Name: Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Lernen Sie ein vertikales Invasions-Assay zur Quantifizierung der Zellmigration in 3D bei Krebszellen. Diese Methode bewahrt das Mikromilieu seltener Zellen und ermöglicht Screening therapeutischer Wirkstoffe.

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Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) durch das RCMI-Zentrum für Gesundheit und Umwelt an Jackson State University und das US Department of Defense, Idea Award 11-1-0205 unterstützt.

Hinweis: Dieses Protokoll ist im McArdle Et Al. beschrieben. 11. eine Zeitleiste finden Sie in Abbildung 1.
1. Vorbereitung der Kultur-Platte
<ol><li>Waschen Sie die 35-mm-Kulturschale mit einem 10-mm-Glasboden mit 1 mL 1 M Salzsäure (HCl) für 15 min, Hydrophobie der Glasboden zu senken.</li>
	<li>Waschen Sie die Kultur-Platte zweimal mit 1 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) get rid of der HCl.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte Kultur zweimal mit 1 mL 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Spülen Sie die Kultur-Platte mit 1 mL der spezifischen Zellkulturmedium (hier Gebrauch α-MEM ergänzt mit 10 % Hitze inaktiviert FBS und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren). Hinweis: Die behandelten Kultur-Platte mit dem Kulturmedium kann erst am nächsten Tag in der CO2 Inkubator mit einem Luftbefeuchter bei 37 ° C gespeichert werden.</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellen (MSCs und MCF-7 Co Kultur) zu 100 % Konfluenz in den behandelten Glasboden gut von der 35-mm-Kulturschale. Gemeinsam Kultur 35.000 MSC Zellen und 75.000 MCF7 Zellen für 24 h.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Kollagen-Gel
<ol><li>Die Mikropipette Tipps für pipettieren die Kollagen-Gel in den Gefrierschrank verwendet, um zu verhindern, dass die Polymerisation des Kollagens bei Kontakt zu speichern. Hinweis: Dies ist der wichtigste Schritt.</li>
	<li>Bestimmen Sie ein Volumen von Ratte Schweif Kollagen ich verwendet werden basierend auf die Konzentration von Kollagen-Lager. Dieser Assay 100 µL Kollagen Gel vorbereiten. Hinweis: Hoher Konzentration von Ratte Schweif Kollagen, die ich auf Lager funktioniert besser. Bestimmen Sie die Lautstärke von 10 x Dulbeccos geändert Eagle Medium verwendet werden, um das Kollagen entsprechend zu verdünnen.</li>
	<li>Kombinieren Sie auf Eis Ratte Schweif Kollagen I (3,8 µg/mL Brühe), 10 X Dulbecco geändert Eagle Medium und 1 X Zellkulturmedium ergänzt um 2 % fötalen Rinderserum und die entsprechenden Lockstoffgradient auf eine Endkonzentration von Kollagen von 2,4 mg/mL.</li>
	<li>Hinzu kommt die Mischung 4,5 % Natriumbikarbonat-Lösung, die Kollagen-Gel zu neutralisieren. Hinweis: Das Volumen der Natriumbicarbonat-Lösung hinzugefügt variieren basierend auf der genauen pH-Wert der anderen Reagenzien. Es empfiehlt sich, die Mischung mit pH-Streifen, neutrale Lösung zu gewährleisten, oder verwenden Sie einen pH-Indikator in das Kulturmedium zu testen.</li>
	<li>Legen Sie über die Zellen innerhalb der Glasboden gut von der Kulturschale 80 µL der Kollagen-Mischung.</li>
	<li>Lassen Sie das Kollagen-Gel zu polymerisieren für 30 min in einem CO2 Inkubator mit einem Luftbefeuchter bei 37 ° C.</li>
	<li>Decken Sie das Kollagen-Gel mit 2 mL Zelle Medium mit reduzierten Serum (2 %) und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator mit einem Luftbefeuchter für 24, 48 oder 72 h. Vorsicht: Die Platte sollte mit Sorgfalt zu verhindern, dass das Kollagen-Gel aus der Glasboden behandelt werden.</li>
</ol>3. Beispiel der Herstellung von Kollagen gel mit einer Ratte Kollagen Reitstock von 3,8 µg /mL
<ol><li>Kombinieren Sie auf dem Eis 114,5 µL Ratte Schweif Kollagen, 16,6 µL 10 x DMEM und 33,1 µL Kulturmedium, enthält die Lockstoffgradient.</li>
	<li>Neutralisieren Sie die Kollagen-Mischung mit 14,0 µL Natriumbicarbonat.</li>
	<li>Weiter wie in Schritt 2.5.</li>
</ol>4. Bildgebung der Zellen
<ol><li>Entfernen Sie vorsichtig die Medien aus der Schale.</li>
	<li>Sanft spülen Sie das Gel mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Befestigen Sie die Zellen mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit DAPI-Lösung (100 ng/mL) für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bild der Zellen unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops an verschiedenen Standorten und 400 µm Z-Stapel Bilder von jedem Standort in 16 µm Schritten. Das Mikroskop verwendet hat eine Festplatte, die Scan-Einheit, die konfokale Bildgebung mit einem weißen Licht, Bogen Anregungsquelle ermöglicht. Verwenden Sie ein 20 X Objektiv mit numerischer Apertur von 0,75 genutzt.</li>
	<li>Bilder zu rekonstruieren.<ol>
<li>Öffnen Sie Bilder für ein bestimmtes Gel (ca. 25 Bilder) und erstellen Sie einem Bildstapel zu, indem Sie auf Bild → Stapel → Bilder stapeln. Das erste Bild entsprach der Unterseite des Gels (Z = 0 µm), das zweite Bild entsprach der erste Schritt in Z-Richtung (Z = 16 µm), das dritte Bild entsprach der zweite Schritt in Z-Richtung (Z = 32 µm). Beurteilen Sie jeder Kern in jedem Bildtiefe zu und benennen Sie die Tiefe, an der die Keimzelle im schärfsten Fokus als die Invasion Tiefe für diese bestimmten Zelle war.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparison+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li>
<li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho%2FROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li>
<li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198(2008).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li>
<li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion%3A+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li>
<li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li>
<li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Fusion%3A+Mechanisms+Slowly+Unravel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interesse vorhanden ist.

