Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur
23. Februar 2018
Objektiv-freie Videomikroskopie ermöglicht es uns, Zellkulturen direkt in die Brutmaschine zu überwachen. Hier beschreiben wir die vollständige Protokoll zum erwerben und analysieren eine 2,7 Tage lang Übernahme von kultivierten HeLa-Zellen, was zu einem Dataset von 2,2 x 106 Messungen der einzelnen Zellmorphologie und 10584 Zellzyklus tracks.
Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Dynamik der großen Population adhärenter Zellen zu erfassen und zu analysieren, die mittels linsenloser Videomikroskopie überwacht wird. Wir glauben also, dass diese Technik in vielen Bereichen der Biologie und für die Untersuchung der Zellproliferation oder Zellzystitis oder des Wirkstoffscreenings oder verschiedener Bioprozessüberwachungen interessant ist. Diese Technik ist also etikettenfrei und sehr einfach.
Aber es ist sehr effektiv bei der Untersuchung großer Zellpopulationen. Was für eine Idee für diese Methode, als wir vom Bereich des Nachweises von Bakterien zum Bereich der Bildgebung von Säugetierzellen wechselten. Dann war es von Nutzen, dass der Biologe eine Zeitrafferaufnahme des Schaltkreises direkt in den Inkubator benötigt.
Dann haben wir ein maßgeschneidertes linsenloses Videomikroskop gebaut, das mit dem Inkubator kompatibel ist, und wir haben einen holografischen Rekonstruktionsalgorithmus entwickelt, um ein Bild von Tausenden von Zellen zu erhalten, die in einem sehr großen Sichtfeld vorhanden sind. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie eine 6-Well-Glasbodenplatte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Fibronektin beschichten. Entfernen Sie nach 1 Stunde überschüssiges Fibronektin und spülen Sie die 6-Well-Glasbodenplatte mit PBS aus.
In dieser Demonstration werden Hela-Zellen, die in DMEM gezüchtet wurden, sowie Glutaminmedium, ergänzt mit 10 % Hitze in aktiviertem fötalem Kälberserum, und 1 % Penicillin und Streptomycin verwendet. Säen Sie zwanzigtausend Zellen pro Kulturplatte. Es ist wichtig, einen Behälter mit Glasboden zu verwenden.
Für die Qualität der linsenlosen Erfassung. Legen Sie die Kulturplatte in den Inkubator auf das linsenlose Videomikroskop. Das objektivlose Videomikroskop, das für diese Zeitrafferaufnahme verwendet wird, ist im Handel erhältlich.
Es verfügt über einen Metalloxid-Halbleiter-Bildsensor mit einer Abbildungsfläche von 29,4 Quadratmillimetern und einem Pixelabstand von 1,67 Mikrometern. Die Beleuchtung mit mehreren Wellenlängen wird durch eine Multi-Chip-Leuchtdiode gewährleistet, die sich über einer 150 Mikrometer großen Lochblende in einem Abstand von etwa 5 Zentimetern von den Zellen befindet. Bevor Sie mit der Zeitrafferaufnahme beginnen, ist es wichtig zu überprüfen, ob sich kein Kondenswasser auf der Abdeckplatte befindet.
Denn Kondensation verschlechtert die Bildqualität der Aufnahme. Wenn auf dem Deckel der Kulturplatte Kondenswasser aufgetreten ist, reinigen Sie den Deckel. Steuern Sie das videolinsenlose Mikroskop mit einer handelsüblichen Erfassungssoftware.
Diese führt sowohl die Zeitraffererfassung als auch die holographische Rekonstruktion durch. Geben Sie die erforderlichen Eingabeparameter in die Softwareoberfläche ein. Legen Sie die Bildrate auf 1 Erfassung alle 10 Minuten, den Zellkulturtyp auf adhärent und die Dauer des Experiments auf 3 Tage fest.
Starten Sie die Zeitrafferaufnahme. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für das volle Sichtfeld einer Rohaufnahme im blauen Kanal auf einer Fläche von 29,4 Quadratmillimetern in einem Frame. Panel B ist das Detail von Panel A, und Panel C ist das Detail von Panel B. Der holographische Rekonstruktionsalgorithmus verarbeitet automatisch die linsenfreie Erfassung, um das Phasenbild der Zellkultur zu erhalten.
