Name: Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Lernen Sie eine standardisierte Methode zur Untersuchung erworbener Resistenzen gegen gezielte Krebstherapien. Diese zeit- und kosteneffiziente Technik ermöglicht die in-vitro-Generierung resistenter Subklone und deren Charakterisierung durch Gen-Knock-down.

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Die Autoren möchten Dr. Veronica Zanoni danken für das Manuskript zu bearbeiten.

Hinweis: Dieses Protokoll wurde speziell für die Analyse der Mechanismen, die erworbenen Resistenz gegen Trastuzumab HER-positivem Magenkrebs Zell-Linien angepasst. Alle Laborgeräte benötigt werden in der Tabelle der Materialiengemeldet.
1. Generation der gezielten Therapie resistente Subclones
Hinweis: Dies ist der kritische und schwierige Schritt in das Protokoll zu standardisieren, da verschiedene Zelllinien unterschiedliche Empfindlichkeiten, die gezielte therapeutische Inhibitor unabhängig von ihrem Tumor Histotype oder Medikament Konzentration aufweisen können verwendet.
<ol><li>Kultur NCI-N87 Zelle Line-in RPMI Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum (10 %) und Glutamin (2 mM, 1 %), als eine Monolage bei 37 ° C und Samen es auf 25 cm2 Kulturflaschen.</li>
	<li>Fügen Sie zu dem Kulturmedium in jeder Flasche 10 µg/mL Trastuzumab als die Anfangsdosis. Setzen Sie die Zellen, die die Anfangsdosis aus, bis sie wachsen wieder aufzunehmen. Hinweis: Die Anfangsdosis von der gezielten Therapie Inhibitor sollte 10-Mal niedriger als seine Plasmakonzentration Höhepunkt sein. Plasma-Peak-Konzentration ist die höchste Stufe der Arzneimittelkonzentration im Patientenblut in der Regel durch mehrere Dosen der Standardtherapie erkannt. Dieser Wert kann aus Studien zur Pharmakokinetik abgerufen werden.</li>
	<li>Zellwachstum mit dem Trypan blau-Ausschluss-Verfahren zu überwachen; Wenn Zellwachstum (in der Regel nach einem Zeitraum von zwei bis drei Wochen) fortgesetzt wird, setzen Sie Zellen zu einer 10-divisibel höhere Dosis Konzentration von Trastuzumab.</li>
	<li>Setzen Sie Zellen zu einer allmählich zunehmenden Dosis von Trastuzumab (ab 100 µg/mL bis 400 µg/mL) bis Zellen halten trotz der Anwesenheit von einer hohen Wirkstoffkonzentration (mindestens 2,5 - 4-fach höher als der Plasma-Gipfel) (nach ca. 2 Wochen) wachsen.</li>
	<li>
Führen Sie einen klonogenen-Assay, um das Niveau des Widerstands zur gezielten Therapie bei jeder Änderung in der Konzentration von der Ziel-Therapie-Inhibitor in das Kulturmedium zu bewerten, und definieren Sie relative Resistenz IC50 Index (RR IC50) wie folgt.
	<ol>
<li>Samen Sie 500 Zellen in 24 Multi-gut Kultur Platten. Hinweis: 5 Brunnen müssen für jede Bedingung vorbereitet werden.</li>
		<li>Setzen Sie Zellen zu steigenden Ziel Therapie Inhibitor (Trastuzumab) Konzentrationen von 100 µg/mL bis zu 400 µg/mL.</li>
		<li>15 Tage inkubieren Sie Zellen in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C.</li>
		<li>Nach der Inkubation zu beheben und Proben wie folgt zu beflecken.<ol>
<li>Medium und spülen Sie Zellen mit 10 mL 1 X PBS zu entfernen. Entfernen Sie 1 X PBS zu, und fügen Sie 2-3 mL Fixierung-Lösung (acetic Acid: Methanol, 1:7 (Vol/Vol)). Entfernen Sie die Fixierung Lösung, und fügen Sie 0,5 % Kristallviolett-Lösung. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 h</li>
			<li>Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Absaugen mit einer Pipette vorsichtig und Tauchen Sie Platten in Leitungswasser abzuspülen Rückstände Kristallviolett-Lösung. Für bis zu 2 Tage an der Luft trocknen Sie bei Raumtemperatur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Anzahl der Kolonien von mehr als 50 Zellen mit einem inversen Mikroskop (4 X Vergrößerung). Hinweis: Zwei unabhängige Beobachter sind dafür erforderlich.</li>
		<li>Berechnen Sie RR IC50 als das Verhältnis zwischen dem IC50 Wert der Target-Therapie-resistente Subclone Zellen und den Wert der Original/naive Zellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Validierung Protokoll für den Kandidaten gezielte Therapie-Resistenz-Gen (R-gen)
Hinweis: Nach der Charakterisierung der Genexpression, Signaturen zugeordneten erworbene Resistenz Ziel Therapie und jedes Kandidaten-gen als Fahrer des Widerstands durch untersucht werden: (a) RT-PCR und (b) Western blot Analyse.
<ol><li>
Real-Time RT-PCR
	<ol>
