Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, kontaminierende Nuklease-Aktivität während der Proteinreinigung zu identifizieren und zu entfernen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Retrovirologie zu beantworten, beispielsweise hinsichtlich Biochemie, Struktur und Dynamik der Integration. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Identifizierung und Entfernung kontaminierender DNA-Nuklease-Aktivität von einem Zielrekombinantprotein während der Reinigung ermöglicht.

Beginnen Sie damit, einen Pellet aus E.coli, der das prototypische Foamy-Virus-Integrase exprimiert, auf Eis aufzutauen. Verwenden Sie ein Ultraschallgerät mit einem Biohorn mit 0,5-Zoll-Durchmesser und einer konisch zulaufenden Mikrospitze mit 0,125-Zoll-Durchmesser, um 30 Sekunden lang bei 30 % Amplitude zu sonifizieren, wobei sich die Probe auf Eis befindet. Überführen Sie nach der Sonifizierung die Zellprobe in ein kaltes Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 60 Minuten bei 120.000 ×g und vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation sollte ein deutliches Pellet sichtbar sein, und das Überstand kann eine gelbe Farbe aufweisen. Überführen Sie den Überstand in ein kaltes 50-Milliliter-Kegelrohr. Bereiten Sie anschließend die 110 Millimeter lange, fünf Millimeter durchmessende FPLC-Säule mit einem 1,5-Milliliter-Nickel-beladenen Harz vor.

Verbinden Sie zunächst die Säule mit dem FPLC-Gerät und leiten Sie Puffer zu. Das Gerät sollte in Echtzeit Daten zur Leitfähigkeit und zur UV-Absorption bei 280 Nanometern aufzeichnen. Die Messwerte für Leitfähigkeit und UV sollten sich stabilisieren.

Falls erforderlich, weiterhin Puffer durch die Säule leiten, bis die Messwerte stabil sind. Mithilfe einer Superloop die Proteinstichprobe mit einer Flussrate von 0,15 Millilitern pro Minute und einer maximalen Druckbegrenzung von 0,5 Megapascal auf die Säule auftragen. Die Superloop an das AKTA-FPLC-Gerät anschließen.

Nach der Waschung der Säule und der Elution der Proteine werden 15-Mikroliter-Aliquote des anfänglichen Durchlaufs, der Waschfraktion und der Peak-Fraktionen mit 280-Nanometer-Absorption entnommen und jeweils 15 Mikroliter 2X SDS-PAGE-Probelösungspuffer zugegeben. Die Proben drei Minuten lang erhitzt. Je 10 Mikroliter jeder Probe zusammen mit vier Mikrolitern vorgefärbten Proteinstandards auf 10 %ige SDS-PAGE-Gele aufgetragen.

Das Gel visuell darauf überprüfen, welche Fraktionen nahezu reines prototypisches Foamy-Virus-Integrase zu enthalten scheinen. Diese Fraktionen vereinigen und während des Pipettierens das Volumen notieren. Dies sind typischerweise acht bis zehn Milliliter.

Unter Verwendung eines Spektrophotometers die UV-Absorption bei 280 Nanometern der kombinierten Fraktionen messen und die Gesamtmenge des Prototyp-Foamy-Virus-Integraseproteins berechnen. Eine typische Ausbeute liegt bei etwa 10 Milligramm pro Liter induzierter Kultur. Um den Hexahistidin-Tag zu entfernen, das Prototyp-Foamy-Virus-Integrase mit einer Endkonzentration von 10 Millimolar DTT und 0,1 Millimolar EDTA versetzen.

Dann 15 Mikrogramm humanen Rhinovirus-3C-Protease pro Milligramm prototypisches Foamyvirus-Integrase zugeben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Um eine Heparin-Affinitätschromatographie-Fraktionierung des prototypischen Foamyvirus-Integrase durchzuführen, die Natriumchlorid-Konzentration der Probe durch Zugabe von 1,5 Volumina Puffer C auf 200 Millimolar senken. Anschließend die verdünnte Probe des prototypischen Foamyvirus-Integrase mit einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute und einer maximalen Druckbegrenzung von einem Megapascal auf die Heparin-Sepharose-Säule auftragen. Nach der Spülung der Säule und der Sammlung des Gradienten sowie der abschließenden Spülung Belastung, Durchfluss, Spülfraktionen und Fraktionen mittels 8 %iger SDS-PAGE analysieren.