Hier beschreiben wir eine einfache umgekehrte vertikale Invasion-Probe, die eignet sich für eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich der Zellen, die seltene und/oder ihrer Mikroumgebung abhängig sind. In diesem 3D Invasion-Assay Zellen bleiben in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung und fallen unter das Kollagen-Gel mit einem Lockstoffgradient. Die Zellen dann migrieren und dringen in das Kollagen. In diesem Test werden die Zellen gefärbt und leicht in das Gel überwacht. Die Einfachheit und Reproduzierbarkeit des Assays...

Zelle Motilität ist ein normaler Entwicklungs- und physiologischen Prozess der Zellen. Allerdings sind Änderungen in der Struktur und die Fähigkeit der Zellen zur Migration und Invasion mit pathologischen Zuständen, einschließlich der entzündlichen Erkrankungen und Krebs Metastasen1,2,3verbunden. Metastasierung ist wohl der am wenigsten verstandenen Aspekt in der Krebstherapie. Um zu metastasieren, müssen Krebszellen zersetzen die extra-zellulären Matrix (ECM), erobern die lokalen Gewebe und Intravasate. Einmal im Umlauf werden die Krebszellen in den entfernten Standort verbreiten, Leber und sekundäre Tumore bilden. Daher die Fähigkeit der Zellen, die ECM zu vermindern, zu migrieren und zu erobern bezieht sich auf ihr metastatische Potential. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um zu analysieren und die Migration und Invasion Funktionen von Zellen zu quantifizieren. Die am häufigsten verwendeten Ansätze umfassen die Wundheilung Assay, Time-Lapse-Mikroskopie und Boyden Kammer Assay. Die Wunde heilende Assay4 und Zeit verfallen Mikroskopie sind einfache und bequeme Assays, die ersten Einblick in die Zellwanderung geben würde. Jedoch sind beide 2D Assays, die nicht die 3D-Umgebung widerspiegeln, die wie Zellen in Vivoexistieren. Studien haben gezeigt, dass Zellen in einer 3D Umgebung im Vergleich zu einem 2D eine5,6unterschiedlich reagieren. Darüber hinaus sind heilende Wunde Assays schwer zu reproduzieren und zu quantitativen Ergebnissen7,8,9ergeben. Die Zelle Sperrzone Assay, die eine 3D Modifikation der Wundheilung Assay ist, ist ein mehr physiologisch relevanten Assay aber es ist nicht geeignet für niedrige Zahl wie z. B. Hybridzellen aus Zelle Fusion Veranstaltungen10,11 Zellen .
Boyden Kammer Assay ist ein 3-dimensionales Assay, der zelluläre Studien relevanten Mikroumgebungen vorsieht. Es erfordert jedoch Zellen aus ihrer ursprünglichen Mikroumgebung entfernt werden und in der oberen Kammer des Boyden-Testsystem zu migrieren und dringen nach unten in Richtung der Lockstoffgradient enthaltenden Medium hinterlegt werden. Diese 3D Methode eignet sich nicht bei der Analyse der Migration und Invasion Fähigkeit der Zellen, die anfällig für ihre Mikroumgebung und/oder in begrenzter Anzahl10,11,12. Ein neuer Ansatz zur Zelle Migration und Invasion zu analysieren ist der mikrofluidischen gradient Kammer Assay13. Obwohl geeignet und zuverlässig in der Migration und Invasion Studien, dieser Test ist teurer und für ein typisches Labor technisch schwierig sein könnte. Wir beschreiben hier einen einfache umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der kompatibel mit vielen Zelltypen, einschließlich der Zellen empfindlich auf ihrer Mikroumgebung und/oder beschränkter Zahl ist. Dieser Test wurde von dem Protokoll vorgeschlagen von Hooper Et al. 14. in diesem Test die Zellen bleiben in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung und ihrer Migration und Invasion wird überwacht, da sie nach oben in das Kollagen-Gel mit einem Lockstoffgradient11bewegen. Dieser Assay ist reproduzierbar und optimiert und validiert in der Kulturschale von 35 mm. Es könnte verschiedene Assay-Bedingungen, einschließlich der verschiedenen Zellgrößen Kultur, verschiedenen Matrizen oder Stärke der Adhäsion und verschiedenen Chemoattractants angepasst werden. Dieser Test könnte als in-vitro- Plattform für die erste Sichtung in der Arzneimittelforschung dienen.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>mattek Glasbodenschalen</td></tr><tr><td>Rattenschwanz Kollagen I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td>Kollagen Gel</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>Pbs</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</subfokal>es</td></tr> <tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Definiertes fötales Rinderserum</td><td>GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Saphir Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0.8 Objektiv</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane Inc. Zürich, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris Software</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&alpha;-minimales essentielles Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, VA, USA</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi und Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X Objektiv UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X Objektiv</td></tr></tbody></table>

