Name: Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Lernen Sie die stabile Transfektion von Maus-Hepatozyten in vivo mittels hydrodynamischer Schwanzveneninjektion mit induzierbaren Transposon-Vektoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Leberkrebsmechanismen und Regeneration.

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Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Krebshilfe, Deutschland (Grant-Nummer 111289, UE), Lucile Packard Foundation für die Gesundheit von Kindern (Ernest und Amelia Gallo ausgestattet Postdoctoral Fellowship - CTSA Grant-Nummer UL1 RR025744, UE) unterstützt. Wir danken Dr. Mark A. Kay für Vektor-Konstrukte und experimentelle Beratung und Dr. Julien Sage für Mäuse und experimentelle Unterstützung.

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurde vom zuständigen Behörden (Regierung von Oberbayern, München und Stanford institutionelle Tier Pflege und verwenden Ausschuss genehmigt Stanford, CA, USA). Eine Liste der alle Plasmide zum Klonen (Schritt 1 bis 4) ist in ergänzenden Tabelle S1 zur Verfügung gestellt.
1. Klonen ein Transgen konstitutive Genexpression
<ol><li>Design-Primer für Transgene Verstärkung13,14.</li>
	<li>Fügen Sie Restriktionsschnittstellen für PacI (TTAATTAA), 5'-Ende des Primers vorwärts. 5'-Ende des rückwärts-Primer Restriktionsschnittstellen für AscI (GGCGCGCC) oder FseI (GGCCGGCC) hinzufügen.</li>
	<li>Verstärken Sie Transgene durch PCR mit Hilfe von Bedingungen, die für die gewünschte Transgen14optimiert. Reinigen Sie mit einem im Handel erhältlichen DNA-Reinigung-Kit. Hinweis: Glühen Zeit richtet sich nach den Primer im Schritt 1.1 entworfen., Dehnung Zeit richtet sich nach der Länge des Konstrukts. Zum Beispiel für ein Konstrukt von 1.000 bp Länge Verwendung 60 s Dehnung Zeit.</li>
	<li>Verdauen Sie Transgen und Vektor für konstitutive gen Ausdruck15 mit jeweiligen Einschränkung Nukleasen (siehe Schritt 1.2) und Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 µL bei 37 ° C über Nacht. Zum Beispiel, verdauen Konstrukt mit 5 Einheiten PacI und 5 Einheiten FseI gegebenenfalls (siehe Schritt 1.2).</li>
	<li>Gel reinigen verdauten Vektor und Insert mit einem kommerziellen Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie eine standard Ligatur der 100 ng des Vektors und 100 – 1.000 ng Insert mit 400 U T4 Ligase bei 14 ° C 16 h Wärme inaktivieren bei 65 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Zuständigen Bakterien mit einer standard-Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.</li>
	<li>Platte auf Agar-Platten mit 100 µg/mL Ampicillin. Inkubation bei 30 ° C für 24 h.</li>
	<li>Wählen Sie einzelne Kolonien, Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Miniprep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und überprüfen Sie die Reihenfolge von Sanger-Sequenzierung17 (Sequenzierung Grundierung: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').</li>
	<li>Verwenden Sie positive Kolonien für Maxi Verstärkung von Plasmid DNA zu skalieren und reinigen, mit einem Endotoxin-freie Plasmid Vorbereitung Kit18 gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Konstrukt ist fertig für die Injektion, so fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>2. Klonen ein Transgen induzierbaren Genexpression
<ol><li>Design-Primer für Transgene Verstärkung13,14.</li>
	<li>5'-Ende des Primers vorwärts Restriktionsschnittstellen für SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) oder KpnI (GGTACC) hinzufügen. 5'-Ende des rückwärts-Primer Restriktionsschnittstellen für NotI (GCGGCCGC) oder XhoI (CTCGAG) hinzufügen.</li>
	<li>Verstärken Sie Transgene durch PCR mit Hilfe von Bedingungen, die für die gewünschte Transgen14optimiert. Reinigen Sie mit einem kommerziellen DNA-Reinigung-Kit.</li>
