Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese
3. November 2017
Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, mit Hilfe einer Aorta-Gonaden-Mesonephros-Explantatkultur die kritischen Regulatoren der hämatopoetischen Stammzellentwicklung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der HSC-Biologie und in den Funktionsfeldern zu beantworten, wie die Faktoren identifiziert werden können, die an der Regulation der HSC-Entwicklung bei Säugetieren beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass diese Regulatoren durch DNA-Expressionsanalysen sowie die Fähigkeit zur Koloniebildung und die Rekonstitutionsfähigkeit des HSC überprüft werden können.
Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die genaue Trennung von AGM von den umgebenden Geweben in der Rumpfregion Übung erfordert, um sie zu beherrschen. Vor Beginn des Verfahrens werden Edelstahlnetze in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte gelegt, die zwei Milliliter frisch zubereitetes, mit Fluoxetin angereichertes Medium pro Vertiefung enthält. Legen Sie einen UV-sterilisierten 0,65-Mikroliter-Filter pro Versuchsvertiefung für zwei dreiminütige Wäschen in eine Glaszellkulturschale mit frischem kochendem Wasser und tauchen Sie die Filter nach jedem Waschen zwei Minuten lang in einen Behälter mit PBS bei Raumtemperatur.
Platzieren Sie dann einen Filter auf jedem Stahlgewebe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche jeder Vertiefung. Verwenden Sie als Nächstes die Präparierschere, um die Gebärmutter einer embryonalen Maus am Tag 11 zu entfernen und die Embryonen aus der Gebärmutter zu entnehmen. Entfernen Sie mit einer Präparierschere den Dottersack, die Nabelschnur und die Eingeweide aus dem Embryokörper.
Und entfernen Sie vorsichtig das dorsale Nervengewebe und das umgebende Muskelgewebe. Mit einer Pinzette wird das Gewebe der vorderen und hinteren Gliedmaßen entfernt. Und trennen Sie die AGM-Region vom Embryokörper.
Platzieren Sie dann jedes AGM auf einem einzelnen Filter an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche jeder Vertiefung. Legen Sie die Kulturen in einen 37 Grad Celsius und 5% CO2 Inkubator. Nach zwei bis drei Tagen werden die AGM-Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 Mikrolitern Kollagenase überführt, um sie bei 37 Grad Celsius für etwa 20 Minuten zu dissoziieren, wobei alle fünf Minuten geschüttelt wird.
Am Ende der Verdauung stoppen Sie die Reaktionen mit 200 Mikroliltern Serum pro Explantat. Übertragen Sie den gesamten Inhalt jedes Röhrchens in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz, die 500 bis 600 Mikroliter M3434-Medium pro Vertiefung enthält. Mischen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einer Ein-Milliliter-Spritze ohne Nadel.
Stellen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in jeder Vertiefung kann dann nach sieben bis 10 Tagen Kultivierung bewertet werden. Für die In-vivo-AGM-Explantattransplantation nach zwei bis drei Tagen AGM-Kultur, wie gerade gezeigt, werden acht bis 10 Wochen alte männliche C57-schwarze sechs Mäuse mit neun grauen Strahlen letal bestrahlt.
Vier bis fünf Stunden später dissoziieren Sie die geernteten Explantate in 200 Mikroliter Kollagenase pro Probe, wie gezeigt. Beladung von 0,5 bis einem Embryoäquivalent der resultierenden einzelligen Suspensionen in eine Ein-Milliliter-Spritze pro Empfängertier. Legen Sie die erste bestrahlte Maus in einen Fixierer und wischen Sie den Schwanz mit einem 75%ige Ethanol-getränkten Wattestäbchen ab, um die Vasodilatation der Schwanzvene zu fördern.
Injizieren Sie intravenös den gesamten Inhalt einer Spritze in eine erweiterte Schwanzvene. Verwenden Sie einen antiseptischen Tupfer, um die Blutung nach dem Entfernen der Nadel zu stoppen. Bringen Sie dann das Tier in seinen Käfig zurück und injizieren Sie das nächste Tier.