<li>Gesamt-RNS von Zelllinien mit Säure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Mischung zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Reversen Transkription (RT) Reaktionen mit random Hexamer Primer durchzuführen und stellen die Thermocycler folgendermaßen: bei 25 ° C für 5 min, RT bei 46 ° C für 20 min und RT-Inaktivierung bei 95 ° C für 1 min grundieren.</li>
		<li>Einsatz 400 ng von Gesamt-RNS 20 µL zu reagieren. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch für Probe wie folgt: 7 µL RNase frei H2O 2 µL cDNA (10 ng/µL) 1 µL 20 x Leuchtstoff-Label gezielt Sonde und 10 µL 2 x Mix enthaltenden Puffer, dNTPs und DNA-Polymerase (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Jede gut Platte 20 µL des Reaktionsgemisches hinzu und führen Sie das folgende Programm: holding Phase bei 50 ° C für 2 min bei 95 ° C für 10 min (1 Zyklus); dann 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s und bei 60 ° C für 1 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Western-blot
	<ol>
<li>Zellsuspensionen zu erholen, indem Sie 2 mL 0,05 % Trypsin/EDTA-Lösung hinzufügen und 2-3 min. für Trypsin zu arbeiten.</li>
		<li>Fügen Sie 2 Bände der mittlere mit 10 % fötalen Rinderserum zu neutralisieren (z.B.2 mL Medium für jeweils 1 mL Trypsin) Trypsin und Zentrifugieren bei 1.200 x g für 5 min. verwerfen überstand und waschen Zellen mit kalten 1 X PBS hinzu.</li>
		<li>1.200 x g für 5 min Zentrifugieren und überstand verwerfen. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit Lyse Puffer und eine Wippe bei 4 ° C für 30 min inkubieren.<ol>
<li>Die Höhe der Lyse Puffer hängt von der Anzahl der Zellen (z.B. 100 µL 1 x 106 Zellen); Achten Sie auf frische Lyse Puffer jedesmal vorzubereiten. Für 1 mL Lyse Puffer Vorbereitung (Urlaub auf dem Eis): verwenden Sie 975 µL M-pro Säugetier-lysate Puffer, 15 µL Protease und Phosphatase-Inhibitoren und 10 µL 100 µM PMSF Inhibitoren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wiederherstellen Sie das überstehende Protein durch Zelle lysate Zentrifugation bei 13.000 x g bei 4 ° C für 15 Minuten.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mithilfe eines BCA Protein Assays.</li>
		<li>Fügen Sie 4 x LaemmLi Probenpuffer Proteinproben (mindestens 20-30 µg Protein) und Hitze bei 100 ° C für 3 Minuten.</li>
		<li>Verwenden Sie vorgefertigte 4-20 % Gele und laden Sie 20-30 µg Proteinlösung LaemmLi und 5-10 µL Protein standard pro Probe.</li>
		<li>Den Western-Blot-Ring mit TRIS/GLICYNE /SDS 1 X Puffer füllen und Gel bei 110 V 30-60 min. ausgeführt werden (wenn die Zeit steht, Check, die der Farbstoff das Ende des Gels still, sonst laufen für ein paar weitere Minuten erreicht hat)</li>
		<li>Electroblot Protein in einer PVDF-Membran übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem semi-dry-System.</li>
		<li>Blockieren Sie die Membran durch Einweichen in der entsprechenden Proteinlösung (Milch/BSA 5 %) auf den Shaker für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Machen Sie eine 1: 400-Lösung mit primären Antikörper Anti-IQGAP1 in einer 5 %-Milch-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Legen Sie die Membran in primären Antikörper-Lösung auf einem Shaker in einem kalten Raum über Nacht.</li>
		<li>Am nächsten Tag die Antikörperlösung zu verwerfen und in T-TBS 1 X Lösung einweichen (1 x T-TBS: 1 X Kochsalzlösung Tris-Puffer hinzugefügt durch Tween20 0,1 %) auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 7 Minuten.</li>
		<li>Verwerfen Sie T-TBS 1 x Lösung und ersetzen. Wiederholen Sie 3 Mal.</li>
		<li>Machen Sie eine 1: 10.000 Sekundärantikörper Maus Lösung durch Zugabe von Antikörper für standard Western blot Erkennung (siehe Tabelle der Materialien) und die Membran auf einen Shaker; lassen Sie bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
		<li>Die Antikörperlösung zu verwerfen und in T-TBS 1 X Lösung auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 7 min einweichen.</li>
		<li>Verwerfen Sie T-TBS 1 x Lösung und ersetzen. Wiederholen Sie 3 Mal.</li>
		<li>Membran für 5 min in eine Chemolumineszenz Lösung einweichen, und die Membran auf einen Chemilumineszenz-Imager Bild.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Wiederherstellung der Target-Therapie Inhibitor Empfindlichkeit von Kandidaten Knock-down-R-gen
<ol><li>
Handy-Vorbereitung
	<ol>
<li>Bereiten Sie einzelne Zellsuspension durch Trypsinization. Führen Sie Transfektion auf den Tag, an dem die Zellen überzogen sind.<ol>