	<li>Die gereinigten Transgen und 4 µg Eintrag Vektors zu verdauen (pEN_TTmcs-Vektor, siehe Tabelle der Materialien)19 separat mit entsprechenden Einschränkung Nukleasen (siehe Punkt 2.2) und Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 µL bei 37 ° C über Nacht.</li>
	<li>Gel reinigen verdauten Vektor und Insert mit einem kommerziellen Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie standard Ligatur mit 100 ng des Vektors und 100 – 1.000 ng Insert mit 400 U T4 Ligase bei 14 ° C 16 h Wärme inaktivieren bei 65 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Zuständigen Bakterien mit einer standard-Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.</li>
	<li>Platte auf Agar-Platten mit 15 µg/mL Gentamicin. Inkubation bei 37 ° C 16 h.</li>
	<li>Wählen Sie einzelne Kolonien, Plasmid DNA zu reinigen und überprüfen einfügen durch Sequenzierung17 mit dem pCEP forward Primer: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'. Hinweis: PCR auf einzelne Kolonien kann durchgeführt werden, ohne vorherige Reinigung mit Primer pCEP vorwärts und pCEP umkehren (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Dieser Schritt kann nützlich für die Vorauswahl der positiven Kolonien.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>(3) Klonen von einer MiR ShRNA für induzierbarer Gene Knock-down
<ol><li>MiR-ShRNA Oligonukleotide nach dem Klonen Protokoll19pSLIK zu entwerfen. Tempern Sie und reinigen Sie Oligonukleotide und verdünnen Sie 01:20 in DdH2O.</li>
	<li>Digest 3 µg Eintrag Vektors mit 5 U BfuAI bei 50 ° C für 3 h dann inaktivieren die Reaktion bei 65 ° C für 20 Minuten. Hinweis: Wenn Co Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) gewünscht wird, verwenden Sie pEN_TTGmiRc19 , als ein Eintrag Vektor, sonst Verwendung pEN_TTmiRc219.</li>
	<li>Gel reinigen verdauten Vektor wie in Schritt 2.5. Führen Sie standard Ligatur der 100 ng des Vektors und 1 µL gereinigt und verdünnt ShRNA Oligonukleotide (Schritt 3.1) mit 400 U T4 Ligase bei Raumtemperatur für 1 h Wärme bei 65 ° C für 10 Minuten inaktivieren.</li>
	<li>Zuständigen Bakterien mit einer standard-Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.</li>
	<li>Platte auf Agar-Platten mit 15 µg/mL Gentamicin. Inkubation bei 37 ° C 16 h.</li>
	<li>Wählen Sie einzelne Kolonien, Plasmid DNA zu reinigen und überprüfen Einfügen von Sanger-Sequenzierung17 (Sequenzierung Grundierung: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 4 fort.</li>
</ol>4. recombinational Klonen um bereit für Injection-Klone zu erzeugen
<ol><li>Mix-150 ng Eintrag Vektors (aus Schritt 2 oder Schritt 3) und 150 ng von pTC-TET-Vektor-20.</li>
	<li>Hinzufügen ein Gesamtvolumen von 8 µL TE-Puffer (pH = 8).</li>
	<li>Die LR-Clonase-Enzym-Mix II (siehe Tabelle der Materialien) zu Eis, inkubieren 2 min. Vortex zweimal zu übertragen.</li>
	<li>Die Reaktion 2 µL der LR-Clonase-Enzym-Mix II hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 1 h.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 1 µL Proteinase K-Lösung. Inkubation bei 37 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Stbl3 zuständigen Bakterien mit 2 µL recombinational Klonen Mischung mithilfe einer standard Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.</li>
	<li>Platte auf Agar-Platten mit 100 µg/mL Ampicillin. Inkubation bei 30 ° C für 24 h.</li>
	<li>Wählen Sie einzelne Kolonien, reinigen Sie Plasmid-DNA mit Hilfe einer Endotoxin-freie Plasmid Vorbereitung Kit18 gemäß den Anweisungen des Herstellers zu und bestätigen Vektor Integrität durch Sanger-Sequenzierung17 (Sequenzierung Primer 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').</li>
	<li>Konstrukt ist fertig für die Injektion, fahren Sie mit Schritt 5 fort.</li>
</ol>5. Vorbereitung Lösung für hydrodynamische Tail Vene Injektion
Hinweis: Vorbereitung der Konstrukte für die konstitutiven und induzierbaren Genexpression in Schritt 1, 2, 3 und 4 beschrieben.
