3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Anwendung der Elektronentomographie mit seriellem Schnitt zu bestimmen, um die mitochondriale Ultrastruktur des indirekten Flugmuskels von Drosophila zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Strukturzellbiologie zu beantworten, wie z.B. die Struktur und die funktionelle Beziehung zu Mitochondrien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die zelluläre Ultrastruktur in drei Dimensionen sichtbar wird.

Um das Experiment zu beginnen, betäuben Sie fünf Drosophola-Proben auf Eis und tauchen Sie jede Fliege in einen Milliliter 4%ige niedrigschmelzende Agarose in Phosphatpuffer. Die Agarose auf Eis fest werden lassen. Verwenden Sie dann ein Mikrotom mit vibrierender Klinge, um in Agarosegel eingebettete Drosophola in Scheiben mit einer Dicke von 100 Mikrometern zu schneiden.

Tauchen Sie die Scheiben in eine Fixierlösung, die 2,5 % Glutaraldehyd in einem molaren Phosphatpuffer von null Komma eins enthält. Waschen Sie die Gewebeabschnitte in drei Tropfen Phosphatpuffer und waschen Sie anschließend mit zwei Tropfen Phosphatpuffer mit 20% BSA. Legen Sie die Abschnitte in Goldbehälter zum Einfrieren unter hohem Druck (HPF), die mit Puffer und 20 % BSA gefüllt sind.

Laden Sie anschließend die Probe mit den Trägern gemäß der Bedienungsanleitung in einen Hochdruckgefrierschrank. Nach dem Einfrieren lösen Sie die Träger unter flüssigem Stickstoff aus dem Halter und überführen sie in eine auf minus 140 Grad Celsius gekühlte freie Substitutionsvorrichtung. Führen Sie das Protokoll der freien Substitution mit dem FS-Cocktail durch, der 2 % Glutaraldehyd, 2 % Osmiumtetroxid und 0,1 % Uranylacetat in Aceton enthält.

Betten Sie die Proben bei Raumtemperatur in Harz ein. Polymerisieren Sie dann das Harz 16 Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Schneiden Sie die Probenblöcke ab, um die gewünschte Blockfläche freizulegen, die Gewebe enthält.

Anschließend 10 Nanometer Goldpartikel 30 Minuten lang mit 1% BSA vorbehandeln. Waschen und suspendieren Sie die Goldpartikel in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Überlagern Sie die Goldpartikel mit Kupfer-Objektträgergittern, die mit Kohlenstofffolie beschichtet sind, um Passermarken zu erzeugen.

Schneiden Sie serielle Abschnitte mit einer Dicke von 200 bis 250 Nanometern mit einem Ultramikrotom. Sammeln Sie dann die seriellen Abschnitte auf Schlitzrastern mit einer perfekten Schlaufe für dünne Schnitte. Färben Sie die Abschnitte 10 Minuten lang mit Reynolds-Bleicitrat.

Überlagern Sie die Oberseite der Abschnitte mit einer zweiten Schicht aus treuen Goldpartikeln. Laden Sie das Gitter auf eine zweiachsige Tomographiehalterung und setzen Sie es in das Transmissionselektronenmikroskop ein, das mit 200 Kilovolt arbeitet. Richten Sie das Mikroskop auf den euzentrischen Fokus aus.

Richten Sie die automatische Datenerfassungssoftware ein, stellen Sie den Elektronenstrahl in der Multiskalen-Bildgebungseinstellung ein und richten Sie ihn aus, erfassen Sie dunkle und helle Kamerareferenzen in einem leeren Bereich ohne Kohlefilm unter der Tomographie-Erfassungseinstellung. Sammeln Sie als Nächstes einen Rasteratlas mit geringer Vergrößerung. Wählen Sie Mitochondrien auf seriellen Schnitten als Ziele für die Tomographie-Entnahme aus, erfassen Sie eine Neigungsreihe von minus 60 Grad bis plus 60 Grad mit zwei Grad-Schritten auf der Achse A für jedes Ziel.

Sammeln Sie schließlich die zweite Neigungsserie. Drehen Sie den Probenhalter um 90 Grad. Erwerben Sie einen neuen Atlas.

Wählen Sie die entsprechenden Positionen aus und erfassen Sie die Neigungsreihe auf Achse B für jedes Ziel. Mit dieser Methode wurden 2D-Mikroskopaufnahmen und 3D-Tomographen aus seriellen Schnitten erstellt, die das gesamte Volumen eines Mitochondriums abdecken. Die verbundenen Tomogramme mit seriellem Querschnitt werden projiziert, um einen Längsschnitt zu erstellen, bei dem die Z-Achse vertikal dargestellt wird.

Die Elektronentomographie im seriellen Schnitt wurde eingesetzt, um die strukturellen Eigenschaften der mitochondrialen Cristae, die ihren energetischen Zustand und ihre Alterung widerspiegeln, zu analysieren. Schnitte mitochondrialer elektronentomographischer Rekonstruktionen zeigen Schalter zwischen den Lamellenmembranen durch die z-Achse. Tomographische Segmentierung, die eine linksdrehende Spirale in 3D darstellt.

Cristae-Schaltmuster wurden analysiert und die Farbe auf dem Segmentierungsmodell wiedergegeben. Ein tomographischer Schnitt zeigt die Konfluenz der lateralen Matrix über die Cristae-Membranen. Es wurde ein Segmentierungsmodell des Tomogramms erstellt, das die Konfluenz der lateralen Matrix und die repräsentativen Crista zeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Elektronentomographie mit seriellem Schnitt durchführt, die für die dreidimensionale Untersuchung jeder Zellstruktur geeignet sein kann.