Name: Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Methode zur Messung bakterieller Adhäsion an Pflanzenoberflächen für die Pflanzenpathologie und Lebensmittelsicherheit. Diese Technik ist schnell, kostengünstig und ermöglicht die Beobachtung von Bakterienbindung an Wurzeln und Sprossen.

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Der Autor dankt Susan Whitfield für Vorbereitung der Figuren und Camille Martin und Hillary Samagaio für Hilfe mit einigen der Experimente.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
<li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11932192">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-plant+interactions%3A+principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li>
<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
<li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases%3A+Principles%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li>
<li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts%2C+leaves+and+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li>
<li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li>
<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9780792351801">The Rhizobiaceae</a>. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01276821">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).</li>
<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
<li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+and+root+exudate+sugars%3A+composition%2C+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x/abstract">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639628">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li>
<li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240593829_Lognormal_Distribution_of_Bacterial_Populations_in_the_Rhizosphere">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252(2014).</li>
<li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li>
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<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%3A+quantification+and+internal+localization+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li>
<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
<li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li>
</ol>

Der Autor erklärt, dass sie keine finanziellen widerstreitenden Interessen hat.

Es ist wichtig zu wissen für alle Oberflächen, die Bakterien während des Experiments eingehalten werden können. So können Bakterien, die in der Lage, Bindung an Glas unterschätzt werden, wenn tragfähige zellenzahlen erfolgen mittels Glasröhren und Pipetten. Wenn Pflanzen im Agar oder Boden und einige der Agar wachsen oder Boden auf den Anlagen bleibt können die Bakterien auf das anhaftende Material nicht auf die Pflanzen binden. Auf der anderen Seite Waschen der Pflanzenoberfläche, insbesondere im Falle von Wurzeln, kann entfernen Sie natürliche Oberflächenbeschichtungen wie Schleim und verändern damit die Ergebnisse der Prüfungen der Einhaltung.
Es ist wichtig, sicher sein, dass die Bakterien, die Inkubation Mischung hinzugefügt während des Experiments am Leben zu bleiben. Somit sollten praktikable zellenzahlen von freien sowie beigefügte Bakterien routinemäßig erfolgen. Einige Behandlungen oder bakterielle Mutationen können bakterielles Wachstumsrate reduzieren oder tatsächlich dazu führen, den Tod eines Bruchteils der Bakterienpopulation. Lebende und tote Bakterien möglicherweise nicht im Mikroskop zu unterscheiden, es sei denn, Spezialfärbungen eingesetzt werden. Gibt es ein nützlich Fleck-Kit für die lebenden/Toten Bakterien die den Ausschluss von Farbstoffen aus der lebenden Bakterien abhängig. Allerdings, wenn eine gemischte Bevölkerung von Bakterienarten vorhanden ist dann lebensfähig Zellzahlen der Arten von Interesse ist wahrscheinlich die einfachste Methode um festzustellen, ob die Inkubation bakterielle Tod geführt hat.
Mittlere Zusammensetzung beeinflussen Bakterien überleben und Wachstum. Wurzel Exsudat und Materialien aus der Wunde entlassen und schneiden Websites bieten Substrat um bescheidene bakterielles Wachstum zu unterstützen. Stickstoff, Phosphat und Eisen neigen dazu, unter diesen Bedingungen zu begrenzen. Zweiwertige kationen wie Calcium und Magnesium können die Haftung beeinflussen. In manchen Fällen kann Kohlenstoffquelle Adhäsion wirkt. pH ist ebenfalls von Bedeutung. Im Allgemeinen ist der pH-Wert der Rhizosphäre zwischen 5,5 und 6,5.
Es ist notwendig, vorsichtig im Umgang mit Bakterien mit Antibiotika-Resistenz gekennzeichnet werden. Die am häufigsten verwendeten Antibiotika sind Rifampicin und Nalidixic Säure. Resistenz gegen diese Antibiotika ist in der Regel aufgrund von Mutationen in den chromosomalen Genen (RNA-Polymerase und Gyrase, beziehungsweise) und nicht so leicht auf eine andere Belastung während der Inkubation übertragen werden. Diese Art von Widerstand führt auch nicht in die Zerstörung oder Veränderung des Antibiotikums. Kennzeichnung von Bakterien mit einem Plasmid übertragene gen Marker wird nicht empfohlen, es sei denn, das Plasmid auf andere Bakterien übertragen werden kann. Die Antibiotikaresistenz darf nicht durch Abbau oder chemische Modifikation des Antibiotikums wie Antibiotika empfindlichere Bakterien dann in der Lage werden, auf Antibiotika Platten zu wachsen, wenn sie sich in der Nähe die resistenten Bakterien sind.