<ol><li>Injektion sterilen 0,9 % Kochsalzlösung vorbereiten (tun Sie nicht Gebrauch PBS). Verwenden Sie Volumen entspricht etwa 10 % des Körpergewichts Maus. Beispiel: für eine Maus mit einem Gewicht von 20 g, bereiten Sie 2 mL der Lösung vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Injektion Vektoren, die gereinigt wurden mit einem Endotoxin-freie Plasmid Reinigung Kit18 (siehe Schritt 1,8 oder 4,8, beziehungsweise).</li>
	<li>Fügen Sie 10 µg oder 15 µg von Endotoxin-freie Dornröschen Vektor Konstrukt (aus Schritt 1 Einsatz 10 µg aus Schritt 4 Verwendung 15 µg, beziehungsweise) und 1 µg von Endotoxin-freien pc-HSB521 pro mL steriler Kochsalzlösung.</li>
	<li>Shop-Lösung für bis zu 4 h bei 4 ° C. Nicht einfrieren.</li>
</ol>6. Durchführung der hydrodynamischen Tail Vene Injektion
<ol><li>Verwenden Sie eine einschränkende Injektionslösung Schweif Vene (kommerzielle oder aus einem 50 mL konische Rohr mit Löchern für die Atmung und die Rute bereit). Füllen Sie Boden des Röhrchens mit Seidenpapier.</li>
	<li>Zur Injektion verwenden Sie Mäuse von ca. 8 – 10 Wochen alt mit Gewichten von 20 – 25 g.</li>
	<li>Mäuse vor der Injektion zu wiegen und bereiten Injektionsvolumen nach dem Körpergewicht (entspricht 10 % des Körpergewichts, siehe Punkt 5.1). Bereiten Sie eine sterile 3 mL-Spritze mit einer 27 G-Nadel für Einspritzung und füllen sich mit der erforderlichen Menge.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in die Restrainer. Passen Sie die Höhe der Tissue-Papier (siehe Punkt 6.1), nur minimalen Raum für Bewegung lassen aber genügend Platz zum Atmen.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus regelmäßig atmet.</li>
	<li>Warm die Rute mit einer Infrarotlampe für 30-60 s. sorgfältig achten Sie auf Anzeichen einer Überhitzung.</li>
	<li>Reinigen Sie das Heck mit einem Alkoholtupfer.</li>
	<li>Stechen Sie die Nadel fast horizontal in einer der zwei seitlichen Schweif Venen in der Nähe der Schwanzwurzel. Hinweis: Wenn erfolgreich, könnte eine kleine Menge Blut zurück in den Konus der Nadel fließen. Es empfiehlt sich nicht aktiv abzusaugen, da jede zusätzliche Bewegung der Nadel zu seiner Vertreibung und/oder Verletzung der Vene führen kann.</li>
	<li>Injizieren Sie das Gesamtvolumen in den Schweif Vene innerhalb von 8-10 s.</li>
	<li>Entfernen Sie sofort die Maus aus die Restrainer. Komprimieren der Injektion gewickelt für mindestens 30 s oder bis eine Blutung nachlässt.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem separaten Käfig. Sobald die Maus aus dem Verfahren (ca. 30 – 60 min) erholt hat, übertragen Sie die Maus zurück zu seinem ursprünglichen Käfig. Schauen Sie auf die Maus regelmäßig für die nächsten 24 h. Hinweis: Leichter Sedierung der Maus wird routinemäßig für bis zu 2 Stunden nach der Injektion beobachtet.</li>
	<li>Warten Sie bevor Sie mit weiteren Experimenten (d.h. Schritt 7) 10-15 Tage für die Abfertigung von nichtintegrierten Vektoren.</li>