<li>NCI-N87 waschen mit PBS Zellen und Inkubation bei 37 ° C mit 0,05 % Trypsin/EDTA Lösung für ca. 5-10 min. Add 2 Volumen von RPMI Medium mit 10 % fetalen Rinderserum, Trypsin (z.B.2 mL Medium für jeweils 1 mL Trypsin) zu neutralisieren.</li>
			<li>Anzahl Zellen mit einer Hemocytometer verwenden Trypan blau zu färben. 2.5 x 105 Samenzellen (60 % Zusammenfluss) auf ein T25 cm2 Fläschchen für jede Bedingung. Hinweis: Die entsprechende Anzahl von Zellen für die Aussaat richtet sich nach der Verdopplungszeit der Zelllinie und die Dauer des Experiments. Ziel ist es, das Zielgen Knock-down-für die gesamte Dauer des Experiments zu erreichen. Neun T25 cm2 Flaschen sind ideal für Transfektion Bedingungen und der klonogenen-Assay (3 Flaschen für Steuerelemente, 3 Flaschen für negative Transfektion Steuerelemente, 3 Flaschen für gen-Ziel Transfektion).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Umgekehrte Transfektion
	<ol>
<li>Gen-Ziel vorzubereiten und negative Kontrolle Transfektion Mix für jede T25 cm2 Kolben wie folgt.<ol>
<li>Verdünnen Sie 12,5 µL der einzelnen Gene-targeting SiRNA Oligonukleotide oder Negativkontrolle SiRNA Oligonukleotide in minimalen wesentliche Transfektion Medium (Verhältnis 01:55; siehe Tabelle of Materials).</li>
			<li>Fügen Sie eine kationische Liposomen Transfection Reagens (Verhältnis 1:1 mit gen-targeting SiRNA Oligonukleotide; siehe Tabelle of Materials). Bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren. Hinweis: Das Gesamtvolumen der Transfektion Mischung ist 700 µL.</li>
			<li>Jedem T25 cm2 Kolben 700 µL der Transfektion Mischung hinzufügen. 1-3 Tage inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Knock-down gen durch RT-PCR und Western-Blot Analyse zu überprüfen. Überprüfen Sie die Auswirkungen des vermeintlichen R-gen Knock-Down auf die Wiederherstellung der Sensibilität für das gezielte therapeutische Mittel durch Kolonie-Bildung-Experimente (wiederhole Schritt 1.5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gerber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapies%3A+a+new+generation+of+cancer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Fam+Physician%22%5BJournal%5D)">Targeted therapies: a new generation of cancer treatments.</a> Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).</li>
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<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from:
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<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from:
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<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029">http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029</a> (2017).</li>
<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from:
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<li>Shimoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+trastuzumab+and+lapatinib+inefficiency+in+gastric+cancer%3A+Future+steps+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review).</a> Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).</li>
<li>Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+and+therapeutics+of+HER2-positive+gastric+cancer-from+trastuzumab+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastrointest+Oncol%22%5BJournal%5D)">The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond.</a> J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+landscape+and+genetic+heterogeneity+in+gastric+adenocarcinoma+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing.</a> Nat Commun. 5, 5477(2014).</li>
<li>Oshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+sensitivities+of+two+novel+trastuzumab-resistant+HER2+gene-amplified+gastric+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).</li>
<li>Pignatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exposure+to+%28R%29-bicalutamide+generates+a+LNCaP+subclone+with+alteration+of+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome.</a> Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während personalisiert und gezielte Therapien haben wachsende Begeisterung ausgelöst, diese so genannten "intelligenten" Therapien stellen die gleiche Hürde als herkömmliche Chemotherapeutika, d. h., die schnelle und unvorhersehbare Übernahme von Resistenzen. Um die Ergebnisse der gezielten Therapie zu verbessern, müssen Medikamentenresistenz Probleme durch ein besseres Verständnis der Mechanismen gelöst werden, die sie verursachen. Hier haben wir eine leicht zugänglich in-vitro- Methodik zur Untersuchu...

