Name: Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie das AGM-Explantatkulturverfahren zur Untersuchung der hämatopoetischen Stammzellentwicklung. Diese Methode ermöglicht die Analyse regulatorischer Faktoren durch Expressionsanalysen und Koloniebildungsassays.

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Wir danken Suwei Gao für Hilfe bei der Vorbereitung der Figur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (81530004, 31425016) und das Ministerium für Wissenschaft und Technology of China (2016YFA0100500). J.l. die Experimente durchgeführt und das Manuskript verfasst; F.l. bearbeitet das Manuskript. Beide Autoren gelesen und genehmigt das endgültige Manuskript.

alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen von der ethischen Review Committee im Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China genehmigt worden.
 1. Material Vorbereitung <ol><li>Sterilisation der 0,65 µm Filter mit UV Strahlen produziert unter dem ultravioletten Strahl der Lampe auf die sauberen Werkbank für 4 h und die Filter nach 2 h-Kennzeichen umdrehen. 
	Hinweis: Wenn Sie mit UV-Licht arbeiten, entsprechende Verschleißschutz.</li>
	<li>Edelstahl-Netze mit dem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C für 30 Minuten sterilisieren. 
	Hinweis: Eine bestimmte Höhe Edelstahlgeflecht ist notwendig, um die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit zu unterstützen und dadurch realisiert werden, mit dem Draht auf das Stahlgitter ( Abb. 1 A).</li>
	<li>Verdünnen Fluoxetin, eine Endkonzentration von 10 µM in langfristige M5300 Kultur Medium und Mischung gleichmäßig. 
	Hinweis: Für eine sechs-Well-Platte ist 2 mL M5300 langfristige Kulturmedium für jedes gut geeignet. Hydrocortison bei 10 -6 M kann selektiv in das Medium verdünnt werden.</li>
	<li>Das Medium ergänzt mit Fluoxetin bei 10 µM in sechs-Well Platten oder Gerichte zu übertragen und setzen die sterilisierten Edelstahl-Gitter in das Medium.</li>
	<li>Waschen die 0,65 µm-Filter mit kochendem Wasser zwei Mal für 3 Minuten jedes Mal in der Kulturschale Glas Zelle für die Sterilisation. Nach jeder Wäsche, setzen die Filter in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 2 Minuten und Platz Nässe auf der Edelstahl-Filter stehen an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, Maschen wie in Abbildung 1 A [schematisch dargestellt in der Mitte]. 
	Hinweis: Kochendes Wasser kann erzeugt werden mit dem Autoklav Sterilisator, die Asepsis zu erreichen und Ausrüstung aus Autoklav Sterilisator rechtzeitig getroffen werden, um eine Abnahme der Temperatur zu vermeiden.</li>
</ol> 2. AGM Explant Kultur <ol><li>trennen Sie vorsichtig die AGM-Regionen aus den Embryonen im E10.5 oder E11 mit der Pinzette.
	<ol><li>Streifen die Gebärmutter von schwangeren Mäusen mit der sezierenden Schere und die Embryonen aus der Gebärmutter zu trennen.</li>
		<li>Der Dottersack, der Nabelschnur und Eingeweide aus dem Körper des Embryos abwischen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die dorsale Nerv Gewebe und die umliegenden Muskelgewebe.</li>
		<li>Cut off das Gewebe mit der Zange auf dem Gelände des vorderen und hinteren Gliedmaßen und die AGM-Region aus dem Embryo Körper zu trennen. Figuren 1 B-C zeigen die schematische Darstellung und Morphologie der seziert AGM.</li>
	</ol></li> <li>Explant sezierten Hauptversammlungen separat auf die Filter im Air-Liquid-Schnittstelle ( Abb. 1 A) und 5 % CO 2 bei 37 ° C für ca. 2-3 Tage. 
	Hinweis: Nicht legen Sie seziert AGM auf den Draht von der Stahlgitter und sicherstellen Sie, dass die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit während der Kultur sind. Neben der Jahreshauptversammlung, Dottersack und fetalen Leber können auch gezüchtet werden mit diesem System 7.</li>
</ol> 3. Expressionsanalysen <ol><li>mRNA-Ebene <ol><li>sammeln die kultivierten Hauptversammlungen in 1 mL PBS und Zentrifugieren bei 4 ° C, 310 X g für 6 min.</li>
		<li>Nach dem Entfernen des Überstands, Gesamt-RNS wird extrahiert aus den gesammelten Hauptversammlungen mit einer monophasischen Lösung aus Phenol, nach Angaben des Herstellers &#39; Anweisungen s.</li>
		<li>Gesamt-RNS (2 µg) ist dann umgekehrt transkribiert, mit M-MLV Reverse Transkriptase cDNA als Vorlage zu erhalten. Die quantitative Echtzeit-PCR-Assays erfolgen mit SYBR Green und Gapdh dient als interne Kontrolle.</li>
	</ol></li> <li>Protein-Ebene <ol><li>der kultivierten AGM zu sammeln, wie oben beschrieben in Schritt 3.1.1.</li>