In diesem Artikel beschriebenen Methoden eignen sich für kleine Stichprobengrößen bzw. Experimente sollten die Proben (z. B. Experimente mit menschlichen Krankheitserreger) enthalten sein. Für große Stichproben (über 100 g Material oder mehr als 50 Pflanzen) wäre andere Methoden oder drastische Änderung dieser Methoden benötigt10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. die Anwesenheit einer großen Anzahl von Mikroorganismen als die untersuchten Arten kann auch erhebliche Probleme aufwerfen. Mögliche Lösungen umfassen die Verwendung von Bakterien mit einem fluoreszierenden Proteins oder Antibiotika-Resistenz gekennzeichnet, wie in den Schritten 6.1.2 und 7.3 beschrieben. Wenn die Bakterien von Interesse selten Individuen in einer großen Population von anderen Mikroorganismen sind können diese Markierungen nicht ausreichend, um die Zahl der untersuchten Bakterien eindeutig bewerten jedoch.
Alle die hier beschriebenen Methoden sind Labormethoden basiert. Geringfügige Änderungen wären für gewächshausstudien erforderlich. Weitere wesentliche Änderungen werden voraussichtlich für Feldstudien verlangt werden, wo Protozoen, Insekten und andere Tiere Prädation und Klima-Variante erschweren die Bereitstellung von definierten Bedingungen für die Experimente. In Zukunft können diese Methoden erweitert werden die Wechselwirkungen von zwei oder mehr Mikroorganismen auf der Pflanzenoberfläche.

Die Messung der bakterielle Bindung an Oberflächen zu Pflanzen ist in drei unterschiedlichen Situationen sehr wichtig geworden. Die erste Situation ist die Prüfung der Übertragung von menschlichen Krankheitserreger am Werk Oberflächen1,2,3. Das Ziel hier ist bakterielle Bindung zu verhindern oder zu entfernen oder gebundene Bakterien abtöten und damit die Übertragung von Krankheiten durch Pflanzenmaterial zu reduzieren. Im zweiten Fall ist die Untersuchung der Bindung der Pflanzenpathogene Oberflächen4Pflanzen. Wieder einmal das Ziel hier ist verbindlich zu verhindern oder zu entfernen oder gebundene Bakterien abtöten und damit zur Krankheit zu reduzieren. Die dritte Lage ist die Untersuchung der Bindung von symbiotischen oder Pflanze-wachstumsfördernde Bakterien5,6. Das Ziel dabei ist die Förderung bakterielle verbindlich und somit zur Erhöhung der Pflanzengesundheit und Ernte ergibt.
Die Techniken zur Messung der bakterielle Bindung an Oberflächen, die in diesem Artikel beschriebenen Pflanzen sind preiswert und relativ einfach durchzuführen. Die einzigen Voraussetzungen sind ein Mikroskop und Materialien, die in der Regel in einem Bakteriologie Labor gefunden. Für einige Techniken eignet sich ein Bad sonikator. Die beschriebenen Techniken eignen sich für verbindliche Experimente mit relativ kleinen Stichprobengrößen durchgeführt. Messungen von Bindung sind im Labor durchgeführt, obwohl es vielleicht möglich, einige dieser Techniken für den Einsatz im Gewächshaus oder im Feld zu ändern.
Diese Techniken wurden verwendet, um bakterielle Bindung an Wurzeln, Sprossen, geschnittene Blätter, geschnittenen Früchten und intakte Cherry-Tomaten im Labor7,8,9,10,11Messen, 12,13,14,15. Sie wurden auch zur Wurzel Besiedlung der Pflanzen wachsen im Boden zu messen oder sand in den Labor-16. Die Techniken wurden mit vielen Bakterienarten Agrobacterium Tumefaciens, Sinorhizobium Meliloti, Escherichia coli, Salmonella Enterica und Pseudomonas Fluorescenseinschließlich verwendet. Eine nützliche Beschreibung der Methoden für die Beurteilung der Wechselwirkung von A. Tumefaciens mit Oberflächen finden Sie in Morton und Fuqua (2012)17. In allen Fällen wurden die beteiligten Stichprobengrößen klein, in der Regel weniger als 25-50 Pflanzen. Die beschriebenen Techniken sind geeignet für den Einsatz mit menschlichen Krankheitserreger, die während der Experimente enthaltenen gehalten werden müssen.