Es wird ein Beispielbild von Zellen vor dem Phasen-Unwrapping gezeigt, gefolgt von einem Bild nach dem Phasen-Unwrapping. Die Zellverfolgung erfolgt mithilfe des TrackMate-Algorithmus, einem Open-Source-Plug-in für die automatisierte Verfolgung einzelner Partikel. Nach dem Laden, der vollständigen Zeitraffererfassung in Fidschi und der Konfiguration der Algorithmen, wie im Textprotokoll beschrieben, werden die Eingabeparameter eingestellt.
Legen Sie den geschätzten Blob-Durchmesser auf 15 Pixel, den Detektorschwellenwert auf 0,25, den maximalen Verknüpfungsabstand auf 15 Pixel, den maximalen Abstand zum Schließen der Lücke auf 15 Pixel und die Anzahl der Punkte im Track auf 3,5 fest. Der erste Schritt im Zellverfolgungsalgorithmus ist die Detektion von Zellen in der linsenfreien Erfassung. Die Ergebnisse des Zellverfolgungsalgorithmus werden angezeigt, wobei alle Zellspuren über fünfzig Frames oder etwa 8 Stunden angezeigt werden.
Mit einem Farbcode, der der mittleren Geschwindigkeit entspricht. Das untere Feld ist ein detailliertes Bild des gelben Rechtecks aus dem oberen Fenster. Hier wird ein repräsentativer Videoclip der Zellverfolgung gezeigt.
Wählen Sie am Ende des Zellverfolgungsprozesses die Schaltfläche "Analyse" aus, um die Ergebnisse in Form von 3 Textdateien zu generieren. Auf der Grundlage dieser Daten führen Sie eine Zellsegmentierung durch und erkennen Zellteilungen mit speziellen Algorithmen, wie im Textprotokoll und in ergänzenden Codedateien beschrieben. Durch die Zusammenstellung aller Einzelzellmessungen über die vollständige Zeitraffererfassung werden Streudiagramme mehrerer Metriken als Funktion der Zeit erstellt.
Die Gesamtzahl der Zellen im gesamten Sichtfeld erhöht sich in 2,7 Tagen von zweitausend auf fünfzehntausend. Multipliziert mit der Anzahl der Zeitpunkte ergibt sich ein großer Datensatz an detektierten Zellen. Jedes zeichnet sich durch seine Koordinaten und morphologischen Merkmale aus, wie z. B. Trockenmasse, Fläche, durchschnittliche Mächtigkeit, Hauptzugangslänge und Streckungsverhältnis.
Die Kombination von Zellverfolgungs- und Zellsegmentierungsalgorithmen ermöglicht kinetische Messungen auf Einzelzellebene. Dieses Beispiel zeigt die Analyse der Zellspur, die etwa sechsundsechzig Stunden dauert und 4 Zellteilungen zu den gelb eingekreisten Zeitpunkten zeigt. Mehrere Metriken wurden als Funktion der Zeit berechnet: Zelloberfläche, Trockenmasse, durchschnittliche Dicke und Zellmotilität.
Die Verteilung der Zellzyklusdauer für die 2,7-tägige Beobachtung lag nahe der Agouzian-Verteilung. Mit einem Mittelwert von 16,5 Stunden. Die Länge der Zellzyklen, die automatisch gemessen wird, ist gut mit den manuell gemessenen korreliert.
Es wurden auch andere Parameter untersucht, wie z.B. die anfängliche Trockenmasse der Zelle, die endgültige Trockenmasse und die durchschnittliche Wachstumsrate während des Zellzyklus. Einmal gemeistert, kann die vollständige Datenanalyse der Zeitraffererfassung in wenigen Stunden durchgeführt werden, abhängig von der CPU-Konfiguration und der Hardwareleistung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, die anfängliche Zellkonzentration sorgfältig zu bestimmen.