Im Anschluss an die entscheidenden Entdeckungen in der molekularen und zellulären Biologie, haben eine Reihe von neuartigen synthetisierten krebsbekämpfende Moleküle entwickelt, um selektiv onkogenen Signalwege in einer Vielzahl von Tumorarten abzielen. Vor allem zwei Kategorien von zielgerichteten Therapeutika mit einzigartigen Eigenschaften in der Onkologie, nämlich synthetische chemische Verbindungen und rekombinanter monoklonaler Antikörper, sind dafür bekannt, klinische Erfolge und dramatisch verändert Krebsbehandlung in erreicht haben den letzten Jahrzehnten1,2,3.
Dennoch, trotz ihrer beeindruckenden ersten Ansprechen auf die Behandlung haben die meisten Krebspatienten Resistenzen auf alle zielgerichteten Therapeutika, monoklonale Antikörper und Kinase-Inhibitoren entwickelt. Infolgedessen ist Resistenzen, die große Hürde für die klassische Anti-Krebs-Medikamente4, nach wie vor eine große Herausforderung für neue zielgerichtete Therapien5,6.
Widerstand gegen gezielte Therapie möglicherweise intrinsischen (d.h.primäre) oder erworbene (d.h., sekundäre). Intrinsische Resistenz beschreibt de Novo mangelnder Ansprechen auf die Therapie, während sekundäre Resistenz nach einer Antwort auf Droge Behandlung7auftritt. Letzteres ist verursacht durch Ausbrüche der kleinen Kohorten von Tumorzellen innerhalb der Großteil des ursprünglichen Tumors oder eingebettet in den distalen kryptische anatomische Nischen, ausstellen von bis zu 90 % Widerstand gegen eine oder mehrere gezielte Therapeutika. Molekulare Mechanismen einer Resistenzentwicklung, gezielte Therapie vor allem ergeben sich aus Ziel-Gen-Mutationen und redundante Aktivierung von anderen pro-Survival Signalwege, deren Verständnis noch lange nicht komplett8 ist.
In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, einen Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Ansatz zur Untersuchung der in-vitro- Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte Therapeutika, ausgehend von der Generation von Medikamenten-resistenten zellulären Subclones zur Beschreibung der zum Schweigen zu bringen Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit auf den Inhibitor, ein entscheidendes Instrument für testen und validieren der Arbeitshypothesen verwendet. Insbesondere war unser Ansatz verwendet, zu untersuchen, bei Magenkrebs, die Resistenzmechanismen zu Trastuzumab (z.B.Herceptin), ein humanisierter monoklonaler Antikörper gezielt die extrazelluläre Domäne des HER2-Protein-9. Trastuzumab + Chemotherapie ist weithin anerkannt als der standard Erstlinien Behandlung von HER2-positivem metastasierendem Brustkrebs. Dank den letzten präklinischen Studien, die zeigen, dass Anti-HER2 Therapien haben signifikante Aktivität in beide in Vitro und in Vivo HER2-positivem Magenkrebs Modelle10,11, molekulare Medikamente gegen HER2 gewesen umfassend in klinischen Studien untersucht, sind von denen einige noch im Gange, bei Patienten mit Gastroesophageal Krebs12,13,14,15.
Diese Studien haben betont, dass die steigende Zahl von Patienten, bei denen Widerstandsfähigkeit gegen Trastuzumab16, ähnlich wie was für andere gezielte therapeutische Inhibitoren beobachtet wird. Insbesondere die Rücklaufquote von Trastuzumab betrug 47 %, und die mediane Gesamtüberleben für Trastuzumab + Chemotherapie-Patienten betrug nur 2,7 Monate länger als bei Patienten unter Chemotherapie allein17. Dies schlug während primäre Trastuzumab-Resistenz vorherrscht, sekundäre Trastuzumab Widerstand unvermeidlich ist. Aus diesem Grund ist die dringende Notwendigkeit zur Klärung der Mechanismen, die HER2-gezielte Therapieresistenz bei Magenkrebs, was angesichts die Intra-Tumor genetische Heterogenität dieser Neoplasie18noch problematischer ist.
