Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente
21. Dezember 2017
Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einzelne Transkripte in E.Coli für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden für die Visualisierung in Einzelmolekül-FiSH-Experimenten zu markieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Systembiologie zu beantworten, wie z. B. die Charakterisierung der Zell-zu-Zell-Fähigkeit des interessierenden Fachgebiets. Sowie die Transkripte der Zellwandlokalisation.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Menge an Informationen über die Statistik der Transkriptionsprozesse liefert. Um das Protokoll zu beginnen, züchten Sie E.Coli MG1655 in LB-Medium über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 260 U/min und 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag verdünnen Sie die Übernachtkultur bei eins bis 100 in frischem Medium und messen Sie ihre optische Dichte in einem Spektralphotometer bis zu einem Wert von 0,2 bis 0,4.
Anschließend pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 4.500 G bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand von allen Röhrchen. Geben Sie einen Milliliter 1XPBS in jedes Röhrchen und suspendieren Sie das Pellet erneut, um die Aggregation von Zelle zu Zelle zu minimieren.
Fügen Sie dann vier Milliliter Fixierungspuffer hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen vorsichtig ein. Inkubieren Sie die Proben in einem Orbitalschüttler. Suspendieren Sie das Pellet erneut, um die Zellaggregation zu minimieren, die die Zellbildgebung beeinträchtigen kann.
Nach der Inkubation pelletieren Sie die Zellen, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter 1XPBS hinzu. Übertragen Sie die Suspensionen auf 1,8 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit konischem Boden. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Beginnen Sie mit der Permeabilisierung der Bakterien, indem Sie den Überstand vorsichtig entfernen. Verwenden Sie Pipetten mit kleinem Volumen, um die gesamte Flüssigkeit außerhalb des Pellets zu entfernen. Als nächstes suspendieren Sie das Pellet wieder in 300 Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser.
Fügen Sie 350 Mikroliter hochwertiges absolutes Ethanol hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Fügen Sie weitere 350 Mikroliter Ethanol hinzu und mischen Sie erneut. Drehen Sie dann die Probe mit dem Röhrchenrotator eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 20 U/min.
Pelletieren Sie die Zellen aus der Permeabilisierung. Nach dem Zentrifugieren den Überstand entfernen. Geben Sie einen Milliliter 20%Waschpuffer zu den Proben.
Lassen Sie sie einige Minuten stehen. Anschließend werden die Pelletzellen sieben Minuten lang bei 750 G und vier Grad Celsius zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig und verwenden Sie Pipetten mit kleinem Volumen, um die gesamte Flüssigkeit außerhalb des Pellets zu entfernen.
Geben Sie dann die Stammlösung des Oligonukleotidsondensatzes zum Hybridisierungspuffer aliquot, so dass die endgültige Oligonukleotidkonzentration 250 Nanomolar beträgt, und wirbeln Sie das Röhrchen kräftig auf. Suspendieren Sie die Proben in 50 Mikrolitern Hybridisierungspuffer, der die Oligonukleotidsonden enthält, und vermeiden Sie gleichzeitig die Bildung von Blasen. Lassen Sie die Proben über Nacht im Dunkeln auf einem Heizblock bei 30 Grad Celsius.
Um das Waschen vorzubereiten, besorgen Sie sich für jede Probe ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das abgebildet werden soll. Geben Sie einen Milliliter Waschpuffer in jedes Röhrchen. Geben Sie 10 bis 15 Mikroliter aus den hybridisierten Proben in das neue Röhrchen, das den Waschpuffer enthält.
Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Proben noch zwei weitere Male.
Suspendieren Sie das Pellet wieder in 25 Mikrolitern Waschpuffer. Bereiten Sie ein Agarose-Gel vor, indem Sie 150 Milligramm Agarose zu 10 Millilitern 2X SSC-Puffer hinzufügen. Erhitzen Sie die Lösung jedes Mal 10 bis 15 Sekunden lang in der Mikrowelle, bis sich Agarose vollständig aufgelöst hat.
Legen Sie dann die Tube zum Abkühlen für ein paar Minuten beiseite. Platzieren Sie als Nächstes einen trennenden Silikonrahmen auf der Folie, so dass die Mitte der Folie freiliegt. Platzieren Sie einen 10 Millimeter breiten und ein bis zwei Millimeter dicken starren Ring in der Mitte des Objektträgers.
Geben Sie eine kleine Menge Gel zur Versiegelung in die Mitte und warten Sie einige Minuten, bis das Gel ausgehärtet ist. Fügen Sie dann mehr Gel hinzu, bis eine hohe Kuppelform entsteht. Warten Sie etwa 10 Minuten, bis das Gel ausgehärtet ist, und entfernen Sie den Ring.
Geben Sie 10 Mikroliter gewaschene Bakterienzellen auf das Gel und versiegeln Sie es mit einem Deckglas mit der Nummer Null. Bewahren Sie die Probe im Dunkeln auf, um ein Ausbleichen zu verhindern. smFiSH-Messungen von E.coli-Zellen zeigen den Grad der galK-Induktion als Reaktion auf variable extrazelluläre D-Fucose-Konzentrationen.
Das Hintergrundsignal wird durch einen galK deleted strain oder delta galK JW0740 als Negativkontrolle angezeigt. In den meisten Zellen sind zahlreiche Flecken zu sehen. Entspricht einzelnen oder wenigen galK-Transkripten, wenn der Bakterienkultur zwei millimolare D-Fucose zugesetzt werden.
Während einige Flecken in Abwesenheit von extrazellulärer D-Fucose zu sehen sind. Ein weiteres Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls liefert das sodB-Gen mit Fluoreszenz- und Phasenkontrastbildern von smFiSH in einem Wildtyp oder einem JW1648 sodB-deletierten Stamm. Proben, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, können auch mit STORM abgebildet werden, was eine genaue Präzision der Transkripte in der Zelle ermöglicht.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Systembiologie den Weg, um die Statistik von Transkriptionsereignissen in einzelnen Zellen zu erforschen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Markierung einzelner Boten-RNA (mRNA) Transkripte mit fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsexperimenten (smFISH) in E. coli. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung einzelner mRNA-Moleküle in fixierten Einzelzellen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Systembiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine leistungsfähige Visualisierungsmethode.
- Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Transkriptionsprozesse auf Einzelzellebene.
- Das Verständnis von mRNA-Lokalisierung und -Quantifizierung ist entscheidend für die Systembiologie.
- E. coli dient als Modellorganismus für diese Experimente.
Zweck der Studie
- Um einzelne mRNA-Transkripte in E. coli zu markieren.
- Um die mRNA-Lokalisierung mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden zu visualisieren.
- Um das Verständnis der transkriptionellen Variabilität zwischen Zellen zu verbessern.
Verwendete Methoden
- E. coli MG1655 über Nacht in LB-Medium kultivieren.
- Die Übernachtkultur in frischem Medium verdünnen.
- Optische Dichte messen, um geeignete Wachstumsbedingungen sicherzustellen.
- Fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden für smFISH-Analyse anwenden.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Markierung einzelner mRNA-Transkripte.
- Visualisierung der mRNA-Lokalisierung in fixierten Zellen.
- Quantifizierung transkriptioneller Prozesse auf Einzelmolekülebene.
- Einblicke in die Zell-zu-Zell-Variabilität der Transkriptexpressions.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen robusten Ansatz für die Untersuchung von mRNA-Dynamik.
- Sie liefert wertvolle Informationen für das Gebiet der Systembiologie.
- Diese Technik kann auf verschiedene Forschungsfragen bezüglich der Genexpression angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
