Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll
12. März 2018
Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.
Das übergeordnete Ziel dieses Invasionsassays ist es, die Migrations- und Invasivitätskapazitäten seltener und empfindlicher Zellen in einer 3D-Umgebung zu quantifizieren, ohne die Zellen aus ihrer Mikroumgebung zu verdrängen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Krebsforschung über die Invasionsfähigkeit von empfindlichen und orayartigen Ereignissen, wie z. B. Krebszellfusionsprodukten, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung mit einer 3D-Einstellung analysiert werden.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krebs, da sie zum Screening pharmakologischer Wirkstoffe verwendet werden kann, die in der Lage sind, die Invasion und Metastasierung von Krebszellen zu hemmen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung. Die Aspiration der Temperatur und des pH-Werts der Kollagenmischung beeinflusst ihre Polymerisation und eine grobe Handhabung führt dazu, dass sich das Gel ablöst.
Beginnen Sie damit, eine 35-Millimeter-Kulturschale mit einer 10-Millimeter-Glasbodenvertiefung mit einem Milliliter eines molaren Salzsäures zu behandeln, um die Hydrophobie des Glases zu verringern. Waschen Sie die Platte nach 15 Minuten zweimal mit einem Milliliter PBS pro Waschgang, gefolgt von einer Wäsche mit einem Milliliter 70%igem Ethanol. Spülen Sie anschließend die Platte mit einem Milliliter Kulturmedium aus, das für die zu verwendenden Zellen von Interesse spezifisch ist.
Und besäen Sie den Teller mit den interessierenden Zellen. Stellen Sie die Platte dann in einen Zellkultur-Inkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen, kombinieren Sie 114,5 Mikroliter frisch zubereitetes Rattenschwanzkollagen, 16,6 Mikroliter 10 X DMEM-Medium und 33,1 Mikroliter Kulturmedium, ergänzt mit einem Chemo-Lockstoff von Interesse, in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
Neutralisieren Sie die Kollagenmischung mit 14 Mikrolitern Natriumbikarbonat und überlagern Sie die Zellen mit 80 Mikrolitern Gel. Lassen Sie das Kollagen in einem befeuchteten Inkubator mit 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid 30 Minuten lang polymerisieren. Schichten Sie dann zwei Milliliter reduziertes zweiprozentiges Serum-Zellkulturmedium über das Gel und bringen Sie die Zellen vorsichtig für den entsprechenden Versuchszeitraum in den Inkubator zurück, ohne das Kollagen zu verdrängen.
Entfernen Sie am Ende der Inkubation vorsichtig das Medium und spülen Sie das Gel vorsichtig mit einem Milliliter PBS aus. Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit einem Milliliter vierprozentigem Paraformaldehyd, gefolgt von zwei Waschgängen in einem Milliliter PBS pro Waschgang. Markieren Sie dann die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI-Lösung und bilden Sie die dreidimensionale Kollageninvasion in vitro durch konfokale Mikroskopie ab.
Hier wird die Quantifizierung der Invasion des Kollagengels durch eine Brustkrebszelllinie und Brustkrebszellfusionsprodukte als Reaktion auf einen Chemolockstoff über einen 48-stündigen Migrationszeitraum gezeigt. Bemerkenswert ist auch, dass die Migration von seltenen Fusionsprodukten aus Brustkrebszellen in das Kollagengel als Reaktion auf den Chemolockstoff beobachtet wurde. Die Zellen bleiben während des gesamten Kollagengel-Experiments gesund, was sich in der Aufrechterhaltung einer robusten Zellzahl und ihrer Morphologie 48 Stunden nach der Gelpolymerisation zeigt.