Darüber hinaus haben die Mechanismen der Resistenz gegen Trastuzumab bei Magenkrebs schwierig zu erklären, teilweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von zuverlässigen präklinischen Modellen Vertreter dieser Erkrankung bewährt. Oshima Et Al. berichtet eine in Vivo Auswahlmethode Trastuzumab resistenten Magen-Krebs-Zell-Linien, bestehend aus einer wiederholten Kultur eine kleine verbleibende peritonealen Metastasen nach einer Behandlung mit Trastuzumab19. Allerdings trugen die Notwendigkeit eines Gehäuses, bestimmten tierischen Umgang mit Know-how und der Genehmigung der Tier-Ethik-Kommission, so dass es eine Methode zeitaufwändig und Kosten. Der Ansatz, den wir in dieser Arbeit zu beschreiben ist einfach und vielseitig einsetzbar und kann leicht erweitert werden, um die Resistenzmechanismen gegenüber anderen therapeutischen Medikamenten in verschiedenen Tumor Histotypes20zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Trizol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol-Reagenz ist ein Reagenz zur Isolierung hochwertiger Gesamt-RNA oder zur gleichzeitigen Isolierung von RNA, DNA und Protein aus einer Vielzahl von biologischen Proben</td></tr><tr><td>ISCRIPT CDNA-SYNTHESEKIT</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>Das iScript cDNA-Synthesekit ist ein empfindliches und einfach zu bedienendes Erststrang-cDNA-Synthesekit für die Genexpressionsanalyse mittels Echtzeit-qPCR.</td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressions-Assay</td><td>Die</td><td></td><td>TaqMan Genexpressions-Assays von Life Technologies 4331182 Applied Biosystems bestehen aus einem Paar unmarkierter PCR-Primer und einer TaqMan-Sonde mit einer Applied Biosystems FAM- oder VIC-Farbstoffmarkierung am 5'-Ende und einem Minor-Groove-Binder (MGB) und einem nicht-fluoreszierenden Quencher (NFQ) am 3'-Ende.</td></tr><tr><td>M-PER Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Das Thermo Scientific M-PER Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen wurde entwickelt, um eine hocheffiziente Extraktion von vollständig löslichen Proteinen aus kultivierten Säugetierzellen zu ermöglichen.</td></tr><tr><td>Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>Thermo Scientific Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100X) bietet den Komfort einer einzigen Lösung mit vollständigem Schutz von Proteinproben für Zell- und Gewebelysate.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Das Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit ist ein zweikomponentiges, hochpräzises, waschmittelkompatibles Assay-Reagenzset zur Messung der Gesamtproteinkonzentration (A562 nm) im Vergleich zu einem Proteinstandard.</td></tr><tr><td>4x Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>Verwenden Sie 4x Laemmli Probenpuffer zur Vorbereitung von Proben für SDB PAGE. Zur Reduktion der Proben wird dem Puffer vor dem Mischen mit der Probe ein Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol zugesetzt.</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gele haben eine neuartige Formulierung und können sowohl für standardmäßige denaturierende Proteintrennungen als auch für die native Elektrophorese verwendet werden.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC Blotting-Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained Standards sind in den Formaten Dual Color, All Blue, Kaleidoscope und Dual Xtra erhältlich. Alle vier haben die gleichen Gelmigrationsmuster mit 3 hochintensiven Referenzbanden (25, 50 und 75 kD).</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/Glycin/SDS ist ein vorgemischter Laufpuffer zur Trennung von Proteinproben mittels SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>1704156</td><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs für den schnellen und effizienten Transfer von Proteinen aus Mini-Gelen mit dem Trans-Blot Turbo Transfer System. Jede vakuumversiegelte, gebrauchsfertige Transferpackung enthält zwei puffergesättigte Ionen-Reservoir-Stacks und eine vorbenetzte PVDF-Membran.