		<li>Bereiten das Protein von der kultivierten GV mit der Zelle Lysis Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 0,5 % NP-40) mit Protease-Inhibitor und Einsatz für das westliche Beflecken um die Protein-Ebene erkennen, wie zuvor beschrieben 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. Koloniebildenden Einheiten in der Kultur (KBE-C) Assay <ol><li>nach Kultivierung für 2-3 Tage, sammeln die AGM-Regionen in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Zentrifuge bei 4 ° C, 310 X g für 6 Minuten und mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) bei 37 distanzieren ° C 
	Hinweis: Der Zeitaufwand für die Kollagenase, einzelne Zellsuspensionen zu generieren ist etwa 20 Minuten. Schütteln das Röhrchen mit AGM können alle 5 Minuten die Verdauung beschleunigen. 200 µL 0.1 % Kollagenase dient jedes AGM und 200 µL 10 % Serum wird verwendet, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Kultur einzelne Zellsuspensionen in M3434 Medium in ultra-niedrigen Anlage 24-Well Platten. 
	Hinweis: Zur Vermeidung von Kontaminationen kann Penicillin-Streptomycin-Lösung gezielt in das Medium hinzugefügt werden. Weil das M3434 Medium zähflüssig ist, eine 1,0 cc Spritze ohne Nadel wird verwendet, um die Zellen und Medium mix.</li>
	<li>Nach 7 - 10 Tagen Kultivierung bei 37 ° C in 5 % CO 2, die Zahl für jede Art von Kolonien einschließlich Burst bilden Einheit--erythroiden (BFU-E), KBE-Granulo-Monocyte (CFU-GM) und KBE-Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryocyte (KBE-GEMM) Zeichnen auf die Morphologie und erzielte mit einem inversen Mikroskop ( Abbildung 2 C).</li>
</ol> 5. In Vivo Transplantation-Assay <ol><li>Koloniebildenden Einheiten-Milz (KBE-S) Assay <ol><li>nach 2 - 3 Tage der modellabhängigen Kultivierung, sammeln die Hauptversammlungen und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.</li>
		<li>Führen Sie tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5h vor der Zelle Injektion.</li>
		<li>Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.</li>
		<li>Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.</li>
		<li>Injizieren 0,5 Embryo entspricht (Ee) oder 1 Ee einzelne Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene des bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze. 
		Hinweis: Zellen sind mit PBS suspendiert und 0,5 mL PBS pro Empfänger ist eine angemessene Lautstärke. Eine Nadel von 25 Gauge oder 26 Gauge Größe wird für die Injektion mit einer 1,0 cc Spritze verwendet. Keine Luft kann in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen.</li>
		<li>Elf Tage nach Transplantation, sammeln und reparieren die Milz der Empfänger Mäuse in Bouin &#39; s Lösung (15 mL 1,22 % Pikrinsäure gesättigte wässrige Lösung, 2 mL 40 % Methanol und 1 mL Essigsäure) für 1-2 Tage und waschen mit 80 % Alkohol für weitere 1-2 Tage. Zählen Sie Makroskopisch sichtbaren Kolonien in der Milz und bestimmen Sie die Anzahl der Kolonien pro Ee. 
		&#8203; Hinweis: Bouin &#39; s Fixiermittel, geeignete Verschleißschutz.</li>
	</ol></li> <li>Langfristige Transplantation Assay <ol><li>nach 2-3 Tagen explant Kultivierung, die Hauptversammlungen zu sammeln und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.</li>
		<li>Tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5 Std. vor der Zelle Injektion durchführen.</li>
		<li>Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.</li>
		<li>Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.</li>
		< lich > injizieren entspricht 0,5 Embryo (Ee) oder 1 Ee single Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene einer bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze. Hauptversammlung werden bei einer Dosis von 1 Ee pro Empfänger mit 2 × 10 5 Knochenmarkzellen (CD45.1 Hintergrund) injiziert. 
		Hinweis: Es kann keine Luft in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen.</li>
		<li>Vier Monate nach Transplantation, das Knochenmark des Empfängers zu sammeln und verwenden Sie es für die Rekonstitution Assay durch FACS. Nur die Empfänger mit &#8805; 10 % Spender abgeleitet Chimerism gelten als erfolgreiche Rekonstitution aufweisen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
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<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
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<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen widerstreitenden Interessen.