11 Tage nach dem adoptiven Transfer kann die Milz in der Bouin-Lösung zur makroskopischen Zählung der sichtbaren Milzkolonien fixiert werden. Mit Fluoxetin supplementierte AGM-Kulturen zeigen eine erhöhte Expression von Runx1, einem zentralen Gen für die HSC-Entwicklung auf mRNA- und Proteinexpressionsebene. Fluoxetin kann auch die Koloniebildungsfähigkeit von HSC in der AGM signifikant erhöhen, einschließlich Erythroiden mit burstbildenden Einheiten, granulären Monozyten mit koloniebildender Einheit und Granulozyten mit koloniebildender Einheit, Erythrozyten, Makrophagen und Megakaryozyten.
Darüber hinaus führt die in vivo-Transplantation von mit Fluoxetin behandelten HSC, die aus AGM-Explantaten isoliert wurden, zu einer erhöhten Anzahl von Kolonien in der Milz bestrahlter adulter Empfängertiere. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die AGM isolieren und eine AGM-Explantatkultur durchführen können, um die kritischen Regulatoren der HSC-Entwicklung innerhalb der AGM zu identifizieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung kultivierter Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM)-Gewebe für Expressionsanalysen und koloniebildende Einheiten, um die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen (HSC) zu untersuchen. Es handelt sich um ein effektives System zur Erforschung der regulatorischen Faktoren und Signalwege, die an der HSC-Biologie beteiligt sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Hämatopoetische Stammzellbiologie
- Zellkultivierungstechniken
- Regulatorische Faktoren in der Entwicklung
Hintergrund
- Die AGM-Region ist entscheidend für die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen (HSC) bei Säugetieren.
- Das Verständnis der Regulation hämatopoetischer Stammzellen kann zu Fortschritten in der regenerativen Medizin führen.
- Koloniebildende Assays sind unerlässlich, um die Funktionalität hämatopoetischer Stammzellen zu bewerten.
- Die Trennung der AGM von umgebenden Geweben erfordert Geschick und Übung.
Zweck der Studie
- Untersuchung der entscheidenden Regulatoren der HSC-Entwicklung.
- Identifizierung von Faktoren, die an der HSC-Regulation beteiligt sind.
- Verbesserung des Verständnisses der HSC-Biologie und -Funktion.
Verwendete Methoden
- Kultivierungstechniken für AGM-Auswüchse.
- DNA-Expressionsanalyse zur Überprüfung regulatorischer Faktoren.
- Koloniebildungsassays zur Beurteilung der HSC-Fähigkeit.
- Langzeit-Rekonstitutionsstudien.
Hauptergebnisse
- Identifizierung wichtiger regulatorischer Faktoren, die die Entwicklung von HSC beeinflussen.
- Überprüfung der Faktoren durch DNA-Expressionsanalyse.
- Erfolgreicher Nachweis der koloniebildenden Fähigkeit kultivierter HSC.
- Erkenntnisse über die an der HSC-Biologie beteiligten Signalwege.
Schlussfolgerungen
- Das AGM-Kultursystem eignet sich zur Untersuchung der HSC-Entwicklung.
- Das Verständnis regulatorischer Faktoren kann therapeutische Strategien unterstützen.
- Diese Methode bietet eine Plattform für zukünftige Forschung in der Hämatopoese.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das AGM-Explantenkultursystem behebt einen zentralen Engpass in der Forschung zu hämatopoetischen Stammzellen (HSC), indem es mechanistische Untersuchungen ermöglicht, ohne auf Keimbahn-Knockout-Modelle angewiesen zu sein. Dieser Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die Risikominimierung in der frühen Entdeckungsphase, da pharmakologische oder genetische Rescue-Experimente in einer physiologisch relevanten embryonalen Nische durchgeführt werden können. Er erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung entscheidender Regulatoren der HSC-Entwicklung und liefert damit Entscheidungsgrundlagen für die Ausrichtung von Forschungsprogrammen in therapeutischen Bereichen, die auf die Hämatopoese fokussiert sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Beteiligung von Faktoren an der Regulation hämatopoetischer Stammzellen (HSC) mittels Rescue-Experimenten in Knockout-Hintergründen getestet wird.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur Bestätigung von DNA-Expressionsänderungen und funktionellen Ergebnissen wie der Koloniebildung und verringert damit die Abhängigkeit von kostspieligen In-vivo-Modellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem molekulare Störungen mit funktionellen HSC-Ergebnissen wie der Rekonstitutionskapazität verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, multizelluläre Messgrößen, einschließlich CFU-E-, CFU-GM- und Megakaryozytenkolonien, um die Wirkung von Substanzen auf die Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSC) zu bewerten.
