Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

Das übergeordnete Ziel dieses einfachen fluoreszenzbasierten Reporterassays ist es, nach zellulären Komponenten zu suchen, die für den ordnungsgemäßen Transport der Ricintoxin A- oder RTA-Kette im Hefemodellorganismus erforderlich sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zum interzellulären Transport von Ribosomen bei der Aktivierung eines B-Toxins zu beantworten. In unserem Fall gelangt die zytotoxische Untereinheit des einfachen Toxins Rizin von der Plasmamembran in das Zytosom.

Der Hauptvorteil dieses Assays ist die Möglichkeit, die Wirkung eines einzelnen Hefegens auf den RTA-Transport schnell und kostengünstig zu analysieren. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Zelltransformation, wie im Textprotokoll beschrieben. Beimpfen Sie fünf Milliliter LB-Kanamycin-Medium mit Zellen, die RTA-Expressionsplasmid oder den leeren Vektor enthalten.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 220 U/min für 24 Stunden. Ergänzen Sie einen Liter LB-Kanamycin-Medium mit fünf Millilitern Vorkultur. Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 220 U/min, bis die Zellen eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,8 bis 1,0 erreicht haben.

Reduzieren Sie danach die Kulturtemperatur auf 28 Grad Celsius. Induzieren Sie die RTA-Expression der E.Coli durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von einem Millimolar. Nach 3,5 Stunden bei 28 Grad Celsius und 220 U/min werden die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten geerntet.

Anschließend das Pellet mit fünf Millilitern Bindepuffer waschen und bei 10.000 g und vier Grad Celsius 10 Minuten lang pelletieren. Nachdem Sie den Waschgang einmal wiederholt haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in fünf Millilitern Bindepuffer. Beschallen Sie die Zellen auf Eis mit fünf Zyklen eines 15-Sekunden-Impulses und einer 30-Sekunden-Pause.

Nach dem Zentrifugieren des Zelllicates bei 21.000 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten wird der Überstand mit einem sterilen Spritzenfiltersystem filtriert. Verwenden Sie ein automatisiertes Aufreinigungssystem, das mit einer Fünf-Milliliter-Affinitätssäule auf Nickelbasis ausgestattet ist, um die HIS-markierte RTA-Fraktion aus dem steril filtrierten E.Coli-Überstand zu reinigen. Verwenden Sie im Allgemeinen eine Anspielungsgeschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute und kühlen Sie das gesamte Reinigungssystem, um eine ineffiziente Toxinbindung und einen Verlust der Toxinaktivität zu verhindern.

Äquilibrieren Sie die Affinitätsspalte kurzzeitig mit 20 Millilitern Bindungspuffer, um den Speicherpuffer zu entfernen. Anschließend wird der sterile, filtrierte Überstand mit einer Spritze auf die Affinitätssäule aufgetragen. Waschen Sie die Säule mit 25 bis 35 Millilitern Bindungspuffer, um die ungebundenen Proteine aus der Säule zu entfernen.

Führen Sie den Waschschritt so lange durch, bis der UV-Absorptionsgrad bei 280 Nanometern nahe dem ursprünglichen UV-Wert liegt. Anschließend wird die gebundene RTA-Fraktion mit 20 bis 35 Millilitern Elutionspuffer eluiert und die Probe auf Eis gelegt. Es ist wichtig, die RTA-Fraktionsprobenahme kurz nach dem Anstieg des UV-Werts um 280 zu starten und die RTA-Fraktionsprobenahme zu stoppen, wenn sie wieder die ursprüngliche Basislinie erreicht.

Um die entsalzte RTA-Fraktion zu entsalzen, ersetzen Sie die Affinitätssäule des Reinigungssystems durch die Entsalzungssäule und äquilibrieren Sie die Säule mit 20 Millilitern 0,8 molar Sorbit. Tragen Sie die ausgeweichte RTA-Fraktion über eine Spritze auf die Säule auf. Waschen Sie die Säule mit 100 Millilitern 0,8 molaren Sorbit und verdünnen Sie die entsalzte RTA-Fraktion in einem 15-Milliliter-Röhrchen, sobald die UV-Absorption zunimmt.

Um eine Salzkontamination zu vermeiden, stoppen Sie bei steigendem Leitwert direkt bei der Fraktionsprobenahme. Lagern Sie die entgangene RTA-Fraktion bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Hefe wie im Textprotokoll beschrieben transformiert haben, wählen Sie von jedem Teller drei verschiedene Hefeklone aus.