Es ist bekannt, dass Reife HSCs im Knochenmark können das Blutsystem der bestrahlten Empfänger neu zu besiedeln. Im Gegensatz zu diesen funktionalen HSCs sind die aufstrebenden HSCs an der Hauptversammlung von Mäuseembryonen unreif. Direkte Transplantation Ergebnisse zeigten, dass Typ ich (VE-CAD-+ CD45– CD41+) und Typ II (VE-CAD-+ CD45+) Pre-HSCs besitzen keine Rekonstitution Fähigkeit20. Unter Ausnutzung der AGM Explant Kultursystem, das im ...

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind gewebespezifischen adulten Stammzellen, der besitzen multilineage Potenzial einschließlich erythroiden, myeloische, und lymphatischen Zellen, sowie die Fähigkeit, selbst zu erneuern. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die frühesten HSCs aus einer spezialisierten Endothelzellen Bevölkerung entstand, bekannt als Hemogenic Endothel (HE), durch die endotheliale hämatopoetischen Übergang (EHT) an der ventralen Wand des dorsalen Aorta1,2 ,3,4. Sobald die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region von embryonalen (E) 10,5 bis E12.5 in der Maus-Embryo gebildet, HSCs Wandern in der fetalen Leber für die Erweiterung und schließlich besiedeln das Knochenmark zu adulten Hämatopoese im gesamten Leben eines Individuums zu pflegen 5 , 6. obwohl dies seit vielen Jahren erforscht wird, die zugrunde liegenden Mechanismen der HSC-Entstehung und Entwicklung bleiben unvollständig verstanden.
Im Gegensatz zu in-vitro- Befruchtung und Entwicklung des Zebrafisch-Embryonen macht intrauterinen Entwicklung von Mäuseembryonen das Studium der definitiven Hämatopoese in der Embryogenese viel unbequemer. Obwohl genetische Experimente mit Knockout (KO)-Mäusen allgemein verwendet sind, schränkt das Fehlen von bestimmten KO-Mäusen auch ihre Verwendung im Bereich hämatopoetischen Forschung. Darüber hinaus werden in Vivo Rettung Versuche nicht leicht in KO-Mäusen durchgeführt. Seit 1996 wurde die AGM Explant Kultur für hämatopoetische Studien von den Pionieren im Bereich7entwickelt. Mit Hilfe dieses Kultur-Systems identifizierten ventralen Gewebe der AGM-Region HSC Aktivität zu fördern, während dorsalen Gewebe eine entgegengesetzte Wirkung8,9ausüben. Die AGM Explant Kultursystem wurde auch angewendet, um festzustellen, die Rolle von Serotonin, Mpl, SCF, BMP und Igel Signalisierung in HSC Entwicklung10,11,12,13, 14. wichtiger ist, es ist auch eine beliebte Methode, hämatopoetischen Mängel in der mutierten Embryonen13,15zu retten.