Dieser vertikale Kollagen-Gel-Assay ermöglicht auch die Analyse der Kinetik der Zellmigration bei der Invasion, indem die Zellmigration in der Z-Serie abgebildet wird, sowie die Morphologie der migrierenden Zellen, die in situ erfasst werden sollen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Kulturschale zu verwenden, die mit Ihrem Mikroskop kompatibel ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Variablen wie die Modifikation der Kollagenstärke oder die Verwendung verschiedener Chemolockstoffe eingeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Auswirkungen der EZM-Beteiligung auf die Zellinvasion bzw. der Auswirkungen verschiedener Chemolockstoffe auf die Zellinvasion zu beantworten.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biologie und des Krebses den Weg, um nach pharmakologischen Inhibitoren der Metastasierung zu suchen und die Wundheilung bei allen Entzündungsreaktionen in vivo zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Migrations- und Invasivität seltener und empfindlicher Zellen in einer 3D-Umgebung beurteilen können, ohne die Zellen auf der Mikrobeteiligung zu verzerren. Vergessen Sie nicht, dass das Gehen mit menschlichen Krebszellen, Salzsäure, Paraformaldehyd und DAPI äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung eines Bioseptikschranks Nummer zwei und eines Abzugsbehälters.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt einen invertierten vertikalen Invasionsassay, der die Migrations- und Invasionsfähigkeit seltener und empfindlicher Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung quantifiziert, während das zelluläre Mikromilieu erhalten bleibt. Diese Methode ist besonders relevant für die Krebsforschung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellmigration
- Krebsforschung
- Invasionsassays
Hintergrund
- Der Assay ermöglicht die Analyse von Zellen in ihrem ursprünglichen Mikroumfeld.
- Er ist für seltene und empfindliche Zellen konzipiert.
- Das Verständnis der Zellinvasion ist entscheidend für die Entwicklung von Krebstherapien.
- Die visuelle Demonstration der Technik ist für eine korrekte Durchführung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Um die migratorischen und invasiven Kapazitäten von Zellen zu quantifizieren.
- Um die Invasionsfähigkeit empfindlicher Zellen zu untersuchen.
- Um pharmakologische Wirkstoffe zu screenen, die die Invasion und Metastasierung von Krebszellen hemmen.
Verwendete Methoden
- Invertierter vertikaler Invasionstest
- Dreidimensionale Zellkultur
- Analyse von Zellen in ihrem Mikroumfeld
- Beurteilung der Auswirkungen von Temperatur und pH auf die Kollagenpolymerisation
Hauptergebnisse
- Zeigte die Fähigkeit, das Zellverhalten in einem dreidimensionalen Umfeld zu analysieren.
- Unterstrich die Bedeutung der Aufrechterhaltung des zellulären Mikromilieus.
- Lieferte Erkenntnisse über die invasiven Fähigkeiten von Krebszellen.
- Zeigte Potenzial für die Untersuchung therapeutischer Wirkstoffe.
Schlussfolgerungen
- Der Test ist ein wertvolles Werkzeug für die Krebsforschung.
- Er erhält das Mikromilieu empfindlicher Zellen.
- Kann bei der Entwicklung von Therapien zur Bekämpfung von Krebsinvasion und -metastasierung helfen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mithilfe dieses Assays können Biopharma-F&E-Teams das invasive Potenzial seltener und empfindlicher Zellmodelle in einem physiologisch relevanten 3D-Mikroumfeld bewerten, ohne die nativen Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) zu stören. Durch die Erhaltung der ursprünglichen zellulären Nische ermöglicht die Methode eine mechanistische Entschärfung von metastaserelatierten Zielstrukturen und erhöht die Vorhersagesicherheit bei der frühen Validierung von Targetstrukturen. Sie schließt eine entscheidende Lücke im präklinischen Screening, bei dem herkömmliche Assays die Integrität des Mikroumfelds beeinträchtigen, und verbessert dadurch die Translation von der Entdeckung bis zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Beurteilung der Invasion in seltenen oder durch Fusion entstandenen Zellmodellen unter nativen mikrobiellen Bedingungen.
