer bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze. Hauptversammlung werden bei einer Dosis von 1 Ee pro Empfänger mit 2 × 10 5 Knochenmarkzellen (CD45.1 Hintergrund) injiziert. 
		Hinweis: Es kann keine Luft in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen.</li>
		<li>Vier Monate nach Transplantation, das Knochenmark des Empfängers zu sammeln und verwenden Sie es für die Rekonstitution Assay durch FACS. Nur die Empfänger mit &#8805; 10 % Spender abgeleitet Chimerism gelten als erfolgreiche Rekonstitution aufweisen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen widerstreitenden Interessen.

Es ist bekannt, dass Reife HSCs im Knochenmark können das Blutsystem der bestrahlten Empfänger neu zu besiedeln. Im Gegensatz zu diesen funktionalen HSCs sind die aufstrebenden HSCs an der Hauptversammlung von Mäuseembryonen unreif. Direkte Transplantation Ergebnisse zeigten, dass Typ ich (VE-CAD-+ CD45– CD41+) und Typ II (VE-CAD-+ CD45+) Pre-HSCs besitzen keine Rekonstitution Fähigkeit20. Unter Ausnutzung der AGM Explant Kultursystem, das im ...

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind gewebespezifischen adulten Stammzellen, der besitzen multilineage Potenzial einschließlich erythroiden, myeloische, und lymphatischen Zellen, sowie die Fähigkeit, selbst zu erneuern. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die frühesten HSCs aus einer spezialisierten Endothelzellen Bevölkerung entstand, bekannt als Hemogenic Endothel (HE), durch die endotheliale hämatopoetischen Übergang (EHT) an der ventralen Wand des dorsalen Aorta1,2 ,3,4. Sobald die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region von embryonalen (E) 10,5 bis E12.5 in der Maus-Embryo gebildet, HSCs Wandern in der fetalen Leber für die Erweiterung und schließlich besiedeln das Knochenmark zu adulten Hämatopoese im gesamten Leben eines Individuums zu pflegen 5 , 6. obwohl dies seit vielen Jahren erforscht wird, die zugrunde liegenden Mechanismen der HSC-Entstehung und Entwicklung bleiben unvollständig verstanden.
Im Gegensatz zu in-vitro- Befruchtung und Entwicklung des Zebrafisch-Embryonen macht intrauterinen Entwicklung von Mäuseembryonen das Studium der definitiven Hämatopoese in der Embryogenese viel unbequemer. Obwohl genetische Experimente mit Knockout (KO)-Mäusen allgemein verwendet sind, schränkt das Fehlen von bestimmten KO-Mäusen auch ihre Verwendung im Bereich hämatopoetischen Forschung. Darüber hinaus werden in Vivo Rettung Versuche nicht leicht in KO-Mäusen durchgeführt. Seit 1996 wurde die AGM Explant Kultur für hämatopoetische Studien von den Pionieren im Bereich7entwickelt. Mit Hilfe dieses Kultur-Systems identifizierten ventralen Gewebe der AGM-Region HSC Aktivität zu fördern, während dorsalen Gewebe eine entgegengesetzte Wirkung8,9ausüben. Die AGM Explant Kultursystem wurde auch angewendet, um festzustellen, die Rolle von Serotonin, Mpl, SCF, BMP und Igel Signalisierung in HSC Entwicklung10,11,12,13, 14. wichtiger ist, es ist auch eine beliebte Methode, hämatopoetischen Mängel in der mutierten Embryonen13,15zu retten.

<table><tbody><tr><td>Durapore 0,65 &Mikro; m Filter</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM Explantatkultur</td></tr><tr><td>M5300 Langzeitkulturmedium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM Explantatkultur</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA-Extration</td></tr><tr><td>M-MLV reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>reverse Transkription</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>quantitativer real-time PCR</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Protein-Extraktionskollagenase</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Verdau von AGM-Geweben</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 mittel</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-C Assay</td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit extrem geringer Bindung</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C Assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 Mäuse</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S Assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 Mäuse</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Langzeittransplantation</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM-Kollektion</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM-Explantatkultur</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Langzeittransplantation</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Langzeittransplantation</td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>Leistung: 30W</td></tr><tr><td>Edelstahlgewebe</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>Durchmesser der Öffnung: 2,5 mm</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>selektiv verdünnt in M5300 Medium</td></tr></tbody></table>

anwendung der aorta-gonade-wachstum explant kultursystem in developmental hämatopoese

