Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindung von Bakterien an Pflanzenoberflächen zu beobachten und zu messen. Diese Methode kann wichtige Fragen sowohl in der Pflanzenpathologie als auch in der Lebensmittelsicherheit beantworten. Insbesondere kann sie Fragen beantworten, wie sich Bakterien an Pflanzenoberflächen binden und wie sie entfernt werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach, schnell und kostengünstig ist. Um Sämlinge vorzubereiten, die im Wasser gezogen werden, geben Sie eine kleine Anzahl von Samen in ein 30-, 50-, 100- oder 150-Milliliter-Glasbecherglas. Hier kommen Tomatensamen zum Einsatz.

Die Samen mit 80%Ethanol bedecken und kurz schwenken. Lassen Sie die Samen dann eine Minute lang einweichen. Gießen Sie das Ethanol ab und tauchen Sie die Samen in eine Lösung aus 50 % handelsüblichem Bleichmittel und 0,1 % Triton X-100 und Leitungswasser.

Lasse die Samen 20 Minuten oder länger einweichen, wenn die Samen groß sind, wie z. B. Bohnensamen. Gießen Sie die Bleichmittelmischung ab und waschen Sie die Samen dreimal mit sterilem Wasser, wobei Sie die Samen bei jeder Wäsche eine Minute lang im Wasser einweichen lassen. Gießen Sie die Samen und eine kleine Menge Wasser in eine sterile Petrischale und brüten Sie die Samen im Dunkeln aus, bis die Sämlinge die gewünschte Größe zwischen einem Zentimeter und 10 Zentimetern erreicht haben.

Um Saatgut oder Setzlinge vorzubereiten, die im Sand gewachsen sind, impfen Sie nach dem Sterilisieren des Saatguts und des Pflanzmaterials die Samen oder Setzlinge mit Bakterien gemäß dem Textprotokoll. Mache mit einem sterilen Glasstab ein flaches Loch in den Sand, das gerade tief genug ist, um den Samen unter die Oberfläche zu legen. Lege den Samen in das Loch und bedecke ihn mit einer dünnen Schicht Sand.

Verwenden Sie dann eine Siegelfolie, um die Oberseite des Behälters zu versiegeln, um Wasserverlust und das Eindringen zusätzlicher Mikroben zu verhindern. Züchten Sie die Pflanzen im Labor unter einer Lampe oder im Gewächshaus bei einer für die Pflanzenart und -sorte geeigneten Temperatur und Tageslänge. Pflanzen Sie die Setzlinge in den Sand.

Verwende einen sterilen Glasstab, um ein Loch zu bohren. Führen Sie dann mit einer sterilen Häkelnadel aus Edelstahl die Wurzel vorsichtig in das Loch und füllen Sie die Seiten des Lochs mit Sand. Nachdem Sie Pflanzen mit Bakterien gemäß dem Textprotokoll inkubiert haben, bereiten Sie eine Probe für die Mikroskopie vor, indem Sie sie in einen Tropfen Wasser oder Inkubationsmedium auf einen Objektträger legen und direkt beobachten.

Wenn keine sichtbaren freien Bakterien vorhanden sind, kann es zu einem bakteriellen Absterben oder einer bakteriellen Bindung an den Behälter gekommen sein, in dem die Inkubation durchgeführt wurde. Waschen Sie die Probe in Wasser oder Inkubationsmedium, indem Sie sie in ein Fläschchen mit Flüssigkeit legen und das Fläschchen vorsichtig umdrehen. Legen Sie dann die Probe zur Betrachtung in frischer Flüssigkeit auf den Objektträger.

Verwenden Sie zum Montieren der Probe ein gewöhnliches Deckglas. Wenn die Probe dick ist und eine Ausbuchtung bildet, geben Sie die Flüssigkeit und die Probe in die Vertiefung einer Presse und tragen Sie einen Deckglas auf, der am Rand einen Ring aus Gummi oder Kunststoff hat. Legen Sie die Folie darauf und drücken Sie sie vorsichtig nach unten, um den Deckglas mit der Folie zu verschließen.