<table><tbody><tr><td>Hilfreich sind Lichtmikroskope</td><td>mit</td><td>N/A-Phasenkontrast</td><td>oder Nomarski-Optiken, für Untersuchungen mit Fluoreszenzmarkern ist ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich.</td></tr><tr><td>Saatgut</td><td>beliebig&nbsp;</td><td>N/A</td><td>: Notieren Sie sich die Chargennummer des Saatguts und die Sortebleiche</td></tr>, <tr><td></td><td>alle</td><td>N/</td>A-Badbeschallungsgeräte<td></td></tr>, <tr><td></td><td>alle wissenschaftlichen</td><td>Versorgungsunternehmen, N/A</td><td></td></tr>, <tr><td>Triton X-100</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>T9284</td><td></td></tr>, <tr><td>Nährstoff-Agar&nbsp;</td><td>Difco&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Sojaton</td><td>Difco&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>Meer Sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td> <td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>Konetainer</td><td>Stuewe & Söhne, Inc.</td><td>Ray-Leach-Cone-Tainer</td><td>sind in vielen verschiedenen Größen erhältlich, um der Art von Pflanze gerecht zu werden, die Sie anbauen möchten</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>jedes wissenschaftliche Versorgungsunternehmen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS Salze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Parrafin</td><td>jede</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zentrigfuge</td><td>jedes wissenschaftliche Unternehmen</td><td>N/A</td><td>zum Pelletieren der meisten Bakterien nur eine kleine Zentrifuge mit einer maximalen Kraft von 10.000 XG wird benötigt</td></tr><tr><td>Wirbelmischer</td><td>jedes wissenschaftliche Unternehmen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrometer</td><td>ACCU-SCOPE Zubehör</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-Sparrenzählzelle</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>Sonden-Clip Press-Seal Inkubatinkammer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Naladixinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Lebend-/Totfärbung</td><td>In-vitrogen Molekulare Biosonden</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

einhaltung von bakterien auf flächen, die im labor ermittelten pflanzen

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Messung der bakterielle Bindung an axenic pflanzlicher Oberflächen im Lichtmikroskop und durch den Einsatz von lebensfähigen Zellzahlen. Pflanzlichen Stoffen verwendet gehören Wurzeln, Sprossen, Blätter und Früchte schneiden. Die beschriebenen Methoden sind kostengünstig, leicht und eignet sich für kleine Probenmengen. Bindung wird im Labor gemessen und eine Vielzahl von Medien Inkubation und Bedingungen verwendet werden. Der Einfluss von Inhibitoren kann ermittelt werden. Situationen, die zu fördern und hemmen die Bindung können auch beurteilt werden. In einigen Fällen ist es möglich zu unterscheiden, ob verschiedene Bedingungen verbindlich in erster Linie aufgrund ihrer Wirkung auf die Pflanze oder die Bakterien verändern.