</ol>(7) Induktion von transfizierten CreER mit Tamoxifen
Achtung: Tamoxifen ist schädlich kann, Krebs oder Fruchtbarkeit Schaden. Entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
<ol><li>Planen Sie intraperitoneale Tamoxifen Injektionen an drei aufeinanderfolgenden Tagen.</li>
	<li>Am 1. Tag 10 mg Tamoxifen in 40 µL Ethanol zu lösen. Inkubieren Sie bei 55 ° C für 10 min. Vortex mehrere Male, bis die Tamoxifen aufgelöst hat.</li>
	<li>Nachfüllen Sie 960 µL Maisöl. 5 min. bei 55 ° c inkubieren Vortex mehrmals, um eine eindeutige Lösung zu erhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie die Lösung in einer 1-mL Insulin-Spritze mit einer Nadel 27 G.</li>
	<li>SCRUFF der Maus durch den Hals der Maus vorsichtig mit dem Daumen und dem zweiten Finger greifen Befestigung das Heck zwischen der Hand und den vierten und fünften Finger.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,1 mL (= 1 mg Tamoxifen) der Lösung intraperitoneal in der linken unteren Quadranten des Abdomens.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Injektionen an den Tagen zwei und drei.</li>
</ol>8. die Induktion der Tetracyclin-abhängige gen oder ShRNA Ausdruck
Achtung: Doxycyclin kann schädlich sein. Entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
Hinweis: Je nach Art und Dauer des Experiments, Doxycyclin in Trinkwasser (Schritt 8.1) oder Chow (Schritt 8.2) lieferbar
<ol><li>
Für kurzfristige Experimente (< 10 Tage) Doxycyclin über das Trinkwasser über das folgende Protokoll zu verwalten.
	<ol>
<li>5 g Saccharose in 100 mL Wasser auflösen. Autoklaven.</li>
		<li>100 mg Doxycycline Hyclate in 5 mL Zuckerlösung (Schritt 8.1.1) in einem 15 mL konische Rohr zu lösen.</li>
		<li>Eine 10-mL-Spritze, Sterilfilter die Lösung durch einen 0,2 µm-Filter verwenden. Hinzufügen der Saccharose-Lösung im Schritt 8.1.1 vorbereitet.</li>
		<li>Doxycyclin-Zuckerlösung als Trinkwasser für die Maus zu liefern. Überprüfen Sie täglich und ersetzen, wenn die Lösung trüb Angabe bakterielle Überwucherung (ersetzen klare Lösung nach spätestens drei Tagen) wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für langfristige Experimente (> 10 Tage) oder Experimente, die empfindlich auf metabolische Veränderungen verwenden kommerzielle Doxycyclin-Chow (z.B.Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg), Dehydrierung und/oder Saccharose-induzierten Veränderungen in der Leber von behandelten Tieren zu vermeiden.</li>
</ol>9. Vorbereitung der Maus Leber für die Analyse von Immunostaining
Achtung: Paraformaldehyd kann schädlich sein. Entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
Hinweis: Das Timepoint wenn Mäuse analysiert werden richtet sich auf das Experiment. Es wird empfohlen, nach nicht weniger als drei Tagen Doxycyclin Behandlung Sicherstellung ausreichender Induktion von Transgen oder ShRNA Ausdruck Lebergewebe zu analysieren.
