Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Das übergeordnete Ziel dieses Fluoreszenzbildgebungsansatzes ist es, die Halbwertszeit eines Proteins von Interesse in einzelnen lebenden Zellen mit Hilfe eines SNAP-Tags zu bestimmen. Zelluläre Proteine werden in großem Umfang umgedreht, wobei die Synthese- und Abbauraten für jedes Protein spezifisch sind und physiologischen Regulierungen unterliegen. Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Bestimmung der Proteinhalbwertszeit sind jedoch entweder auf Populationsdurchschnitte von Läusezellen beschränkt oder erfordern die Verwendung von Proteinsynthesehemmern.

In diesem Video zeigen wir, wie ein SNAP-Tag in Kombination mit einer Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zur Messung von Proteinhalbwertszeiten in lebenden Zellen verwendet werden kann. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine Einzelzellauflösung erreicht und somit eine Abschätzung für die Heterogenität der Halbwertszeiten in einer Population von kultivierten Zellen ermöglicht. Das hier vorgestellte experimentelle Verfahren kann auf jede Art von adhärenten kultivierten Zellen angewendet werden, die ein Protein von Interesse exprimieren, das mit einem SNAP-Tag fusioniert ist.

Dies kann entweder durch endogenes Protein-Tagging oder durch Überexpression von getaggten Proteinen erreicht werden. Der SNAP-Tag ist eine mutierte Version des DNA-Reparaturenzyms O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase, das spezifisch mit Benzylguanin reagiert, das an molekulare Sonden gekoppelt werden kann. Daher kann jedes SNAP-tag-Fusionsprotein irreversibel mit einem für Fluoreszenzzellen durchlässigen Farbstoff markiert werden.

Beim Auswaschen des Restfarbstoffs zerfällt die markierte Proteinpopulation exponentiell und die Halbwertszeit des entsprechenden Proteins kann abgeleitet werden. In diesem Video verwenden wir embryonale Stammzellen, die enge Kolonien bilden, wenn sie klassisch auf mit Gelatine überzogenen Schalen gezüchtet werden. Um ihnen zu ermöglichen, als Monoschicht von Zellen zu wachsen und dadurch eine Einzelzellauflösung für Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente zu erreichen, kultivierten wir sie auf einschlusshaftenden beschichteten Platten, wodurch die Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen reduziert werden, die durch zelluläre einschließende Ablagerungen vermittelt werden, die an der Plasmamembran exprimiert werden.

Verdünnen Sie die rekombinante Inc, die an fünf Nanogramm pro Mikroliter in PBS haftet, und fügen Sie 30 Mikroliter verdünntes Inc, das pro Ventil haftet, in eine 96er Ventilplatte hinzu, die für die Bildgebung geeignet ist. Vermeiden Sie ausgiebiges Pipettieren, da das Anhaften von rekombinanten Einschlüssen sehr zerbrechlich ist. Inkubieren Sie eineinhalb Stunden lang bei 37 Grad.

Aspirieren Sie die anhaftende Lösung, waschen Sie sie einmal mit 100 Mikrolitern PBS und fügen Sie bis zu 200 Mikroliter vorentwurmtes ESL-Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie ESL-Linien, die ein Protein von Interesse exprimieren, das mit dem SNAP-Tag fusioniert ist. Waschen Sie die Zellen mit fünf ml PBS.

Fügen Sie dann zwei ml Tripson hinzu und inkubieren Sie vier Minuten lang bei 37 Grad. Fügen Sie vier ml ESL-Nährmedium hinzu, suspendieren Sie es erneut und schleudern Sie es vier Minuten lang bei 1000 t herunter. Den Überstand aspirieren, in frischem Medium wieder suspendieren und die Zellen zählen.

Setzen Sie 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter in die einschlusshaftende beschichtete Speicherfolie ein. Fahren Sie 24 Stunden nach dem Einsetzen der Zellen mit der SNAP-Farbstofffärbung fort. Verdünnen Sie den Zellfarbstoff in ELS-Kulturmedium auf die zuvor festgelegte optimale Konzentration.

Aspirieren Sie das Medium mit einer Pipette und fügen Sie vorsichtig 50 Mikroliter des verdünnten SNAP-Farbstoffs hinzu. 30 Minuten bei 37 Grad inkubieren. Aspirieren Sie den Farbstoff und waschen Sie ihn dreimal mit 200 Mikrolitern PBS vor der Wurmkur.

Fügen Sie 200 Mikroliter ESL-Nährmedium hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad. Führen Sie die Waschschritte durch vorsichtiges Pipettieren durch und verwenden Sie keinen automatischen Aspirator, da sich die Zellen leicht ablösen. Wiederholen Sie die gleichen Waschschritte noch zweimal und fügen Sie dann 200 Mikroliter Bildgebungsmedium hinzu.