A. Tumefaciens kolonisiert Wurzeloberflächen. Um festzustellen, ob bakterielle Produktion von Zellulose eine Rolle bei der Kolonisierung der Wurzel spielt, die Auswirkungen der bakteriellen Mutationen, die Zellulose-Synthese zu verhindern wurden geprüft,16. In den Schritten 1.3 und 7.1 beschriebenen Techniken wurden verwendet. Tomaten-Samen wurden Oberfläche sterilisiert und in sterilem Wasser keimten. Wenn die Wurzeln ca. 2 cm lang waren waren sie eingetaucht in eine Suspension von 105 Bakterien pro mL und in pasteurisierter Boden in Container gepflanzt. Die Pflanzen wurden gezüchtet für 14 Tage bei 25 ° C auf einem 12 h Licht/12 h-Dunkel-Zyklus. Nach der angegebenen Zeit die Pflanzen wurden aus den Behältern entfernt. Die Wurzeln wurden gewaschen und beschallt in einem Bad sonikator gebundene Bakterien zu entfernen. Bakterielle Zahlen wurden mit lebensfähigen Zellen bestimmt. Abbildung 2 zeigt die Wirkung von zwei verschiedenen Zellulose-Minus-Mutationen auf die Fähigkeit der Bakterien, Tomate Wurzeln zu kolonisieren. Obwohl die Standardabweichungen der einige Messungen waren so hoch wie 0,910 (ein häufiges Problem bei dieser Art der Messung) melden Sie sich der Rückgang der Bindung der Zellulose-Minus Mutanten ist klar ersichtlich und wir können feststellen, dass die bakterielle Produktion von Zellulose hilft die Bakterien bei der Besiedlung der Tomate Wurzeln.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Abbildung 2 : Root Besiedlung durch Wildtyp und Mutanten Zellulose-Minus von A. Tumefaciens. Log10 Gesamtzahl der Bakterien pro cm Wurzellänge erholte sich von Tomaten Wurzeln mit Wildtyp-Stamm A. Tumefaciens C58 und Zellulose-Minus Mutanten, C58:1 und C58:A60 geimpft. Die Nummern sind die Mittel von einem Minimum von vier separate Experimente. Balken zeigen Standardabweichungen vom Mittel. Wurzeln wurden durch Eintauchen in eine Suspension von 105 Bakterien pro mL für 1 min geimpft. Die Pflanzen waren in Containern angebaut und die lose anhaftenden Bakterien wurden durch die Wurzeln in Waschpuffer in eine Glasflasche Waschen entfernt. Fest anhaftende Bakterien wurden entfernt, mit einem Bad sonikator und die entstandene Suspension vergoldet um festzustellen, dass lebensfähige Zelle16zählt. Diese Zahl wurde von Matthysse und McMahan geändert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Rolle der exopolysaccharide in der Bindung von E. Coli und andere Bakterien, Alfalfasprossen wurde untersucht. Einige Ausbrüche von Durchfallerkrankungen durch E. Coli O157: H7 haben auf kontaminierte Alfalfasprossen zurückzuführen. Bindung von Wildtyp Bakterien und Mutanten, die nicht in der Lage zu verschiedenen exopolysaccharide wurde mittels in Schritte 1.1, 5.1 und 7.2 beschriebenen Methoden gemessen. Alfalfasprossen waren Oberfläche sterilisiert und für einen Tag in sterilem Wasser bei 25 ° C im Dunkeln gekeimt. Vier Sprossen mit angehängten samenhüllen wurden in sterilen Plastikschalen mit 5 mL Wasser platziert. Bakterien in Luria Brühe angebaut wurden, eine Endkonzentration von etwa 5 x 103 pro mL hinzugefügt. Die beimpften Sprossen waren für 3 Tage bei 25 ° C im Dunkeln inkubiert. Die Sprossen wurden zweimal in 5 mL sterilem Wasser in einer Phiole durch kräftige Umkehrung gewaschen und in Waschpuffer mit einer motorbetriebenen Teflon Glas Homogenisator homogenisiert. Bisherigen Experimente mit Hilfe von Bakterien markiert mit einem Plasmid trägt das GFP-gen zeigten keine internalisierten Bakterien zwar Oberfläche Bakterien leicht beobachtet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1dargestellt. Zwei Stämme von E. Coli O157: H7 wurden untersucht. Beide Stämme erschien die Produktion von Poly-β-1,6-glucuron-acid(PGA) zu den größten Beitrag zur Bindung von pathogenen E. Coli , Oberflächen zu Pflanzen. Kolon Säure spielte auch eine bedeutende Rolle in Bindung. Während der Rückgang der Bindung in Zellulose-Minus Mutanten erhebliche war es nicht so groß wie für die anderen zwei Polysaccharide.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Auswirkungen von Mutationen in den Genen Exopolysaccharide Produktion auf die Bindung von E. coli O157: H7, Sprossen und offene samenhüllen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Bakterienstamm</td>
			<td rowspan="2">Mutation oder Genotyp (entsprechenden Phänotyp)</td>
			<td colspan="2">Log10 Anzahl der Bakterien pro Spross oder Samenschale gebunden</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfalfa Sprossenb
</td>
			<td>Offenen samenhüllen</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Keiner (Wildtyp)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (Zellulose-Minus)</td>
			<td>2.9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (Kolon Säure-Minus)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-Minus)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Keiner (Wildtyp)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (Zellulose-Minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (Kolon Säure-Minus)</td>
			<td>3.9 ± 0,5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-Minus)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">ein Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei Messungen der Anzahl (Log10) der Bakterien nach 3 Tagen gebunden.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b-Sprossen wurden vor der Messung gewaschen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Deutlich anders als der Wildtyp c: P &lt; 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d signifikant verschieden von dem Wildtyp: P &lt; 0,05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Auswirkungen von Mutationen in den Genen Exopolysaccharide Produktion auf die Bindung von E. Coli O157: H7, Sprossen. Um festzustellen, die Rolle der verschiedenen exopolysaccharide und Lipopolysaccharid in der Bindung von pathogenen E. Coli O157: H7-Stämme, Alfalfasprossen, die Bindung einer Gruppe von Mutanten, die Sprossen und offene samenhüllen wurde untersucht, mit den Methoden in Schritt 6 beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass Poly-ß-1, 6 -N-Acetyl-D-Glucosamin (PGA) scheint wesentlich für die Bindung an Sprossen und Zellulose und Colanic Säure sind für maximale Bindung von E. Coli O157 erforderlich. Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.