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 mL Spritze mit einer 27 G Nadel mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd Lösung (PFA).</li>
	<li>Die Maus durch eine geeignete Methode nach einem genehmigten Prüfplan Tier einschläfern. Hinweis: Richtlinien für die geeigneten Methoden der Euthanasie variieren je nach Hochschule.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchhöhle mit sezierenden Schere und anatomische Pinzette sorgfältig mit eine mediane Laparotomie, die Leber verfügbar zu machen. Bewegen Sie den Dünndarm nach rechts, um die Pfortader und der unteren Hohlvene (IVC) aussetzen.</li>
	<li>Stechen Sie die Nadel der Spritze vorbereitet (siehe Punkt 9.1) in die IVC und Schnitt die Pfortader. Injizieren Sie 1 mL der PFA in die IVC perfundieren das Lebergewebe und entfernen Auto-fluoreszierende Erythrozyten (wünschenswert, wenn immunofluorescent Färbung durchgeführt wird) langsam.</li>
	<li>Entfernen Sie die Leber. Spülen Sie mit Wasser und übertragen Sie auf 5 – 10 mL 4 % PFA-Lösung.</li>
	<li>Für Paraffin Abschnitte ist Fix Gewebe für 36 – 48 h Gewebe bereit für Dehydrierung und Paraffin einbetten.</li>
	<li>
Fix für Gefrierschnitte, Gewebe in 4 % PFA für 1 h.
	<ol>
<li>Für Cryoprotection auf 10 % Saccharoselösung übertragen. Inkubieren Sie 60 min.</li>
		<li>Auf 20 % Saccharoselösung übertragen. Inkubieren Sie 60 min.</li>
		<li>Transfer zum 30 % Saccharoselösung. 12 – 16 h. Embed Einbettung zusammengesetzte für Gefrierschnitte inkubieren und Einfrieren bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Transfektion von Hepatozyten mit hydrodynamischen Schweif Vene Injektion ist eine etablierte Methode seit seiner Einführung vor mehr als 15 Jahren geworden6. Das injizierte Volumen übersteigt das Herzzeitvolumen und der Sinusoide der Leber7, führt zur Transfektion von etwa 10-20 %, in einigen Fällen bis zu 40 % der Hepatozyten25,26von der minderwertigen Vena Cava mündet. Prädiktoren für eine erfolgreiche Transfektio...

Chronischer Lebererkrankung stellt eine große gesundheitliche Belastung weltweit1. Tierforschung Modelle sind wichtige Werkzeuge in der Studie von Lebererkrankungen und haben dazu beigetragen, die Leberregeneration, hepatischen Entzündung sowie Steatose und Leberkrebs2komplexe Fragen. Eine beträchtliche Anzahl von diesen Tiermodellen verlassen sich auf die gentechnische Veränderung von Leberzellen. Deshalb sind effiziente Werkzeuge zur Genexpression in Hepatozyten manipulieren hilfreich3. Bewährte Methoden wie die Zucht von gentechnisch veränderte Mausstämme oder die Erzeugung von viralen Vektoren für Hepatozyten Infektion sind entweder zeitaufwendig, Hafen Sicherheitsbedenken oder liefern schlechte Transgene Ausdruck in Hepatozyten in vivo 4 , 5. hydrodynamischen Schweif Vene Injektion (HTVI) ist eine alternative Methode zur in Vivo Transfektion von Hepatozyten ermöglicht einfach, schnell und kostengünstig Verhör der Genfunktion in der Leber. Für HTVI ist ein Vektor mit der gewünschten DNA-Sequenz in einem Volumen von Kochsalzlösung entspricht 10 % des Körpergewichts des injizierten Tieres aufgelöst. Die Lösung wird dann in die Rute Vene innerhalb von 5-10 s6injiziert. Herzzeitvolumen überschreiten, fließt die Kochsalzlösung aus der minderwertigen Vena Cava in die Leber Venen, führt zur Erweiterung der Leber und hydrodynamischen Transfektion von Hepatozyten7. Um stabile genomischen Integration zu erreichen, wurde die Methode mit Transposon-basierte Vektoren, wie die Schönheit -Transposon Schlafsystem kombiniert. Diese Systeme vermittelt die Rekombination von Ziel Vektoren mit genomischen Rekombination katalysiert durch ein schlafen Schönheit -Transposase8,9. Für Modelle der Leberfibrose oder Karzinogenese ist es oft wünschenswert, Overexpress oder Stille Gene zu bestimmten Zeitpunkten das Krankheitsmodell. Zu diesem Zweck Werkzeuge für induzierbaren Genexpression wie das Cre/LoxP-System oder Tetracyclin-induzierbaren gen Expressionssystems (Tet-On) können gebrauchte10sein.