Verwenden Sie phenolrotfreies Medium, um den Blütenhintergrund zu reduzieren. Verwenden Sie ein Mikroskop, das eine kontrollierte Temperatur und CO2 ermöglicht. Stellen Sie die Temperatur vor der Verwendung auf 37 Grad und den CO2-Gehalt auf fünf Prozent ein und lassen Sie sie ein bis zwei Stunden lang ausgleichen.

Setzen Sie die Platte in das Mikroskop ein und wählen Sie den für die Bildgebung geeigneten Punkt aus. Die Hellfeldbilder zeigen die ESL, die in einer Monoschicht an einer anhaftenden beschichteten Schale befestigt ist. Wählen Sie das Ziel aus, ein 20X-Ziel ist für diese ESL-Größe geeignet.

Wählen Sie die Beleuchtungseinstellungen für den Fluoreszenzkanal aus, der aufgenommen werden soll. Passen Sie die Laserleistung und die Belichtung an, um ein starkes Signal zu erhalten, da es im Laufe des Films abnimmt. Wählen Sie die Aufnahmeparameter für das Zeitrafferexperiment aus.

Für Proteine mit erwarteten Halbwertszeiten von zwei bis zwanzig Stunden wählen Sie Erfassungszeiten von 12 bis 24 Stunden mit Zeitintervallen von 15 Minuten. Starten Sie das Imaging-Experiment. Verwenden Sie die FIJI-Software für die Verarbeitung und Analyse des Films.

Sammeln Sie die erfassten Bilder als Stapel und verformen Sie ihn. Verwenden Sie die Funktion "Hintergrund subtrahieren" FIJI, um den Hintergrund aus allen Bildern im Stapel zu entfernen. Wählen Sie eine interessierende Zelle aus, zeichnen Sie mithilfe der FIJI-Symbolleiste einen Interessenbereich um sie herum, und fügen Sie den Interessenbereich zum ROI-Manager hinzu.

Fahren Sie mit dem nächsten Frame fort und wiederholen Sie die vorherigen Aktionen. Verfolgen Sie die gewünschte Zelle im Verlauf des Films, und speichern Sie den ROI-Wert für jede verfolgte Zelle. Klicken Sie auf Messen, um Werte für die mittlere Intensität und den Bereich der ROIs zu erhalten.

Um den lokalen Hintergrund zu schätzen, fügen Sie für jeden Zeitrahmen einen Interessenbereich in der Nähe der interessierenden Zelle hinzu. Klicken Sie abschließend auf Messen, um Werte für die mittlere Hintergrundintensität zu erhalten. Berechnen Sie zunächst die mittlere Intensität der Zelle, indem Sie den erhaltenen Wert mit der mittleren Intensität des zellulären ROI mit ihrer Fläche multiplizieren.

Fahren Sie dann mit der Berechnung des integrierten Hintergrundwerts der Zelle fort, indem Sie die mittlere Intensität des Hintergrund-ROI mit der Fläche des zellularen ROI multiplizieren. Um schließlich einen hintergrundkorrigierten Wert für die integrierte Intensität der Zelle zu erhalten, subtrahieren Sie den Wert der integrierten Hintergrundintensität von dem integrierten zellulären Intensitätswert. Um eine durchschnittliche Halbwertszeit der Zellpopulation zu erhalten, normalisieren Sie die erhaltenen Werte auf den Intensitätswert des ersten Frames für jede Zelle.

Dadurch wird sichergestellt, dass jede Zelle unabhängig von ihrer absoluten Floreszenzintensität mit dem gleichen Gewicht zum durchschnittlichen Halbwertszeitwert beiträgt. Nach der Zellteilung werden beide Tochterzellen getrennt verfolgt und ihre integrierten Intensitäten nach Hintergrundsubtraktion addiert, um die Proteinverdünnung während der Zellteilung zu berücksichtigen. Speichern Sie die ROI-Sätze für beide Tochterzellen.

Für die Abschätzung der Proteinhalbwertszeit verwenden Sie das Kurvenanpassungstool in MATLAB. Der Proteinzerfall folgt einer Exponentialfunktion, wobei F(x) die Blütenintensität zum gegebenen Zeitpunkt, a" die Anfangsintensität und b" die Zerfallsrate ist. Nachdem die Werte für die Zerfallsrate b" aus der Anpassung erhalten wurden, kann die Halbwertszeit berechnet werden, indem der Logarithmus von zwei durch b" dividiert wird. Dieser Film zeigt den Zerfall der SNAP-Farbstofffloreszenz in einer doxycyclin-unbrauchbaren opt vier SNAP-tag-Fusionszelllinie.