Um festzustellen, ob die Produktion von PGA ausreichend, um bakterielle Bindung an Oberflächen, ein Plasmid (pMM11) tragen die geklonten Operon Codierung die Gene für PGA erforderlichen Pflanzen verursachen wurde Produktion in zwei verschiedenen Bakterien eingeführt, die nicht werden Sie normalerweise Tomaten Wurzeln10binden. A. Tumefaciens A1045 ist eine Mutante der Wildtyp-Stamm C58 nicht zyklische-β-1,2-Glucan machen und auch nicht an Oberflächen29Pflanzen binden. Sinorhizobium Meliloti 1021 bildet WURZELKNÖLLCHEN auf Luzerne scheitert an nicht-Leguminosen binden darunter Tomaten12. In Schritte 1.1, 6.3, 5.1 und 7.1 beschriebenen Techniken wurden verwendet, um festzustellen, ob die Fähigkeit zur PGA in der Regel bakterielle Bindung an Wurzeloberflächen erhöht. Tomaten-Samen wurden Oberfläche sterilisiert und in sterilem Wasser keimten. Wurzeln in Segmente 1 cm Länge geschnitten und in sterilem Wasser gelegt wurden und die Bakterien geimpft wurden. Da diese beiden Arten von Bakterien unterschiedlich schnell wachsen, wurde Bindung zu verschiedenen Zeiten, um etwa gleiche Mengen von Bakterienwachstum ermöglichen gemessen. Das Vorhandensein von Plasmid pMM11 verursacht eine ähnliche deutliche Erhöhung der Anzahl der gebundenen Bakterien von beiden Arten (Tabelle 2)10. Eine deutliche Zunahme der Bindung galt auch in dem Lichtmikroskop die Bindung war jedoch ganz anders für die beiden Arten (Abbildung 3). A. Tumefaciens A1045 als einzelne Bakterien an der wurzeloberflächegebunden. S. Meliloti gebunden in großen Clustern, in denen nur ein paar der Bakterien wurden direkt an der Wurzel und die Mehrheit der Bakterien auf andere Bakterien befestigt waren. Dieses Beispiel zeigt, dass einfach die Zahl der Bakterien gebunden ohne einschließlich mikroskopische Beobachtungen analysiert einen irreführenden Eindruck der Ergebnisse eines Experiments geben kann. Obwohl beide Methoden (tragfähige Zellzahlen und mikroskopische Beobachtungen) zeigen, dass pMM11 bakterielle Bindung an Tomaten Wurzeln erhöht, war die Art der Bindung verursacht bei der Herstellung von PGA für zwei Bakterienarten10unterschiedlich.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Die Wirkung von Plasmid pMM11 auf die Bindung von Bakterien zu Tomaten Wurzeln</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bakterienstamm</td>
			<td>Plasmid</td>
			<td>Anzahl der Bakterien pro mm Wurzellänge gebunden</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. Tumefaciens A1045ein
</td>
			<td>keine</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (Vektor)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA-Synthese)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. Meliloti 1021b
</td>
			<td>keine</td>
			<td>keine erkannt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (Vektor)</td>
			<td>keine erkannt</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA-Synthese)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">eine bakterielle Bindung wurde nach 2 Stunden gemessen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b bakterielle Bindung war Maßnahme nach 18 Stunden</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: die Wirkung von ein Plasmid mit Genen für die Synthese von PGA auf Bindung der A. Tumefaciens A1045 und S. Meliloti 1021 Tomate Wurzel Segmenten. Um zu prüfen, die Fähigkeit der Poly-ß-1, 6 -N-Acetyl-D-Glucosamin (PGA) zur Förderung der Bindung von Bakterien, Pflanzen Wurzeln, die Wirkung von ein Plasmid verleiht die Fähigkeit, PGA (pMM11) auf die Bindung