nach oben bewegen: eine einfache und flexible in-vitro- dreidimensionale invasion assay protokoll

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Obwohl 3D Invasion Assays entwickelt worden sind, bleibt die Herausforderung, um Zellen zu untersuchen, ohne die Integrität ihrer Mikroumgebung. Traditionelle 3D Tests wie der Boyden Kammer erfordern, dass Zellen verdrängt vom ursprünglichen Speicherort, Kultur und zog in eine neue Umgebung. Nicht nur stört dies die zelluläre Prozesse, die untrennbar mit der Mikroumgebung sind, aber es führt oft zu einem Verlust von Zellen. Diese Probleme sind eine besondere Herausforderung im Umgang mit Zellen, die entweder selten oder extrem empfindlich auf ihrer Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines 3D Invasion-Assays, die beide Probleme vermeidet. In diesem Assay Zellen sind in einem kleinen gut beschichtet und eine ECM-Matrix mit einer Lockstoffgradient auf die Zellen gelegt. Dies erfordert keine Verschiebung der Zelle und ermöglicht es die Zellen, nach oben in die Matrix zu erobern. In diesem Test kann innerhalb der Kollagen-Gel Zellinvasion sowie Zellmorphologie beurteilt werden. Mit Hilfe dieser Assay, kennzeichnen wir die invasive Kapazität der seltene und empfindliche Zellen; die Hybridzellen infolge Fusion von Brustkrebs-Zellen MCF7 und mesenchymalen/multipotenten Zellen Stammzellen/Stroma (MSCs).

Wir haben eine 35-mm-Kulturschale mit einem Glas unten und Ratte Schweif Kollagen verwendet ich entwickeln und optimieren einer in-vitro- 3D Invasion assay Protokoll. Mit diesem Test, wir haben gezeigt, dass Brust Krebszellen MCF7 und MSC Zellen könnte dringen in das Kollagen-Gel in einer mittleren Entfernung von 0,04 ± 1,8 µm und 41,3 ± 76,0 µm bzw. nach 48 h bei IGF1 (18.6 ng/mL) diente als Lockstoffgradient (Abbildung 2). Noch wichtiger ist, haben...