</td></tr><tr><td>Precision Protein StrepTactin-HRP Konjugat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610381</td><td>StrepTactin-Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugat für den chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Nachweis von Precision Plus Protein Ungefärbten Proteinstandards oder Precision Plus Protein WesternC Protein Standards auf Western Blots.</td></tr><tr><td>Immun-Star WesternC-Lösung</td><td>Bio-Rad</td><td>5572</td><td>Immun-Star WesternC-Lösung, ein Verfahren zum Nachweis von Proteinen, weist Proteinmengen im mittleren Femtogrammbereich nach.</td></tr><tr><td>Universelle Negativkontrolle</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td>Negativkontrolle siRNA weist keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit Gensequenzen von Maus, Ratte oder Mensch auf. Die Kontrolle wurde auch in zellbasierten Screens getestet und hat nachweislich keinen signifikanten Einfluss auf die Zellproliferation, Lebensfähigkeit oder Morphologie.</td></tr><tr><td>opti-MEM Glutamax Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM Medium ist ein verbessertes Minimal Essential Medium (MEM), das eine Reduzierung der Supplementierung mit fötalem Rinderserum um mindestens 50% ermöglicht, ohne dass sich die Wachstumsrate oder die Morphologie ändert.</td></tr><tr><td>Schalldämpfer Select Vorgefertigt & Validierte siRNA</td><td>Ambion</td><td>4390824</td><td>RNA-Interferenz (RNAi) ist der beste Weg, um die Genexpression effektiv zu unterbinden und die Proteinfunktion in einer Vielzahl von Zelltypen zu untersuchen.</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagenz bietet eine fortschrittliche, effiziente Lösung für die siRNA-Verabreichung. Kein anderes siRNA-spezifisches Transfektionsreagenz ermöglicht eine so einfache und effiziente siRNA-Verabreichung in einer Vielzahl von Zelllinien, einschließlich gängiger Zelltypen, Stammzellen und Primärzellen sowie traditionell schwer zu transfizierender Zelltypen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>Arbeitskonzentration: 1:400 in 5% Milchlösung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG-HRP: sc-2005</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>Arbeitskonzentration: 1:10000 in 5% Milchlösung</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td><td>dies ist ein Inhibitor von Serinproteasen und Acetylcholinesterase</td></tr><tr><td>Thermocycler für RT-PCR</td><td>MJ Research</td><td>MJ Research PTC-200 Thermocycler</td><td>ermöglicht Temperaturhomogenität und eine Rampengeschwindigkeit von bis zu 3 Grad; C/Sek. Das Protokoll kann auch mit anderen Thermalcyclern durchgeführt werden</td></tr><tr><td>Echtzeit-RT-PCR-Instrument</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 RT-PCR-System</td><td>Hierbei handelt es sich um eine Fünf-Farben-Plattform, die fluoreszenzbasierte Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Reagenzien verwendet, um eine relative Quantifizierung unter Verwendung eines vergleichenden CT-Assay-Typs zu ermöglichen. Das Protokoll kann auch mit anderen Thermalcyclern durchgeführt werden</td></tr><tr><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td><td>Es bietet eine genaue und schnelle Säurenukleidmessung mit geringem Probenvolumen</td></tr><tr><td>Blotting-System</td><td>Bio-Rad</td><td>Trans-Blot Turbo-System</td><td>Es führt einen semit-trockenen Transfer in wenigen Minuten durch</td></tr><tr><td>Bildaufnahmesystem und Geldokumentation</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemidoc-Bild System</td><td>: Es ist einfach zu bedienen für die Chemilumineszenz-Detektion</td></tr></tbody></table>