Analysieren Sie anschließend die Fraktionen, indem Sie das Gel mit Coomassie-Blau anfärben. Die Integrase des prototypischen Foaamy-Virus und die verunreinigende Nuklease weisen unterschiedliche Affinitäten für die Heparin-Sepharose-Chromatographie auf. Identifizieren Sie Heparin-Sepharose-Fraktionen, die nahezu reine Integrase des prototypischen Foamy-Virus zu enthalten scheinen, um sie im Nuklease-Assay zu verwenden.

Um den Nuklease-Assay zu beginnen, mischen Sie drei Mikroliter Heparin-Fraktion mit 50 Nanogramm dreikilobasen-supercoiled Plasmid-DNA und Reaktionspuffer zu einem Endvolumen von 15 Mikrolitern. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten. Stoppen Sie die Reaktion mit einem Milligramm pro Milliliter Proteinase K und 0,5 % SDS und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie anschließend 3,5 µL 6X-Ladefarbstoff zu den Nuklease-Assay-Reaktionen hinzu und geben Sie das gesamte Volumen auf ein 1 %ige Agarosegel. Führen Sie das Gel eine Stunde lang bei 100 Volt und Raumtemperatur durch, oder bis die Farbstofffront das Ende des Gels erreicht hat. Nach Abschluss der Elektrophorese sollte ein fluoreszenzbasierendes Bild des Gels zeigen, dass die lineare DNA entsprechend ihrer Größe bei drei kb wandert, die supercoiled DNA schneller bei etwa zwei kb wandert und die entspannte zirkuläre DNA langsamer bei knapp 3,5 kb wandert.

Unter Verwendung von Bildanalyse-Software berechnen Sie das Pixelvolumen der supercoilierten, linearen und entspannten kreisförmigen Plasmid-DNA in jeder Bahn. Bezeichnen Sie die Summe der Pixelvolumina dieser drei DNA-Formen als Gesamt-DNA-Wert und verwenden Sie diesen, um den Prozentsatz an linearer und entspannter kreisförmiger DNA zu berechnen. Fraktionen, die kontaminierende Nuklease enthalten, weisen einen höheren Prozentsatz an linearer und entspannter kreisförmiger DNA im Vergleich zur Negativkontrolle auf.

Kombinieren Sie die Heparin-Sepharose-Fraktionen, die keine kontaminierende Nukleaseaktivität aufweisen, und überführen Sie sie in Dialysegefäße mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von sechs bis acht Kilodalton und einem Durchmesser von 10 Millimetern. Dialysieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius gegen einen Liter Dialyselösung. Am nächsten Tag gewinnen Sie die nukleasefreie Probe des Prototyp-Foamyvirus-Integrases aus dem Dialysegefäß.

Messen Sie die Absorption bei 280 Nanometern und berechnen Sie die endgültige Protein-Konzentration. Portionieren Sie das Protein und schockgefrieren Sie es in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die Aliquote dann bei minus 80 Grad Celsius.

Der Nuklease-Assay wurde wie in diesem Video dargestellt durchgeführt. Zu den Negativkontrollen gehören Plasmid-DNA ohne Protein und eine frühere Reinigung des Wildtyp-Protyp-Foamy-Virus-Integrases, von dem bekannt ist, dass es frei von Nuklease ist. Eine Positivkontrolle für kontaminierende Nuklease-Aktivität ist eine frühere Rein游戏副本

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie biochemische Assays oder Einzelmolekül-Abbildungen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen, beispielsweise zur Enzymkinetik und -dynamik, zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man nukleaseaktive Kontaminationen von einem rekombinanten Protein identifiziert und entfernt.