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Invasionsassays ist es, die Migrations- und Invasivitätskapazitäten seltener und empfindlicher Zellen in einer 3D-Umgebung zu quantifizieren, ohne die Zellen aus ihrer Mikroumgebung zu verdrängen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Krebsforschung über die Invasionsfähigkeit von empfindlichen und orayartigen Ereignissen, wie z. B. Krebszellfusionsprodukten, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung mit einer 3D-Einstellung analysiert werden.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebs, da sie zum Screening pharmakologischer Wirkstoffe verwendet werden kann, die in der Lage sind, die Invasion und Metastasierung von Krebszellen zu hemmen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung. Die Aspiration der Temperatur und des pH-Werts der Kollagenmischung beeinflusst ihre Polymerisation und eine grobe Handhabung führt dazu, dass sich das Gel ablöst.Beginnen Sie damit, eine 35-Millimeter-Kulturschale mit einer 10-Millimeter-Glasbodenvertiefung mit einem Milliliter eines molaren Salzsäures zu behandeln, um die Hydrophobie des Glases zu verringern. Waschen Sie die Platte nach 15 Minuten zweimal mit einem Milliliter PBS pro Waschgang, gefolgt von einer Wäsche mit einem Milliliter 70%igem Ethanol. Spülen Sie anschließend die Platte mit einem Milliliter Kulturmedium aus, das für die zu verwendenden Zellen von Interesse spezifisch ist.Und besäen Sie den Teller mit den interessierenden Zellen. Stellen Sie die Platte dann in einen Zellkultur-Inkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen, kombinieren Sie 114,5 Mikroliter frisch zubereitetes Rattenschwanzkollagen, 16,6 Mikroliter 10 X DMEM-Medium und 33,1 Mikroliter Kulturmedium, ergänzt mit einem Chemo-Lockstoff von Interesse, in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.Neutralisieren Sie die Kollagenmischung mit 14 Mikrolitern Natriumbikarbonat und überlagern Sie die Zellen mit 80 Mikrolitern Gel. Lassen Sie das Kollagen in einem befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid 30 Minuten lang polymerisieren. Schichten Sie dann zwei Milliliter reduziertes zweiprozentiges Serum-Zellkulturmedium über das Gel und bringen Sie die Zellen vorsichtig für den entsprechenden Versuchszeitraum in den Inkubator zurück, ohne das Kollagen zu verdrängen.Entfernen Sie am Ende der Inkubation vorsichtig das Medium und spülen Sie das Gel vorsichtig mit einem Milliliter PBS aus. Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit einem Milliliter vierprozentigem Paraformaldehyd, gefolgt von zwei Waschgängen in einem Milliliter PBS pro Waschgang. Markieren Sie dann die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI-Lösung und bilden Sie die dreidimensionale Kollageninvasion in vitro durch konfokale Mikroskopie ab.Hier wird die Quantifizierung der Invasion des Kollagengels durch eine Brustkrebszelllinie und Brustkrebszellfusionsprodukte als Reaktion auf einen Chemolockstoff über einen 48-stündigen Migrationszeitraum gezeigt. Bemerkenswert ist auch, dass die Migration von seltenen Fusionsprodukten aus Brustkrebszellen in das Kollagengel als Reaktion auf den Chemolockstoff beobachtet wurde. Die Zellen bleiben während des gesamten Kollagengel-Experiments gesund, was sich in der Aufrechterhaltung einer robusten Zellzahl und ihrer Morphologie 48 Stunden nach der Gelpolymerisation zeigt.Dieser vertikale Kollagen-Gel-Assay ermöglicht auch die Analyse der Kinetik der Zellmigration bei der Invasion, indem die Zellmigration in der Z-Serie abgebildet wird, sowie die Morphologie der migrierenden Zellen, die in situ erfasst werden sollen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Kulturschale zu verwenden, die mit Ihrem Mikroskop kompatibel ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Variablen wie die Modifikation der Kollagenstärke oder die Verwendung verschiedener Chemolockstoffe eingeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen der EZM-Beteiligung auf die Zellinvasion bzw. der Auswirkungen verschiedener Chemolockstoffe auf die Zellinvasion zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biologie und des Krebses den Weg, um nach pharmakologischen Inhibitoren der Metastasierung zu suchen und die Wundheilung bei allen Entzündungsreaktionen in vivo zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Migrations- und Invasivität seltener und empfindlicher Zellen in einer 3D-Umgebung beurteilen können, ohne die Zellen auf der Mikrobeteiligung zu verzerren. Vergessen Sie nicht, dass das Gehen mit menschlichen Krebszellen, Salzsäure, Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung eines Bioseptikschranks Nummer zwei und eines Abzugsbehälters.

moving-upwards-simple-flexible-vitro-three-dimensional-invasion-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video zeigt, wie man Zellen Invasion durch Zellkultur-Einsätze mit einem Fluoreszenz-basierten Methoden zu messen.

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

Models of Tumorzellinvasion in dreidimensionale extrazelluläre Matrix besser...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine integrierte Methode untersucht Krebs Zelle Migration und Invasion auf einer einzigen Plattform in Echtzeit und bietet eine leicht reproduzierbare und zeitsparende Option Zelle Mobilität und Morphologie.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Lernen Sie ein vertikales Invasions-Assay zur Quantifizierung der Zellmigration in 3D bei Krebszellen. Diese Methode bewahrt das Mikromilieu seltener Zellen und ermöglicht Screening therapeutischer Wirkstoffe.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

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