- Operativer Wert: Verringert artefaktbedingte Variabilität, die durch Zellverlagerung verursacht wird, und verbessert so die Reproduzierbarkeit von Invasionsphänotypen über verschiedene Experimente hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen, indem molekulare Störungen mit funktionellen Invasionsergebnissen in einem dreidimensionalen Kontext verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Invasionmetriken, die mit hochinformativen Bildgebungsverfahren und automatisierten Analyseworkflows kompatibel sind.
- Reproduzierbarkeit: Verringert die Variabilität zwischen Wells, indem mechanische Störungen der Zellschichten während des Assay-Setups eliminiert werden.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit unterschiedlichen Kollagenkonzentrationen und Chemoattraktanten, wodurch Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) für Metastasehemmstoffe untersucht werden können.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die Invasion menschlichen Krebses unter Verwendung von Fibroblasten-Epithel-Hybridzellen, die stromale Tumor-Interaktionen in vivo widerspiegeln.
- Translationale Kontinuität: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit der präklinischen Validierung, indem mikroumgebungsbedingte Signale erhalten bleiben, die für invasives Verhalten entscheidend sind.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Liefert funktionelle Invasionsdaten, um Zielstrukturen oder Wirkstoffe zu priorisieren, deren Versagen in späteren Entwicklungsstadien aufgrund unzureichender Modellierung der Mikroumgebung weniger wahrscheinlich ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Assay fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Identifizierung ein und bietet eine Alternative zu Boyden-Kammern oder Transwell-Systemen, die den Mikroumfeld erhaltend für metastasierungsrelevante Programme geeignet ist.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die hypothesengeleitete Untersuchung von Invasionwegen, indem zeitgleiche Z-Stack-Aufnahmen der Zellmigration in physiologischen Kollagengelen ermöglicht werden.
- Screening: Liefert Endpunkt-Daten zur Zellinvasion, die für das Screening von Substanzbibliotheken geeignet sind, insbesondere für Wirkstoffe, die auf die Umgestaltung der extrazellulären Matrix oder chemotaktische Signalwege abzielen.
- Analytik: Ermöglicht die Quantifizierung der eingewanderten Zellanzahl und eine morphometrische Analyse und liefert damit multiparametrische Messgrößen für Struktur-Funktions-Korrelationen.
- Translationale Forschung: Modelliert stromavermittelte Invasion unter Verwendung von MSC-Tumor-Hybriden und unterstützt damit mechanistische Studien, die mit Biomarkern verknüpft sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Ist über verschiedene Krebsarten und stromale Kokulturen hinweg anwendbar und fördert die Wiederverwendung der Plattform in Programmen zur Metastasierung und Wundheilung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem falsch-positive Ergebnisse durch Störungen des Mikroumfelds verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Robustheit des Assays durch standardisierte Protokolle zur Gel-Polymerisation und Überlagerung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, indem physiologisch relevante Invasionsdaten frühzeitig in der Pipeline bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikobasierte Weiterentwicklung von Metastase-Inhibitoren anhand funktioneller 3D-Invasionsprofile.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der 3D-Zellkultur und der konfokalen Mikroskopie zur genauen Quantifizierung der Invasion.
- Ist abhängig von einer präzisen Temperatur- und pH-Kontrolle während der Kollagenherstellung, um eine gleichmäßige Gel-Polymerisation sicherzustellen.
- Setzt standardisierte Dosierung von Chemoattraktanten und medienbedingte serumreduzierte Bedingungen voraus, um reproduzierbare chemotaktische Reaktionen zu erzielen.
- Die Anpassung an alternative ECM-Proteine (z. B. Matrigel, Fibrin) kann eine Optimierung der Gelierkinetik und -konzentration erfordern.
- Auf adhärente oder semi-adhäsive Zellen beschränkt, die in der Lage sind, nach oben durch eine Gel-Überlagerung einzudringen; für nicht-attachierte Suspensionen sind möglicherweise Modifikationen notwendig.