auf der suche nach treiber wege erworbene resistenz auf die gezielte therapie: resistente subclone generation und sensibilität wiederherzustellen, indem sie gene knock-down-

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

Die letzten zwei Jahrzehnten haben eine Verlagerung von Zytostatika, zielgerichtete Therapie in der medizinischen Onkologie gesehen. Obwohl gezielt Therapeutika beeindruckender klinische Wirksamkeit und minimiert Nebenwirkungen als herkömmliche Behandlungen gezeigt haben, geworden Resistenzen die wichtigste Einschränkung auf ihre Vorteile. Mehreren präklinischen/in vitro/in vivo Modellen der erworbene Resistenz gegen gezielte Mittel in der klinischen Praxis wurden hauptsächlich mit Hilfe von zwei Strategien entwickelt: i) Genmanipulation für die Modellierung von Genotypen der erworbenen Resistenz und (Ii) in-vitro- / in-vivo beständig Modellauswahl. In der vorliegenden Arbeit schlagen wir einen einheitlichen Rahmen für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen verantwortlich für erworbene Resistenz zu zielgerichteten Therapeutika, ausgehend von der Generation von Medikamenten-resistenten zellulären Subclones zur Beschreibung der Verfahren zur Wiederherstellung der Empfindlichkeit der Inhibitors-Stummschaltung. Diesem einfache Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Ansatz ist vielseitig einsetzbar und kann leicht erweitert werden, um die Resistenzmechanismen gegenüber anderen gezielten therapeutischen Medikamenten in verschiedenen Tumor Histotypes zu untersuchen.

Abbildung 1 steckt den Rahmen für die Versuchsdurchführung. Drei Magenkrebs-Zelllinien mit dem Ausdruck eines hohen Maß an HER2 und anfällig für Trastuzumab (IC50 &lt; Plasma Spitzenpegel von Drogen, Figur 2A, linke Diagramm) im Kulturmedium, enthält das gezielte therapeutische Mittel gewachsen waren. Eine Dosis 10-Mal niedriger als der Peak-Plasma-Konzentration von Trastuzumab (10 µg/mL) wurde als die Anfangsdosis und...

Dies ist eine Zeit und Kosten wirtschaftlicheren in-vitro- Protokoll untersucht die Mechanismen der erworbenen Resistenz gegen gezielte therapeutische Wirkstoffe, die eine höchst medizinischer Bedarf im Krebs-Management.