von zwei Bakterienstämme Anlage verbunden sind, Tomaten-Wurzeln wurde untersucht. Weder Bakterienstamm zeigten signifikante Bindung an Tomaten Wurzeln in Abwesenheit des Plasmids oder im Beisein der Plasmid ohne den Genen Codierung PGA-Synthese (pBBR1mcs). Die Zugabe des Plasmids mit PGA Synthese Genen erhöhte Bindung von beiden Arten von Bakterien. Da A. Tumefaciens schneller wächst als S. Meliloti Bindung nach 2 h Inkubation für A. Tumefaciens und nach 18 h für S. Melilotigemessen wurde. Die verwendeten Techniken sind in Schritt 7 beschrieben. Diese Tabelle wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Abbildung 3 : Die Wirkung von Plasmid pMM11 tragen die PGA-Biosynthese-Gene auf die Bindung von A. Tumefaciens A1045 und S. Meliloti 1021, Tomate Wurzelhaare. A. Tumefaciens A1045 Bindung an Tomaten Wurzelhaare von A), B) A. Tumefaciens A1045 pMM11, C) S. Meliloti 1021 und D) S. Meliloti 1021 pMM11. Obwohl die Zunahme der Bindung von zwei Bakterienarten ungefähr ähnlich ist sind Details der Bindung wie in dem Lichtmikroskop gesehen ganz anders. Die verwendeten Techniken sind in Schritt 6 beschrieben. Diese Zahl wurde von Matthysse, Deora, Mishra und Torres10geändert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Es ist manchmal möglich, Bindung an nicht-biologischen Oberflächen verwenden, um Hilfe bei der Unterscheidung des Beitrags der Bakterien und des Werkes in eine spezifische Interaktion. Die unipolaren polysaccharide(UPP) von A. Tumefaciens hat sich gezeigt, um bakterielle Bindung an eine Vielzahl von beiden biologischen und nicht-biologischen Oberflächen30vermitteln zu können. Calcium wurde beobachtet, um die Bindung von A. Tumefaciens , Oberflächen, vermittelt durch die UPP28Pflanzen hemmen. Die Bindung der Bakterien an Nylonfäden wurde untersucht, um festzustellen, ob die Hemmung von Calcium-Ionen der bakterielle Bindung zu Flächen Pflanzen durch Wirkung auf Bakterien oder auf der Pflanzenoberfläche ist. Beschreibt die Techniken im Schritt 8.2 dienten. Tomaten-Samen wurden Oberfläche sterilisiert und gekeimt im Wasser wie in Schritt 1 beschrieben. Die Bakterien wurden in minimaler Medium mit Saccharose angebaut und zur Tomate Wurzeln oder Nylonfäden an eine Endkonzentration von etwa 105/mL hinzugefügt, wie im Schritt 5.1 beschrieben. Die Wirkung der zusätzlichen CaCl2 auf bakterielle Bindung an Tomaten-Wurzeln und Nylonfäden war im Mikroskop untersucht. Abbildung 4 zeigt eine ähnliche Hemmung der Bindung von Kalzium mit entweder Oberfläche vorschlagen, die die Wirkung des Kalziums in erster Linie auf die Bakterien10ist.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Abbildung 4 : Die Wirkung von Kalzium auf die Bindung von A. Tumefaciens an Tomaten Wurzelhaare und Nylonfäden. A. Tumefaciens wurde mit Tomate Wurzeln (A und B) oder Nylonfäden (C und D) für 24 h inkubiert, in einem 01:10 Verdünnung von MS Salzen und ein 01:20 Verdünnung AB minimaler Medium, 0,4 % Saccharose (A und C) oder in einem 01:10 Verdünnung von MS Salzen und 01:20 Verdünnung von minimaler Medium AB , 0,4 % Saccharose mit 60 mM CaCl2 (B und D)31. Die zusätzlichen CaCl2 gehemmt bakterielle Bindung zu den Wurzeln und Nylonfäden, die darauf hindeutet, dass die Hemmung in erster Linie durch einen Effekt auf die Bakterien nicht auf der Pflanzenoberfläche war. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Eine einfache Methode zur Messung und Charakterisierung von bakteriellen Adhäsion zu Pflanzen, besonders Wurzeln und Sprossen, wird in diesem Artikel beschrieben.

Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindung von Bakterien an Pflanzenoberflächen zu beobachten und zu messen. Diese Methode kann wichtige Fragen sowohl in der Pflanzenpathologie als auch in der Lebensmittelsicherheit beantworten. Insbesondere kann sie Fragen beantworten, wie sich Bakterien an Pflanzenoberflächen binden und wie sie entfernt werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach, schnell und kostengünstig ist. Um Sämlinge vorzubereiten, die im Wasser gezogen werden, geben Sie eine kleine Anzahl von Samen in ein 30-, 50-, 100- oder 150-Milliliter-Glasbecherglas. Hier kommen Tomatensamen zum Einsatz.Die Samen mit 80%Ethanol bedecken und kurz schwenken. Lassen Sie die Samen dann eine Minute lang einweichen. Gießen Sie das Ethanol ab und tauchen Sie die Samen in eine Lösung aus 50 % handelsüblichem Bleichmittel und 0,1 % Triton X-100 und Leitungswasser.Lasse die Samen 20 Minuten oder länger einweichen, wenn die Samen groß sind, wie z. B. Bohnensamen. Gießen Sie die Bleichmittelmischung ab und waschen Sie die Samen dreimal mit sterilem Wasser, wobei Sie die Samen bei jeder Wäsche eine Minute lang im Wasser einweichen lassen. Gießen Sie die Samen und eine kleine Menge Wasser in eine sterile Petrischale und brüten Sie die Samen im Dunkeln aus, bis die Sämlinge die gewünschte Größe zwischen einem Zentimeter und 10 Zentimetern erreicht haben.Um Saatgut oder Setzlinge vorzubereiten, die im Sand gewachsen sind, impfen Sie nach dem Sterilisieren des Saatguts und des Pflanzmaterials die Samen oder Setzlinge mit Bakterien gemäß dem Textprotokoll. Mache mit einem sterilen Glasstab ein flaches Loch in den Sand, das gerade tief genug ist, um den Samen unter die Oberfläche zu legen. Lege den Samen in das Loch und bedecke ihn mit einer dünnen Schicht Sand.Verwenden Sie dann eine Siegelfolie, um die Oberseite des Behälters zu versiegeln, um Wasserverlust und das Eindringen zusätzlicher Mikroben zu verhindern. Züchten Sie die Pflanzen im Labor unter einer Lampe oder im Gewächshaus bei einer für die Pflanzenart und -sorte geeigneten Temperatur und Tageslänge. Pflanzen Sie die Setzlinge in den Sand.Verwende einen sterilen Glasstab, um ein Loch zu bohren. Führen Sie dann mit einer sterilen Häkelnadel aus Edelstahl die Wurzel vorsichtig in das Loch und füllen Sie die Seiten des Lochs mit Sand. Nachdem Sie Pflanzen mit Bakterien gemäß dem Textprotokoll inkubiert haben, bereiten Sie eine Probe für die Mikroskopie vor, indem Sie sie in einen Tropfen Wasser oder Inkubationsmedium auf einen Objektträger legen und direkt beobachten.Wenn keine sichtbaren freien Bakterien vorhanden sind, kann es zu einem bakteriellen Absterben oder einer bakteriellen Bindung an den Behälter gekommen sein, in dem die Inkubation durchgeführt wurde. Waschen Sie die Probe in Wasser oder Inkubationsmedium, indem Sie sie in ein Fläschchen mit Flüssigkeit legen und das Fläschchen vorsichtig umdrehen. Legen Sie dann die Probe zur Betrachtung in frischer Flüssigkeit auf den Objektträger.Verwenden Sie zum Montieren der Probe ein gewöhnliches Deckglas. Wenn die Probe dick ist und eine Ausbuchtung bildet, geben Sie die Flüssigkeit und die Probe in die Vertiefung einer Presse und tragen Sie einen Deckglas auf, der am Rand einen Ring aus Gummi oder Kunststoff hat. Legen Sie die Folie darauf und drücken Sie sie vorsichtig nach unten, um den Deckglas mit der Folie zu verschließen.Drehen Sie den Objektträger um, um die Probe zu untersuchen. Alternativ können Sie einen Algenzähldia und einen Deckslip auf