<table><tbody><tr><td>Durapore 0,65 &Mikro; m Filter</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM Explantatkultur</td></tr><tr><td>M5300 Langzeitkulturmedium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5300</td><td>AGM Explantatkultur</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA-Extration</td></tr><tr><td>M-MLV reverse Transkriptase</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>reverse Transkription</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>quantitativer real-time PCR</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>Protein-Extraktionskollagenase</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Verdau von AGM-Geweben</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 mittel</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>CFU-C Assay</td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit extrem geringer Bindung</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C Assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 Mäuse</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S Assay</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 Mäuse</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Langzeittransplantation</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM-Kollektion</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM-Explantatkultur</td></tr><tr><td>anti-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Langzeittransplantation</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>Langzeittransplantation</td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>Leistung: 30W</td></tr><tr><td>Edelstahlgewebe</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>Durchmesser der Öffnung: 2,5 mm</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>selektiv verdünnt in M5300 Medium</td></tr></tbody></table>

anwendung der aorta-gonade-wachstum explant kultursystem in developmental hämatopoese

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Die Einschränkung bei der Verwendung von Mäuseembryonen für Blutbildung Studien ist die zusätzliche Unannehmlichkeiten bei Operationen, weitgehend aufgrund der intrauterinen Entwicklung des Embryos. Obwohl genetische Daten von Knockout (KO)-Mäusen überzeugend sind, ist es nicht realistisch, KO Mäuse für alle Gene zu erzeugen, wie gebraucht. Darüber hinaus durchführen in Vivo Rettung Experimente zur Konsolidierung der Daten erhalten von KO-Mäusen ist nicht bequem. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte sich die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Explant Kultur als ein geeignetes System, hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Entwicklung zu studieren. Vor allem für Rettung Experimente es lässt sich die beeinträchtigte Blutbildung in KO-Mäusen zu erholen. Durch das Hinzufügen der entsprechenden Chemikalien in das Medium, die beeinträchtigt Signalisierung kann reaktiviert werden oder Up-regulierten Bahnen gehemmt werden können. Mit dem Einsatz dieser Methode viele Experimente können durchgeführt werden, um die kritischen Regulatoren der HSC Entwicklung identifizieren, einschließlich HSC im Zusammenhang mit gen-Expression auf mRNA und Protein Ebenen, Kolonie Bildung Fähigkeit und Rekonstitution Kapazität. Diese Serie von Experimenten wäre hilfreich bei der Festlegung der zugrunde liegenden Mechanismen für HSC-Entwicklung bei Säugetieren.

Eine kürzlich erschienenen Publikation berichtet, endothelial Zelle abgeleitet Serotonin das Überleben der HSCs fördert durch die Hemmung des Pro-apoptotische Weges in der AGM-13. Um die Förderung Wirkung von Serotonin auf HSC Entwicklung bestätigen, war Fluoxetin enthalten. Als eine selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) nachweislich die Fluoxetin hemmen Serotonin-Re-Absorption in peripheren Geweben16,1...