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für in Vivo Transfektion von murinen Hepatozyten mit HTVI ein Dornröschen Transposon-basiertes System. Zusätzlich ein Protokoll für stabil, konstitutive Expression des Transgens unter der Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotors, beschreiben wir eine erweiterte Vektorsystem, das konstitutive Tamoxifen-abhängige Cre-Rekombinase (CreER) Ausdruck mit vereint die induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MicroRNA angepasst ShRNA (MiR-ShRNA), genannt der pTC TET-System11. In dieses Vektorsystem werden induzierbaren transgene oder MiR-ShRNAs für Tetracyclin-abhängigen Ausdruck in den Backbone-Vektor mit einem recombinational Klonen-System ermöglicht die schnelle und einfache Generation neuen Vektoren12geklont. In diesem Video-basierte Führer werden Zubereitung von geeigneten Vektoren, Injektion und Behandlung von Mäusen, induzierbaren Transgen/MiR-ShRNA Ausdruck zu erreichen, und schließlich die Vorbereitung des Lebergewebes für die Analyse. In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Kombination eines Cre/LoxP vermittelte Maus Systems mit dem Ausdruck oder Knock-down-Wahl, so dass es ein allgemein einsetzbares System in der Forschung von Lebererkrankungen-gen zu aktivieren.

<table><tbody><tr><td>General Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Leiter</td><td>Thermo Fisher</td><td>#SM1331</td><td>DNA Leiter für Elektrophorese</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Einbettung von Kryo-Schnitten</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>Zur Süßung der Doxycylin-Lösung</td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td>Zur Selektion von Amp-resistenten Klonen</td></tr><tr><td>LB Agar (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fischer</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat</td><td>AppliChem</td><td>A1492,0001</td><td>Zur Selektion von Gentamicin-resistenten Klonen</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4 %</td><td>Fa. Roth</td><td>P087.6</td><td>para-Formaldehyd-Lösung</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzymmix</td><td>invitrogen/ThermoFisher</td><td>11791-020</td><td>enthält LR-Klonase Enzymmix II und Proteinase K</td></tr><tr><td>DB3.1 Kompetente Zellen</td><td>Thermo Fisher</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 Chemisch kompetente E. coli</td><td>Thermo Fisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Restriction Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>FseI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0588S</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>BfuAI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0701S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Für die DNA-Extraktion aus</td></tr><tr><td>Gel NucleoSpin Gel und PCR-Reinigung Macherey</td><td>& Nagel</td><td>740609.10</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC20</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740571</td><td>Plasmid-Extraktion (Mini-Vorbereitung)</td></tr><tr><td>NucleoBond PC500</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740574</td><td>Plasmid-Extraktion (Maxi-Vorbereitung)</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Materialien für Mausexperimente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt Spritze F 1 ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td>Für die intraperitoneale</td></tr><tr><td>Injektion Omnifix Luer 3 ml</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td>Für die intravenöse Injektion</td></tr><tr><td>Sterican Kanüle 24G</td><td>Braun</td><td>4657675</td> Sterican Kanüle 27G Braun 4657705 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Für die CreER-Aktivierung</td></tr><tr><td>Maisöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>Träger für Tamoxifen-Injektionen</td></tr><tr><td>Doxycyclinhyclat</td><td>AppliChem</td><td>A2951,0025</td><td>Aktivierung der Tetracyclin-abhängigen Expression</td></tr><tr><td>Injekt 10 ml Spritze</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0,2</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td>Zur Filtration von Doxycyclin</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Braun</td><td>3200905</td><td>Träger für intravenöse Injektionen</td></tr><tr><td>Falcon Conical Tube 50ml</td><td>Corning Life Science</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Infrarotlampe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zur Erwärmung des Mäuseschwanzes</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>In-vivo-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Plasmide für die Klonierung von Dornröschen-Transposon-Vektoren für HTVI.