- Operationaler Wert: Standardisiert die funktionelle Beurteilung hämatopoetischer Stammzellen mittels Auszählung koloniebildender Einheiten nach 7–10 Tagen und ermöglicht die Hochdurchsatzfähigkeit des Assays über verschiedene Substanzbibliotheken hinweg.
- Translationeller Wert: Bereitet validierte HSC-Populationen für nachgeschaltete Transplantationsstudien vor und schließt so die Lücke zwischen Entdeckung und präklinischer Validierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem die embryonale hämatopoetische Nische bewahrt wird, was die Untersuchung der Mechanismen der mammalianischen HSC-Entwicklung ermöglicht.
- Operativer Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung, indem transplantierbare HSC mit nachgewiesener Rekonstitutionskapazität in bestrahlten Empfängern erzeugt werden.
- Risikominderung: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen vor kostspieligen In-vivo-Studien und verbessert die Sicherheit von Go/No-Go-Entscheidungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die AGM-Explantenkultur fügt sich in die Entdeckungskette von der Zielidentifizierung über die Lead-Optimierung bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für Programme zur Hämatopoese und regenerativen Medizin.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Signalwegen und transkriptionellen Regulatoren, die die Entstehung und Expansion von HSC beeinflussen.
- Screening: Liefert quantitative, fluoreszenz- oder mikroskopiebasierte Kolonieergebnisse, die Dosis-Wirkungs-Analysen und die Bestätigung von Treffern unterstützen.
- Analytik: Ermöglicht eine multiparametrische Bewertung mittels mRNA-/Proteinexpression (z. B. Runx1), Kolonie-Morphologie und in-vivo-Repopulationseinheiten.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischer Kontinuität durch nachgewiesene Langzeitrekonstitution in kompetitiven Transplantationsmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur iterativen Zielvalidierung in mehreren Projekten im Bereich der Stammzell- und Blutkrankheits-Therapien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Zielvertrauen, indem molekulare Interventionen mit funktionellen HSC-Phänotypen in einem entwicklungsbiologisch präzisen System verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Protokolle zur Isolierung, Kultur und Dissoziation von Explantaten und reduziert so die Variabilität in funktionellen Assays.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem eine Absicherung von HSC-Zielen in einem frühen Stadium ermöglicht wird und späte Fehlschläge aufgrund fehlender mechanistischer Erkenntnisse minimiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem funktionelle Daten zur Selbstvermehrung und Differenzierungsfähigkeit von HSC für die Rangfolge der Ziele bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in embryonaler Dissektion und mikrochirurgischen Techniken, um die AGM-Region ohne Kontamination durch umgebendes Gewebe zu isolieren.
- Setzt eine sterile Zellkultur-Infrastruktur voraus, einschließlich CO2-Inkubatoren, Platten mit niedriger Bindungskapazität und steriler Filtration von Medium und Reagenzien.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams hinsichtlich der Platzierung der Explantate, der Dauer der Kollagenase-Digestion und der Kriterien zur Koloniezählung, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Die Übertragung auf nicht-murine Modelle kann durch artspezifische embryonale Zeitpläne und den Zugang zum Gewebe eingeschränkt sein und erfordert eine Validierung in jedem System.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört das enge embryonale Zeitfenster (E10,5–E11,5 bei Mäusen) für die Isolierung der AGM-Region, das die Durchsatzkapazität und Planung in Entdeckungskampagnen beeinträchtigt.
