Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die stabile Transfektion von Hepatozyten in vivo, mit Vektorkonstrukten für die induzierbare Gen- oder shRNA-Expression. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Leberforschung zu beantworten. So können beispielsweise Mechanismen bei Leberkrebs und der Regeneration untersucht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die kombinierte Expression von CreER zusammen mit einer induzierbaren transgenen R shRNA-Expression in Maus-Hepatozyten in vivo, die durch hydrodynamische Schwanzveneninjektion erreicht wird. Das Verfahren wird von Eric Hübner, einem Medizinstudenten aus unserem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Kombination von 150 Nanogramm Eintrittsvektor, der die kurze Haarnadel-RNA für das Zielprotein enthält, mit 150 Nanogramm pTC-Tet-Vektor und TE-Puffer zu einem Gesamtvolumen von acht Mikrolitern.

Übertragen Sie dann die LR-Klonase-Enzymmischung II auf Eis und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Während der Inkubation zweimal vortexen. Geben Sie dann zwei Mikroliter LR-Klonase-Enzymmischung II zur Reaktion und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius.

Nach der Inkubation stoppen Sie die Reaktion, indem Sie einen Mikroliter Proteinase-K-Lösung hinzufügen. Dann zehn Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Transformieren Sie als Nächstes Stbl3-kompetente Bakterien mit zwei Mikrolitern Klonierungsmischung unter Verwendung eines Standard-Hitzeschockprotokolls.

Nach dem Plattieren der Umwandlung auf ampicillinhaltigen Agarplatten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag wählen Sie einzelne Kolonien aus und impfen kleine Mengen bakterielles Wachstumsmedium für die Inkubation über Nacht. Nach der Isolierung der DNA und der Bestätigung der Vektorintegrität durch Sanger-Sequenzierung bereiten Sie die DNA-Vorbereitungen des Konstrukts im Maxi-Maßstab für die Injektion vor.

Beginnen Sie mit dem Wiegen der Mäuse. Bereiten Sie dann eine sterile Kochsalzlösung vor, die 15 Mikrogramm pro Milliliter endotoxinfreies Dornröschen-Vektorkonstrukt und ein Mikrogramm pro Milliliter endotoxinfreies pchsB5 enthält. Bereiten Sie genügend Lösung vor, um jeder Maus ein Volumen zu injizieren, das 10 % ihres Körpergewichts entspricht.

Füllen Sie eine sterile 3-Milliliter-Spritze mit dem erforderlichen Volumen für eine Maus und setzen Sie eine 27-Gauge-Nadel auf. Nachdem Sie eine angemessene Menge Seidenpapier hinzugefügt haben, um so wenig Platz für Bewegung, aber genügend Platz zum Atmen zu lassen, führen Sie die Maus in einen geeigneten Fixierapparat mit Atemlöchern ein. Erwärmen Sie den Schwanz mit einer Infrarotlampe 30 bis 60 Sekunden lang und achten Sie dabei sorgfältig auf Anzeichen von Überhitzung, wie z. B. schnelle Bewegungen des Schwanzes oder andere Anzeichen von Unruhe.

Reinigen Sie dann den Schwanz mit einem Alkoholtupfer. Führe die Nadel fast waagerecht in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen in der Nähe des Schwanzansatzes ein. Bei erfolgreicher Platzierung kann eine kleine Menge Blut in den Nadelkegel zurückfließen.

Injizieren Sie das gesamte Volumen innerhalb von acht bis zehn Sekunden in die Schwanzvene. Entfernen Sie die Maus nach der Injektion sofort aus dem Rückhaltesystem. Komprimieren Sie die Injektionswunde mindestens 30 Sekunden lang mit steriler Gaze oder bis die Blutung nachlässt.

Eine erfolgreiche hydrodynamische Schwanzveneninjektion ist entscheidend für die Transfektion und hängt insbesondere von der Geschwindigkeit, dem Volumen und der Zeit der Injektion ab. Um die intravenöse Injektion zu erleichtern, stellen Sie sicher, dass die Mäuse am Tag der Injektion nicht gestresst oder dehydriert sind. Bringen Sie die Maus nach 30 bis 60 Minuten in einem Bergungskäfig wieder in ihren ursprünglichen Käfig zurück.

Initiieren Sie die Induktion der Cre-Rekombinase 10 bis 15 Tage nach der Injektion der Schwanzvene, um die Beseitigung nicht integrierter Vektoren zu ermöglichen. Lösen Sie zehn Milligramm Tamoxifen in 40 Mikrolitern Ethanol auf und inkubieren Sie bei 55 Grad Celsius für zehn Minuten unter Schütteln. Mehrmals vortexen, bis sich das Tamoxifen aufgelöst hat.