Drehen Sie den Objektträger um, um die Probe zu untersuchen. Alternativ können Sie einen Algenzähldia und einen Deckslip auf ähnliche Weise verwenden und mit nicht mehr als 20-facher Vergrößerung betrachten. Um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien zu bestimmen, die in Pflanzen gefunden werden, die im Sand gewachsen sind, entfernen Sie zunächst das Dichtungsmaterial von der Ober- und Unterseite des Behälters.

Stellen Sie den Behälter über ein Stück steriles Papier und klopfen Sie den Behälter vorsichtig gegen die Oberfläche, um den Sand zu lösen, bevor Sie den Sand mit der Pflanze vorsichtig aus dem Behälter heben. Wenn der Zylinder aus Sand und die Pflanze frei auf dem Papier sind, spalte den Sand in der Mitte, um die Pflanzenwurzel freizulegen. Falls gewünscht, nehmen Sie Proben des Sandes sowohl in der Nähe des Rand des Behälters als auch in der Nähe der Wurzel.

Dies kann nützlich sein, um die Ausbreitung, Ansammlung und das Wachstum von Bakterien zu bestimmen. Nehmen Sie die Wurzel auf und entfernen Sie den Sand und die Bakterien, die lose anhaften, indem Sie die Wurzel in eine abgemessene Menge Wasser oder Puffer tauchen und vorsichtig schütteln. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen der Bakterien in der resultierenden Suspension, indem Sie sie auf geeignete Medien wie Luria-Agar aufpolieren.

Dies stellt die Anzahl der Bakterien dar, die lose mit der Wurzel verbunden sind. Zum Schluss entfernen Sie die fest gebundenen Bakterien durch Beschallung und bestimmen deren Anzahl. Diese Grafik zeigt den Einfluss von zwei verschiedenen Cellulose-Minus-Mutationen auf die Fähigkeit der Bakterien, Tomatenwurzeln zu besiedeln.

Obwohl die Standardabweichungen einiger Messungen bis zu 0,9 log Base von 10 betrugen, ist die Verringerung der Bindung der Cellulose minus Mutanten deutlich sichtbar. In diesem Experiment wurde die Bindung an Alfalfasprossen des Wildtyps E.Coli 0157:H7 in Mutanten gemessen, die nicht in der Lage sind, verschiedene Exopolysaccharide zu bilden. In beiden Stämmen schien die Produktion von Poly-Beta-Eins-Sechs-Glucuronsäure (PGA) den größten Beitrag zur Bindung pathogener E.coli an Pflanzenoberflächen zu leisten.

Colansäure spielte auch eine wichtige Rolle bei der Bindung. Hier wurden zwei Bakterienstämme, die nicht in der Lage sind, sich an Pflanzenoberflächen zu binden, so verändert, dass sie PGA produzieren, um festzustellen, ob es ausreicht, um eine bakterielle Bindung an Tomatenwurzeln zu bewirken. Im Fall von A.tumefaciens A1045 bewirkte PGA, dass die Bakterien einzeln an die Wurzeloberfläche gebunden wurden.

Auf der anderen Seite band S. meliloti in großen Clustern, in denen nur wenige der Bakterien direkt an die Wurzel gebunden waren, und die Mehrheit der Bakterien an andere Bakterien gebunden war. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde für die Ersteinrichtung plus Inkubationszeit und je nach Probe zwischen 10 Minuten und einer Stunde Scoring-Zeit durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass Bakterien an fast jeder Oberfläche haften bleiben können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bindung von Bakterien an Pflanzenoberflächen beobachten kann. Bestimmen Sie, wo an der Pflanze die Bakterien binden und bestimmen Sie die Anzahl der gebundenen Bakterien. Vergessen Sie nicht, dass, wenn Sie diese Verfahren mit menschlichen Krankheitserregern durchführen, das Verfahren äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer Sicherheitshaube und das Tragen von Handschuhen immer getroffen werden sollten.