Das beobachtete Fluoreszenzsignal hängt von der verwendeten Zelllinie, dem Expressionsniveau des entsprechenden Proteins von Interesse sowie den Eigenschaften des verwendeten Farbstoffs ab. Für Proteinzerfallsexperimente ist es wichtig, eine adäquate SNAP-Farbstoffkonzentration zu verwenden. Die Konzentration sollte hoch genug sein, um zu Beginn des Zeitraffers ein helles Blütensignal zu erzeugen.

Die Verwendung zu hoher Farbstoffkonzentrationen kann jedoch dazu führen, dass auch nach dem Waschen Farbreste im Medium verbleiben. Der freie Farbstoff könnte anschließend im Laufe des Films an neu produzierte SNAP-Tag-Moleküle binden, was die Zerfallskurve verzerren würde. Daher ist es entscheidend, die SNAP-Farbstoffkonzentration durch das Testen verschiedener Verdünnungen zu optimieren.

Diese Abbildung zeigt die Zerfallskurven für acht verschiedene Konzentrationen eines Fluoreszenz-SNAP-Farbstoffs, der an einer nicht verwendbaren Doxycyclin-Zelllinie getestet wurde. Eine anfängliche Farbstoffkonzentration von drei Mikromolaren wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Bildgebung lebender Zellen gewählt, und eine serielle Verdünnung von eins bis drei wurde durchgeführt, bis eine Konzentration von 1,4 Nanomolar erreicht wurde. Bei den beiden höchsten Konzentrationen nimmt das Signal nicht ab, während der beobachtete Zerfall bei niedrigeren Konzentrationen einer exponentiellen Kurve folgt.

In diesem Beispiel wurde eine optimale Konzentration von 12 Nanomolar gewählt, da diese Konzentration dafür sorgt, dass nach dem Waschen nur minimale Mengen an Restfarbstoff im Medium verbleiben, das Fluoreszenzsignal jedoch immer noch hell genug ist, um eine klare Zerfallskurve zu beobachten. Das beschriebene Protokoll liefert eine Schätzung der Zell-zu-Zell-Variabilität und der Halbwertszeit für jedes gegebene Protein, das mit dem SNAP-Tag fusioniert ist. Diese Abbildung zeigt den Zerfall einzelner Zellen und den Populationsdurchschnitt für drei verschiedene unbrauchbare Doxycyclin-SNAP-Tag-Fusionszelllinien.

Nanog" und "Oct4" sind mit durchschnittlichen Halbwertszeiten von 2,9 und 4,8 Stunden eher kurzlebig. Während Srsf11" mit einer durchschnittlichen Halbwertszeit von 25,3 Stunden länger lebt. Die Boxplots zeigen die Verteilung der Halbwertszeiten für die drei Proteine.

Wir haben gezeigt, dass die Verwendung eines SNAP-Tags in Kombination mit der Fluoreszenz-Zeitraffermikroskopie die Bestimmung der Halbwertszeit eines beliebigen Proteins von Interesse ermöglicht. Die Einzelzellzerfallsmessungen liefern eine Abschätzung für die Heterogenität der Halbwertszeiten in einer Zellpopulation, die bei anderen Methoden zur Bestimmung der Proteinhalbwertszeiten entfällt. Einer der wichtigsten Schritte bei der Verwendung eines SNAP-Tags zur Überwachung des Proteinzerfalls besteht darin, sicherzustellen, dass nach dem Waschen kein ungebundener Farbstoff im Medium oder in den Zellen zurückbleibt.

Andernfalls könnte es später im Verlauf des Experiments an neu produzierte SNAP-Tag-Moleküle binden und dadurch die Zerfallskurve beeinträchtigen. Dies wird zum einen dadurch erreicht, dass alle beschriebenen Waschschritte sorgfältig durchgeführt werden. Auf der anderen Seite sollte die SNAP-Farbstoffkonzentration so niedrig wie möglich gehalten werden, aber dennoch in einem Bereich liegen, der es ermöglicht, ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen.

Die SNAP-Farbstoffkonzentration sollte für jedes Experiment entsprechend der Zelllinie und der Art des verwendeten Farbstoffs optimiert werden. Es ist zwar möglich, dass der SNAP-Tag in einigen Fällen die Halbwertszeit von Kandidatenproteinen verändert, aber wir sehen keine Hinweise auf solche Effekte, da die ermittelten Halbwertszeiten der getesteten Kandidatenproteine eng mit den veröffentlichten Werten übereinstimmen. Um einen Effekt des SNAP-Tags auf den Proteinabbau weiter auszuschließen, wäre eine Möglichkeit, die Proteinsynthese mit Cycloheximid zu blockieren und Toiletten-Blots zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen, wobei ein Antikörper verwendet wird, der das einheimische Protein erkennt.

Und um den Zerfall des SNAP-Tag-Kandidatenproteins direkt mit der nicht markierten indigenen Version zu vergleichen.