Beimpfen Sie die Klone in 100 Millilitern Lucin-Dropout-Raffinose-Medium bei 220 U/min und 30 Grad Celsius auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 1,0 bis 2,0. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius bei 10.000 g. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern sterilem Wasser gewaschen haben, suspendieren Sie die Zellen erneut in 50 Millilitern Sphäroplastenpuffer

Inkubieren Sie die 50-Milliliter-Kultur 90 Minuten lang bei 100 U/min und 30 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation bei 400 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern stabilisiertem Lucin-Drop-out-Raffinose-Medium. Suspendieren Sie dann die Zellen in fünf Millilitern desselben Mediums, um die Zellen direkt für die GFP-Reporter-Assay-Messungen zu verwenden.

Hefezell-Sphäroplasten in 96-Well-Platten aussäen. In jede Vertiefung werden 70 Mikroliter stabilisiertes Lucin-Drop-out-Raffinose-Medium gegeben, das die Negativkontrolle enthält und den leeren Vektor oder das gereinigte RTA in einer finalen RTA-Konzentration von fünf Mikromolaren exprimiert. Geben Sie 70 Mikroliter stabilisiertes Lucin-Drop-out-Medium in jede der verbleibenden Vertiefungen, um ihr Gesamtvolumen auf 270 Mikroliter zu bringen.

Für eine Positivkontrolle der Proteinhemmung fügen Sie 70 Mikroliter 0,8 molare Sorbitol-stabilisierte G418-Lösung hinzu, da G418 die GFP-Expression in Hefe verhindert. Geben Sie sofort 30 Mikroliter stabilisierte Galaktoselösung hinzu, um die GFP-Expression zu induzieren. Bereiten Sie eine zusätzliche Negativkontrolle vor, indem Sie 30 Mikroliter stabilisiertes Lucin-Drop-out-Raffinose-Medium anstelle von 30 % Galaktose hinzufügen.

Legen Sie die 96-Well-Platte nach Abschluss der Probenvorbereitung in ein Fluoreszenz-Reader und bereiten Sie die Messung mit dem für die GFP-Fluoreszenzdetektion erforderlichen 475-509-Nanometer-Filterset vor. Führen Sie Messungen bei 30 Grad Celsius, 120 U/min und einem Rütteldurchmesser von einem Millimeter über ein Zeitfenster von 20 Stunden mit Messintervallen von 10 Minuten durch. Hier ist ein repräsentativer Aufreinigungsgraph der Affinitätschromatographie von RTA und der Kontrolle des leeren Vektors zu sehen.

Der blaue Peak im schwarzen Feld stellt den gebundenen RTA-Anteil dar. Wie in der Blackbox gezeigt, werden in der Negativkontrolle keine Proteine aus der Säule entfernt. Hier ist ein Entsalzungsdiagramm einer affinitätsgereinigten RTA-Fraktion dargestellt.

Das Diagramm zeigt die Trennung der RTA-Proteinfraktion und der Salzfraktion. Die Ergebnisse der Coomassie-Färbung nach erfolgreicher Aufreinigung und Entsalzung zeigen Zelllysat oder gereinigte Proben verschiedener RTA-Varianten. In dieser Studie wurde unmodifizierte RTA verwendet.

Zur Validierung des Fluoreszenz-Reporter-Assays wurde die relative GFP-Fluoreszenz von Wildtyp-Hefe-Sphäroplasten unter induzierten und nicht-induzierten Bedingungen nach 20 Stunden GFP-Induktion gemessen. Die relative GFP-Fluoreszenz wurde auch in Gegenwart von RTA, G418 oder der Negativkontrolle analysiert. Die relative GFP-Fluoreszenz wurde auch für ausgewählte Mutanten gemessen, bei denen bekannt ist, dass entsprechende Proteine am RTA-Transport in Hefe beteiligt sind und nicht beteiligt sind.

Die gestrichelte Linie stellte eine Signifikanzschwelle dar. Sobald die RTA-Expression und -Reinigung beherrscht sind, können die Ergebnisse des Fluoreszenzbericht-Assays innerhalb eines Tages vorliegen. Darüber hinaus ebnet diese Methode Forschern auf dem Gebiet der Ribosomen-Inaktivierung von B-Toxinen den Weg, ihre Intoxikationswurzeln in einem eukaryotischen Modellorganismus, der Hefe, zu untersuchen.