Wenn die anfängliche Zellkonzentration zu groß ist, kann der Zellverfolgungsalgorithmus die Zelltrajektorien nicht richtig definieren. Ist die Zellkonzentration jedoch zu niedrig, ist auch die Statistik der vollständigen Analyse zu niedrig. Im Anschluss an dieses Verfahren können automatisierte Analysen wie Zellverfolgungen durchgeführt werden, um andere Fragen in den Bereichen Biologie, Grundlagenbiologie oder Chemotaxis zu beantworten.
Diese neue Technik ebnet auch den Weg für die Überwachung der Zellabstammung, die hoffentlich interessante Erkenntnisse für die Untersuchung des Zellzyklus bringen wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zeitrafferaufnahmen mit Hilfe der linsenlosen Videomikroskopie durchführt und wie man eine große Population von Zellen analysiert.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Methodik unter Verwendung von linsenfreier Videomikroskopie zur direkten Überwachung von Zellkulturen innerhalb eines Inkubators. Das Protokoll ermöglicht die Erfassung und Analyse umfangreicher Datensätze über Zellmorphologie und Zellzyklusdynamik.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Mikroskopie-Techniken
- Zellproliferationsstudien
Hintergrund
- Linsenfreie Videomikroskopie ist eine etikettierungsfreie Bildgebungstechnik.
- Sie ermöglicht die Zeitrafferaufnahme von Zellkulturen.
- Diese Methode ist effektiv für die Untersuchung großer Populationen von adhärenten Zellen.
- Sie hat Anwendungen in verschiedenen biologischen Bereichen, einschließlich des Wirkstoffscreenings.
Zweck der Studie
- Um die Dynamik großer Populationen von adhärenten Zellen zu erfassen und zu analysieren.
- Um eine einfache, aber effektive Methode zur Überwachung des Zellverhaltens bereitzustellen.
- Um die Forschung in Zellproliferation und anderen biologischen Prozessen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Linsenfreie Videomikroskopie für die Bildgebung.
- Zeitrafferaufnahme von kultivierten HeLa-Zellen.
- Analyse der Morphologie einzelner Zellen.
- Verfolgung der Zellzyklusdynamik über 2,7 Tage.
Hauptergebnisse
- Erfassung eines Datensatzes mit 2,2 x 106 Messungen.
- Verfolgung von 10.584 Zellzyklusverläufen.
- Demonstration der Effektivität der linsenfreien Mikroskopie in Zellstudien.
- Einblicke in Zellproliferation und -verhalten in einer kontrollierten Umgebung.
Schlussfolgerungen
- Linsenfreie Videomikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug für die Zellbiologieforschung.
- Die Methodik ermöglicht eine umfangreiche Datenerfassung über Zelldynamiken.
- Diese Technik kann Studien in verschiedenen biologischen Anwendungen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Lens-free video microscopy enables high-throughput, quantitative monitoring of adherent cell cultures directly within incubators, supporting dynamic analysis of cell proliferation and morphology at single-cell resolution. This capability enhances predictive confidence in early discovery and assay development by generating large-scale, time-resolved datasets. The approach is strategically positioned to improve decision-making at key inflection points in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables kinetic analysis of thousands of individual cells to interrogate proliferation and cell cycle dynamics.
- Supports functional validation of biological hypotheses through quantitative, longitudinal single-cell tracking.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing heterogeneity in cell behavior and division patterns.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, label-free imaging for reproducible monitoring of cell cultures in screening workflows.
- Generates quantitative morphological and kinetic outputs suitable for assay optimization and validation.
- Enables scalable, automated data acquisition for high-content screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Delivers time-resolved datasets that can inform translational biomarker discovery when aligned with disease-relevant models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling robust, quantitative cell behavior analysis.
- Reduces biological uncertainty in preclinical model selection through detailed cell lineage and proliferation metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct, quantitative observation of cell cultures, supporting both hypothesis testing and assay readiness.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of cell proliferation and division kinetics.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers large-scale, time-lapse datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Offers potential for biomarker alignment when applied to disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, label-free imaging platform adaptable across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell monitoring workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, time-lapse imaging, and computational analysis.
- Depends on access to lens-free video microscopy hardware and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of acquisition parameters and data processing workflows.
- Adaptable to various adherent cell types but sensitive to initial cell concentration and culture conditions.
- Data analysis throughput is influenced by computational infrastructure and hardware performance.