ähnliche Weise verwenden und mit nicht mehr als 20-facher Vergrößerung betrachten. Um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien zu bestimmen, die in Pflanzen gefunden werden, die im Sand gewachsen sind, entfernen Sie zunächst das Dichtungsmaterial von der Ober- und Unterseite des Behälters.Stellen Sie den Behälter über ein Stück steriles Papier und klopfen Sie den Behälter vorsichtig gegen die Oberfläche, um den Sand zu lösen, bevor Sie den Sand mit der Pflanze vorsichtig aus dem Behälter heben. Wenn der Zylinder aus Sand und die Pflanze frei auf dem Papier sind, spalte den Sand in der Mitte, um die Pflanzenwurzel freizulegen. Falls gewünscht, nehmen Sie Proben des Sandes sowohl in der Nähe des Rand des Behälters als auch in der Nähe der Wurzel.Dies kann nützlich sein, um die Ausbreitung, Ansammlung und das Wachstum von Bakterien zu bestimmen. Nehmen Sie die Wurzel auf und entfernen Sie den Sand und die Bakterien, die lose anhaften, indem Sie die Wurzel in eine abgemessene Menge Wasser oder Puffer tauchen und vorsichtig schütteln. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen der Bakterien in der resultierenden Suspension, indem Sie sie auf geeignete Medien wie Luria-Agar aufpolieren.Dies stellt die Anzahl der Bakterien dar, die lose mit der Wurzel verbunden sind. Zum Schluss entfernen Sie die fest gebundenen Bakterien durch Beschallung und bestimmen deren Anzahl. Diese Grafik zeigt den Einfluss von zwei verschiedenen Cellulose-Minus-Mutationen auf die Fähigkeit der Bakterien, Tomatenwurzeln zu besiedeln.Obwohl die Standardabweichungen einiger Messungen bis zu 0,9 log Base von 10 betrugen, ist die Verringerung der Bindung der Cellulose minus Mutanten deutlich sichtbar. In diesem Experiment wurde die Bindung an Alfalfasprossen des Wildtyps E.Coli 0157:H7 in Mutanten gemessen, die nicht in der Lage sind, verschiedene Exopolysaccharide zu bilden. In beiden Stämmen schien die Produktion von Poly-Beta-Eins-Sechs-Glucuronsäure (PGA) den größten Beitrag zur Bindung pathogener E.coli an Pflanzenoberflächen zu leisten.Colansäure spielte auch eine wichtige Rolle bei der Bindung. Hier wurden zwei Bakterienstämme, die nicht in der Lage sind, sich an Pflanzenoberflächen zu binden, so verändert, dass sie PGA produzieren, um festzustellen, ob es ausreicht, um eine bakterielle Bindung an Tomatenwurzeln zu bewirken. Im Fall von A.tumefaciens A1045 bewirkte PGA, dass die Bakterien einzeln an die Wurzeloberfläche gebunden wurden.Auf der anderen Seite band S. meliloti in großen Clustern, in denen nur wenige der Bakterien direkt an die Wurzel gebunden waren, und die Mehrheit der Bakterien an andere Bakterien gebunden war. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde für die Ersteinrichtung plus Inkubationszeit und je nach Probe zwischen 10 Minuten und einer Stunde Scoring-Zeit durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass Bakterien an fast jeder Oberfläche haften bleiben können.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bindung von Bakterien an Pflanzenoberflächen beobachten kann. Bestimmen Sie, wo an der Pflanze die Bakterien binden und bestimmen Sie die Anzahl der gebundenen Bakterien. Vergessen Sie nicht, dass, wenn Sie diese Verfahren mit menschlichen Krankheitserregern durchführen, das Verfahren äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer Sicherheitshaube und das Tragen von Handschuhen immer getroffen werden sollten.

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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