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Die Einschränkung bei der Verwendung von Mäuseembryonen für Blutbildung Studien ist die zusätzliche Unannehmlichkeiten bei Operationen, weitgehend aufgrund der intrauterinen Entwicklung des Embryos. Obwohl genetische Daten von Knockout (KO)-Mäusen überzeugend sind, ist es nicht realistisch, KO Mäuse für alle Gene zu erzeugen, wie gebraucht. Darüber hinaus durchführen in Vivo Rettung Experimente zur Konsolidierung der Daten erhalten von KO-Mäusen ist nicht bequem. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte sich die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Explant Kultur als ein geeignetes System, hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Entwicklung zu studieren. Vor allem für Rettung Experimente es lässt sich die beeinträchtigte Blutbildung in KO-Mäusen zu erholen. Durch das Hinzufügen der entsprechenden Chemikalien in das Medium, die beeinträchtigt Signalisierung kann reaktiviert werden oder Up-regulierten Bahnen gehemmt werden können. Mit dem Einsatz dieser Methode viele Experimente können durchgeführt werden, um die kritischen Regulatoren der HSC Entwicklung identifizieren, einschließlich HSC im Zusammenhang mit gen-Expression auf mRNA und Protein Ebenen, Kolonie Bildung Fähigkeit und Rekonstitution Kapazität. Diese Serie von Experimenten wäre hilfreich bei der Festlegung der zugrunde liegenden Mechanismen für HSC-Entwicklung bei Säugetieren.

Eine kürzlich erschienenen Publikation berichtet, endothelial Zelle abgeleitet Serotonin das Überleben der HSCs fördert durch die Hemmung des Pro-apoptotische Weges in der AGM-13. Um die Förderung Wirkung von Serotonin auf HSC Entwicklung bestätigen, war Fluoxetin enthalten. Als eine selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) nachweislich die Fluoxetin hemmen Serotonin-Re-Absorption in peripheren Geweben16,1...

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, mit Hilfe einer Aorta-Gonaden-Mesonephros-Explantatkultur die kritischen Regulatoren der hämatopoetischen Stammzellentwicklung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der HSC-Biologie und in den Funktionsfeldern zu beantworten, wie die Faktoren identifiziert werden können, die an der Regulation der HSC-Entwicklung bei Säugetieren beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass diese Regulatoren durch DNA-Expressionsanalysen sowie die Fähigkeit zur Koloniebildung und die Rekonstitutionsfähigkeit des HSC überprüft werden können.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die genaue Trennung von AGM von den umgebenden Geweben in der Rumpfregion Übung erfordert, um sie zu beherrschen. Vor Beginn des Verfahrens werden Edelstahlnetze in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte gelegt, die zwei Milliliter frisch zubereitetes, mit Fluoxetin angereichertes Medium pro Vertiefung enthält. Legen Sie einen UV-sterilisierten 0,65-Mikroliter-Filter pro Versuchsvertiefung für zwei dreiminütige Wäschen in eine Glaszellkulturschale mi

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

mStrawberry OP9 Zellen ermöglichen vollständige Bewertung aller ES-derived Nachkommen von Co-Kultur.

Geändert ES / OP9 Co-Kultur-Protokoll bietet eine verbesserte Charakterisierung von hämatopoetischen Progeny

Ein 3D-Kultur für Hämatopoese wird unter Verwendung von humanem Nabelschnurblut und leukämischen Knochenmarkszellen. Verfahren basiert auf der Verwendung eines porösen, synthetischen Polyurethan Gerüst mit Proteinen der extrazellulären Matrix beschichtet ist. Dieses Gerüst ist anpassbar an eine Vielzahl von Zellen aufnehmen.

Ex-vivo-Mimikry von normalen und anormalen menschlichen Hämatopoese

Dieses Protokoll beschreibt das Sezieren von embryonalen Schilddrüsenanlagen der Maus und die Kultur von Explantaten auf halbporösen Filtern oder auf Mikroskopie-Kunststoffobjektträgern. Dieses System ist ideal für die Untersuchung morphogenetischer oder Differenzierungsereignisse, die während der Schilddrüsenentwicklung von Wildtyp- oder Knockout-Embryonen auftreten, und eignet sich für Funktionsgewinn- und -verlustexperimente.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Dieser Artikel enthält einen aktualisierten Ansatz zum klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre System Orgel Formation, zu studieren, durch die Kombination von neuartige in-vitro- und in Ovo experimentellen Verfahren.

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

Diese Arbeit beschreibt zwei Methoden zur Untersuchung der Organentwicklung, eine verbesserte Xenotransplantation auf chorioallantoischer Membran (CAM) aus Aviären Embryonen, die eine Vaskularisation kultivierter embryonaler Organe und Organoide ermöglicht, und eine neuartige feste Z-Richtung. Organkulturmethode mit modifizierten experimentellen Bedingungen, die eine hochauflösende Zeitraffer-Konfokalbildgebung ermöglicht.

Optimierung der Renalorganoid- und Organotypischen Kultur für Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und verbesserte Mikroskopie-Bildgebung

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

In dieser Arbeit etablierten wir in vivo Osteo-Organoide, die durch knochenmorphogenetische Protein-2-beladene Gelatinegerüste ausgelöst wurden, um therapeutische hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen für die Rekonstruktion eines geschädigten hämatopoetischen und Immunsystems zu gewinnen. Insgesamt kann dieser Ansatz eine vielversprechende Zellquelle für Zelltherapien darstellen.

In-vivo-Osteo-Organoid-Ansatz zur Gewinnung therapeutischer hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen

Lernen Sie das AGM-Explantatkulturverfahren zur Untersuchung der hämatopoetischen Stammzellentwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse regulatorischer Faktoren durch Expressionsanalysen und Koloniebildungsassays.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

Weitere Videos entdecken