Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

Das übergeordnete Ziel dieser präklinischen Plattform ist es, ein Standardverfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der Mechanismen bereitzustellen, die die erworbene Resistenz gegen zielgerichtete Therapien antreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, den Genome-Drive in der Onkologie zu implementieren und insbesondere Schlüsselfragen zur Tumorheterogenität und den vielfältigen Mechanismen, die für die erworbene Resistenz gegen eine zielgerichtete Therapie verantwortlich sind, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der zeit- und kosteneffiziente Ansatz, der es ermöglicht, in vitro Resistenzmechanismen für eine zielgerichtete Therapie zu untersuchen.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Krebstherapie, da die Lungenresistenz für neue zielgerichtete Therapien immer noch eine Herausforderung darstellt. Diese Methode kann Aufschluss über den Mechanismus geben, der an der gezielten Therapieresistenz beteiligt ist, aber auch zur Untersuchung der Wirksamkeit konventioneller Chemotherapeutika verwendet werden. Im Allgemeinen schwanken Anwender, die diese Methode anwenden, mit einer Generation arzneimittelresistenter Subklone, dem Schritt, der am schwierigsten zu standardisieren ist.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir den erworbenen resistenten Mechanismus gegen Trastuzumab in HER-positiven Magenkrebszelllinien charakterisierten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da für die Generierung und Validierung von in-vitro-resistenten Modellen mehrere Techniken erforderlich sind, einschließlich der Wiederherstellung der Empfindlichkeit durch Gen-Knock-down. Um dieses Verfahren zu beginnen, säen Sie NCI N87-Zellen in 25 Quadratzentimeter große Kulturflaschen.

10 Mikrogramm pro Milliliter Trastuzumab werden dem Nährmedium in jedem Kolben zugesetzt. Setzen Sie die Zellen dieser Anfangsdosis aus, bis sie wieder wachsen. Nachdem das Zellwachstum in etwa zwei Wochen wieder aufgenommen wurde, setzen Sie die Zellen einer Konzentrationsdosis von einhundert Mikrogramm pro Milliliter Trastuzumab aus.

Erhöhen Sie die Trastuzumab-Konzentration weiter und warten Sie, bis die Zellen das Wachstum wieder aufnehmen, bevor Sie jeder Exposition folgen, bis eine Konzentration von 400 Mikrogramm pro Milliliter erreicht ist. Eine Zelllinie kann eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Arzneimitteln aufweisen. Eine Lösung für dieses Problem besteht darin, die Zellen allmählich steigenden Medikamentendosen auszusetzen, beginnend mit einer Dosis, die etwa das Zehnfache der maximalen Plasmakonzentration pro Stunde beträgt, bis die Zellen weiter wachsen.

Anschließend werden die Zellen in 24 Multi-Well-Kulturplatten gesät. Setzen Sie die ausgesäten Zellen einer Erhöhung der Inhibitorkonzentrationen der Zieltherapie von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf 400 Mikrogramm pro Milliliter aus. Inkubieren Sie in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 15 Tage.

Entfernen Sie danach das Medium und spülen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS-1X. Entfernen Sie den PBS-1X und fügen Sie zwischen zwei und drei Milliliter Fixierlösung hinzu. Entfernen Sie nach 20 Minuten die Fixierlösung und geben Sie zwei Milliliter 0,5%ige Kristallviolettlösung in jede Vertiefung.

Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die kristallviolette Lösung vorsichtig zu aspirieren. Tauchen Sie die Platten in Leitungswasser, um alle verbleibenden Rückstände abzuspülen.

Bis zu zwei Tage bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Verwenden Sie anschließend ein inverses Mikroskop mit 4-facher Vergrößerung, um Kolonien mit mehr als 50 Zellen zu zählen. Berechnen Sie das Verhältnis des relativen Widerstands IC50, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie zunächst eine einzellige Suspension durch Trypsinisierung vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einer Trypanblau-Färbung. Säen Sie dann 2,5 mal 10 bis fünf Zellen für jede Bedingung auf einen T-25-Kolben.