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, mit Hilfe einer Aorta-Gonaden-Mesonephros-Explantatkultur die kritischen Regulatoren der hämatopoetischen Stammzellentwicklung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der HSC-Biologie und in den Funktionsfeldern zu beantworten, wie die Faktoren identifiziert werden können, die an der Regulation der HSC-Entwicklung bei Säugetieren beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass diese Regulatoren durch DNA-Expressionsanalysen sowie die Fähigkeit zur Koloniebildung und die Rekonstitutionsfähigkeit des HSC überprüft werden können.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die genaue Trennung von AGM von den umgebenden Geweben in der Rumpfregion Übung erfordert, um sie zu beherrschen. Vor Beginn des Verfahrens werden Edelstahlnetze in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte gelegt, die zwei Milliliter frisch zubereitetes, mit Fluoxetin angereichertes Medium pro Vertiefung enthält. Legen Sie einen UV-sterilisierten 0,65-Mikroliter-Filter pro Versuchsvertiefung für zwei dreiminütige Wäschen in eine Glaszellkulturschale mit frischem kochendem Wasser und tauchen Sie die Filter nach jedem Waschen zwei Minuten lang in einen Behälter mit PBS bei Raumtemperatur.Platzieren Sie dann einen Filter auf jedem Stahlgewebe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche jeder Vertiefung. Verwenden Sie als Nächstes die Präparierschere, um die Gebärmutter einer embryonalen Maus am Tag 11 zu entfernen und die Embryonen aus der Gebärmutter zu entnehmen. Entfernen Sie mit einer Präparierschere den Dottersack, die Nabelschnur und die Eingeweide aus dem Embryokörper.Und entfernen Sie vorsichtig das dorsale Nervengewebe und das umgebende Muskelgewebe. Mit einer Pinzette wird das Gewebe der vorderen und hinteren Gliedmaßen entfernt. Und trennen Sie die AGM-Region vom Embryokörper.Platzieren Sie dann jedes AGM auf einem einzelnen Filter an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche jeder Vertiefung. Legen Sie die Kulturen in einen 37 Grad Celsius und 5% CO2 Inkubator. Nach zwei bis drei Tagen werden die AGM-Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern Kollagenase überführt, um sie bei 37 Grad Celsius für etwa 20 Minuten zu dissoziieren, wobei alle fünf Minuten geschüttelt wird.Am Ende der Verdauung stoppen Sie die Reaktionen mit 200 Mikroliltern Serum pro Explantat. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz, die 500 bis 600 Mikroliter M3434-Medium pro Vertiefung enthält. Mischen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einer Ein-Milliliter-Spritze ohne Nadel.Stellen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in jeder Vertiefung kann dann nach sieben bis 10 Tagen Kultivierung bewertet werden. Für die In-vivo-AGM-Explantattransplantation nach zwei bis drei Tagen AGM-Kultur, wie gerade gezeigt, werden acht bis 10 Wochen alte männliche C57-schwarze sechs Mäuse mit neun grauen Strahlen letal bestrahlt.Vier bis fünf Stunden später dissoziieren Sie die geernteten Explantate in 200 Mikroliter Kollagenase pro Probe, wie gezeigt. Beladung von 0,5 bis einem Embryoäquivalent der resultierenden einzelligen Suspensionen in eine Ein-Milliliter-Spritze pro Empfängertier. Legen Sie die erste bestrahlte Maus in einen Fixierer und wischen Sie den Schwanz mit einem 75%ige Ethanol-getränkten Wattestäbchen ab, um die Vasodilatation der Schwanzvene zu fördern.Injizieren Sie intravenös den gesamten Inhalt einer Spritze in eine erweiterte Schwanzvene. Verwenden Sie einen antiseptischen Tupfer, um die Blutung nach dem Entfernen der Nadel zu stoppen. Bringen Sie dann das Tier in seinen Käfig zurück und injizieren Sie das nächste Tier.11 Tage nach dem adoptiven Transfer kann die Milz in der Bouin-Lösung zur makroskopischen Zählung der sichtbaren Milzkolonien fixiert werden. Mit Fluoxetin supplementierte AGM-Kulturen zeigen eine erhöhte Expression von Runx1, einem zentralen Gen für die HSC-Entwicklung auf mRNA- und Proteinexpressionsebene. Fluoxetin kann auch die Koloniebildungsfähigkeit von HSC in der AGM signifikant erhöhen, einschließlich Erythroiden mit burstbildenden Einheiten, granulären Monozyten mit koloniebildender Einheit und Granulozyten mit koloniebildender Einheit, Erythrozyten, Makrophagen und Megakaryozyten.Darüber hinaus führt die in vivo-Transplantation von mit Fluoxetin behandelten HSC, die aus AGM-Explantaten isoliert wurden, zu einer erhöhten Anzahl von Kolonien in der Milz bestrahlter adulter Empfängertiere. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die AGM isolieren und eine AGM-Explantatkultur durchführen können, um die kritischen Regulatoren der HSC-Entwicklung innerhalb der AGM zu identifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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