Dann 960 Mikroliter Maisöl hinzufügen und fünf Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren. Ziehen Sie die Lösung nach dem Abkühlen mit einer 20-Gauge-Nadel in eine 1-Milliliter-Insulinspritze. Wechsle dann zu einer 27er Nadel.

Um zu injizieren, schieben Sie die Maus zuerst ab, indem Sie den Hals der Maus vorsichtig mit dem Daumen und dem zweiten Finger greifen und den Schwanz zwischen der Handbasis und dem vierten und fünften Finger fixieren. Injizieren Sie dann intraperitoneal 0,1 Milliliter der Lösung in den linken unteren Quadranten des Bauches. Bei Experimenten von weniger als zehn Tagen ist Doxycyclin kontinuierlich über das Trinkwasser gemäß dem folgenden Protokoll zu verabreichen.

Zuerst fünf Gramm Saccharose in 100 Milliliter Leitungswasser auflösen und autoklavieren. Lösen Sie dann 100 Milligramm Doxycyclinhyclat in fünf Millilitern der Saccharoselösung in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf. Verwenden Sie anschließend eine 10-Milliliter-Spritze, um die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter steril zu filtrieren.

Geben Sie dann die gefilterte Doxycyclin-Lösung zu den restlichen 95 Millilitern Saccharoselösung und geben Sie die Lösung der Maus anstelle des Trinkwassers zu. Täglich kontrollieren und sofort austauschen, wenn die Lösung trüb wird, da dies auf eine bakterielle Überwucherung hinweist. Bereiten Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel mit einem Milliliter 4%iger Paraformaldehydlösung vor.

Verwenden Sie eine Präparierschere und eine anatomische Pinzette, um eine mediane Laparotomie durchzuführen und die Leber der euthanasierten Maus freizulegen. Verschieben Sie den Dünndarm nach rechts, um die Pfortader und die untere Hohlvene freizulegen. Führen Sie die Nadel der vorbereiteten Spritze in die untere Hohlvene ein und schneiden Sie die Pfortader.

Injizieren Sie langsam einen Milliliter PFA, um das Lebergewebe zu überschwemmen und autofluoreszierende rote Blutkörperchen zu entfernen. Nachdem Sie die Leber entfernt haben, spülen Sie sie in Wasser ab und geben Sie sie in fünf bis zehn Milliliter 4%ige PFA-Lösung, um sie vor dem Schnitt zu fixieren. Die Injektion eines Transposon-Konstrukts, das die konstitutive Expression einer induzierbaren Cre-Rekombinase mit der induzierbaren Expression eines Transgens oder einer shRNA der Wahl kombiniert, in Cre-Reportermäuse zeigte eine robuste Expression des GFP-Reportergens nach Aktivierung der Cre-Rekombinase durch Tamoxifen.

Nach der Behandlung mit Doxycyclin kann die induzierbare Transgenexpression durch geeignete Antikörper in transfizierten Hepatozyten sichtbar gemacht werden. Für die induzierbare shRNA-Expression kann die zytoplasmatische GFP-Expression, die durch Immunfärbung nachgewiesen wird, als Surrogatmarker für die shRNA-Expression verwendet werden. Es wurde ein Transposon-Konstrukt injiziert, das eine Luciferase-Expressionskassette unter der Kontrolle eines leberspezifischen Promotorkonstrukts beherbergt.

Nach der Injektion mit Luciferin wurden die Mäuse zwei Wochen nach der hydrodynamischen Schwanzveneninjektion mit einem In-vivo-Bildgebungssystem abgebildet. Die Bildgebung zeigte eine robuste und stabile Luciferase-Biolumineszenz in der Leber 15 Tage nach der Injektion, was zeigt, dass das System erfolgreich eingesetzt werden kann, um das Vorhandensein transfizierter Zellen in vivo durch Biolumineszenz-Bildgebung zu verfolgen. Nach der Beherrschung können hydrodynamische Schwanzveneninjektionen in etwa 15 Minuten durchgeführt werden, während das gesamte Verfahren von der Klonierung unserer Injektion von Mäusen, der Induktion der transgenen R shRNA-Expression bis zur Vorbereitung der Leber etwa drei bis vier Wochen dauern wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Größe und Integrität der Sequenz der Plasmide im Auge zu behalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das pTC Tet-System mit Ihrer transgenen R-shRNA Ihrer Wahl auf ein beliebiges Crelux Pbase-Mausmodell anwenden können.