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Das übergeordnete Ziel dieser präklinischen Plattform ist es, ein Standardverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der Mechanismen bereitzustellen, die die erworbene Resistenz gegen zielgerichtete Therapien antreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, den Genome-Drive in der Onkologie zu implementieren und insbesondere Schlüsselfragen zur Tumorheterogenität und den vielfältigen Mechanismen, die für die erworbene Resistenz gegen eine zielgerichtete Therapie verantwortlich sind, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der zeit- und kosteneffiziente Ansatz, der es ermöglicht, in vitro Resistenzmechanismen für eine zielgerichtete Therapie zu untersuchen.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Krebstherapie, da die Lungenresistenz für neue zielgerichtete Therapien immer noch eine Herausforderung darstellt. Diese Methode kann Aufschluss über den Mechanismus geben, der an der gezielten Therapieresistenz beteiligt ist, aber auch zur Untersuchung der Wirksamkeit konventioneller Chemotherapeutika verwendet werden. Im Allgemeinen schwanken Anwender, die diese Methode anwenden, mit einer Generation arzneimittelresistenter Subklone, dem Schritt, der

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Drug Resistenz gegen gezielte Therapeutika ist weit verbreitet und die Notwendigkeit, die Mechanismen der Resistenz zu identifizieren - vor oder nach dem klinischen Einsetzen - ist entscheidend für die Führung alternative klinische Management-Strategien. Hier präsentieren wir ein Protokoll zu koppeln, Ableitung von Medikamenten-resistenten Linien in vitro mit Sequenzierung zur Entdeckung dieser Mechanismen zu beschleunigen.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

Aufbau einer stabilen Zelllinie überexprimierenden gen des Interesses Genfunktion zu studieren kann durch stabile Transfektion-Kommissionierung einzelnen Klone nach transfecting sie über retroviralen Infektion durchgeführt werden. Hier zeigen wir, dass HT29-DR3 Zelllinien erzeugt auf diese Weise die Mechanismen aufzuklären, welche, die Tod Rezeptor 3 (DR3) zum Mitosehemmstoffen-induzierten Apoptose beiträgt.

Gründung von Zelllinien überexprimiert DR3 um die Apoptotic Antwort auf Anti-mitotische Therapeutika zu bewerten

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um die überexprimierten Treibergene zu entdecken, die die etablierten krebsstammähnlichen Zellen, die aus kolorektalen HT29-Zellen gewonnen wurden, aufrecht erhalten. RNAseq mit verfügbarer Bioinformatik wurde durchgeführt, um Genexpressionsnetzwerke zu untersuchen und zu untersuchen, um einen potenziellen Mechanismus zu erhellen, der am Überleben von gezielten Tumorzellen beteiligt ist.

Entdeckung von Treiber-Genen in kolorektalen HT29-abgeleiteten Krebs-Stamm-ähnlichen Tumorsphären

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Bewertung von Arzneimittelsensitivitäten gegenüber zielgerichteten Signalinhibitoren in NSCLC-patientenabgeleiteten Organoidmodellen.

Profiling der Sensitivität gegenüber zielgerichteten Therapien in EGFR-mutierten NSCLC-patientenabgeleiteten Organoiden

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Wir haben einen speziesübergreifenden vergleichenden Onkogenomik-Ansatz entwickelt, der genomische Analysen und funktionelle genomische Screenings verwendet, um therapeutische Ziele in Tumoren, die in gentechnisch veränderten Mausmodellen auftreten, und den entsprechenden menschlichen Tumortyp zu identifizieren und zu vergleichen.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung chemoresistenter Zellen mittels eines Dosis-Eskalationsansatzes, gefolgt von einem CRISPR/Cas9-basierten Screening mit einer fokussierten sgRNA-Bibliothek, die epigenetische Modifikatoren anvisiert, um Regulatoren erworbener Chemoresistenz zu identifizieren. Das Protokoll bietet zudem mehrere Optimierungspunkte, die auf chemoresistente Zellmodelle zugeschnitten sind, und bietet so einen robusten Rahmen für Forscher, die Resistenzmechanismen...

Epigenomweite CRISPR-Cas9-basierte Knockout-Screens an chemoresistenten Zellen

Lernen Sie eine standardisierte Methode zur Untersuchung erworbener Resistenzen gegen gezielte Krebstherapien. Diese zeit- und kosteneffiziente Technik ermöglicht die in-vitro-Generierung resistenter Subklone und deren Charakterisierung durch Gen-Knock-down.

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down- (Video) | JoVE Journal

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

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