Als nächstes verdünnen Sie 12,5 Mikroliter jedes auf das Gen abzielenden siRNA-Oligonukleotids oder des Negativkontroll-siRNA-Oligonukleotids in minimalem essentiellem Transfektionsmedium. Fügen Sie ein kationisches Liposomen-Transfektionsreagenz im Verhältnis 1:1 mit den Oligonukleotiden hinzu. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Danach werden 700 Mikroliter der Transfektionsmischung in jeden T-25-Kolben gegeben. Inkubieren Sie ein bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie RT-PCR und Western-Blot-Analyse, um den Gen-Knock-down zu verifizieren.

Anschließend werden die Zellen in 24 Multi-Well-Kulturplatten gesät. Setzen Sie die Zellen steigenden Konzentrationen des Zieltherapie-Inhibitors von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf 400 Mikrogramm pro Milliliter aus. Für die Wirksamkeit des Gen-Knock-downs müssen siRNA-Oligonukleotide spezifisch für die Verringerung der Zielexpression sein.

Zu diesem Zweck sind die entwickelten Werkzeuge und die Messung der siRNA das gleiche Zielgen. Inkubieren Sie in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 15 Tage. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS-1X.

Nachdem Sie das PBS entfernt haben, fügen Sie zwei bis drei Milliliter Fixierlösung hinzu. Entfernen Sie dann die Fixierlösung und fügen Sie 0,5%ige Kristallviolettlösung hinzu. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Aspirieren Sie die kristallviolette Lösung vorsichtig mit einer Pipette. Tauchen Sie anschließend die Teller in Leitungswasser. Bis zu zwei Tage bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.

Verwenden Sie danach ein inverses Mikroskop mit 4-facher Vergrößerung, um die Kolonien mit mehr als 50 Zellen zu zählen. In dieser Studie wurden drei Magenkrebszelllinien, die einen hohen HER2-Spiegel exprimieren und empfindlich auf Trastuzumab reagieren, in einem Kulturmedium gezüchtet, das die zielgerichteten Therapeutika enthält. Daraus werden drei Subklone gewonnen, die sich durch einen stabilen resistenten Phänotyp auszeichnen.

Von den Subklone gilt HR NCI N87 mit einem relativen Widerstand IC50 von 28,57 als der widerstandsfähigste. Die Analyse der Protein- und Genexpression stützt die Hypothese, dass das Gen IQGAP1 eine zentrale Rolle im Resistenzphänotyp der HR NCI N87-Sublinie spielt. Wie hier gezeigt, ist der IQGAP1-Proteinspiegel in den resistenten Subkllonen fünfmal so hoch wie in den Elternzellen.

Und die IQGAP1-Genexpression ist in der HR NCI N87-Sublinie 2,5-fach höher als im ursprünglichen Subklon. Anschließend wird ein IQGAP1-Gen-Silencing durchgeführt, um seine Rolle bei der Entwicklung des Trastuzumab-Resistenz-Phänotyps zu bewerten. Ein klonogener Assay bestätigt die Hypothese der Bedeutung von IQGAP.

Wie hier zu sehen, stellt das Gen-Silencing die Empfindlichkeit der Zelle gegenüber Trastuzumab wieder her und senkt den IC50-Wert auf sieben Mikrogramm pro Milliliter. Was ich von diesem Verfahren halte, ist wichtig, wenn man bedenkt, dass es im Allgemeinen nicht einfach ist, arzneimittelresistente Zellsubklone zu erhalten. Und dass diese Methode ein potenzielles Ausfallrisiko birgt.

Durch dieses Verfahren ist es möglich, mehrere Zellen von Klonen zu erhalten, die durch unterschiedliche Mechanismen gekennzeichnet sind, die die erworbene Resistenz gegen Zieltherapien fördern. Die Entwicklung eines Standardverfahrens für die in-vitro-Modellierung der Resistenz von Zieltherapien sollte es einem onkologischen Forscher ermöglichen, neuartige medikamentengestützte Zielmoleküle zur Überwindung der Arzneimittelresistenz zu untersuchen, die die größte Kritik an den Therapien der neuesten Generation darstellt.