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTC</td><td></td><td>n/a</td><td>Vektor für konstitutive Genexpression, Ref. 15</td></tr><tr><td>pEN_TTmcs</td><td></td><td>Addgene #25755</td><td>Eintrittsvektor für induzierbare Genexpression, Ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTGmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25753</td><td>Eintrittsvektor für induzierbare miR-shRNA-Expression mit Co-Expression von GFP, Ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25752</td><td>Eintrittsvektor für induzierbare miR-shRNA-Expression ohne Co-Expression von GFP, Ref. 19</td></tr><tr><td>pTC ApoE-Tet</td><td></td><td>Addgene #85578</td><td>Expressionsvektor für induzierbare Gen- oder miR-shRNA-Expression mit ApoE.HCR.hAAT-Promotor, Ref. 11</td></tr><tr><td>pTC-CMV-Tet</td><td></td><td>Addgene #85577</td><td>Expressionsvektor für die induzierbare Gen- oder miR-shRNA-Expression mit CMV-Promotor, Ref. 11</td></tr></tbody></table>

konstitutive und induzierbaren systeme für genetische in vivo Änderung der maus hepatozyten mit hydrodynamischen tail vene injektion

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

In Forschungsmodelle von Leberkrebs, Regeneration, Entzündung und Fibrose sind flexible Systeme für in Vivo Genexpression und zum Schweigen bringen sehr nützlich. Hydrodynamische Schweif Vene Injektion Transposon-basierte Konstrukte ist eine effiziente Methode für die genetische Manipulation von Hepatozyten bei Erwachsenen Mäusen. Neben der konstitutiven Transgene Ausdruck kann dieses System für erweiterte Anwendungen, z. B. ShRNA-mediated Gene Knock-down-Implikation der CRISPR/Cas9 System induzieren Genmutationen oder induzierbaren Systeme verwendet werden. Hier präsentiert sich die Kombination von konstitutiven CreER Ausdruck zusammen mit induzierbaren Ausdruck ein Transgen oder MiR-ShRNA Wahl als ein Beispiel für diese Technik. Wir decken das mehrstufige Verfahren ausgehend von der Vorbereitung der Dornröschen-Transposon konstruiert, um die Injektion und die Behandlung von Mäusen und die Vorbereitung des Lebergewebes zur Analyse von Immunostaining. Das vorgestellte System ist eine zuverlässige und effiziente Vorgehensweise zu komplexen genetischen Manipulationen in Hepatozyten. Es ist besonders nützlich in Kombination mit Cre/LoxP-basierte Mausstämme und kann auf eine Vielzahl von Modellen in der Erforschung von Lebererkrankungen angewendet werden.

Transfection Wirksamkeit durch hydrodynamische Schweif Vene Injektion: Der Anteil der murinen Hepatozyten, die von einer einzigen Injektion hydrodynamisch transfiziert sind ist variabel und hängt von mehrere Parameter wie Einspritzmenge, Einspritzzeit, Menge des injizierten DNA und Größe des injizierten Konstrukt6, 22,23. Darüber hinaus ist die Transfektion Effizienz bei größere...

Hydrodynamische Schweif Vene Injektion von Transposon-basierte Integration Vektoren ermöglicht stabile Transfektion von murinen Hepatozyten in-vivo. Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Protokoll für die Transfektion Systeme, die der langfristigen konstitutive Ausdruck von einem einzigen Transgen oder kombinierte konstitutiven und Doxycyclin-induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MiR-ShRNA in der Leber ermöglicht.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die stabile Transfektion von Hepatozyten in vivo, mit Vektorkonstrukten für die induzierbare Gen- oder shRNA-Expression. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Leberforschung zu beantworten. So können beispielsweise Mechanismen bei Leberkrebs und der Regeneration untersucht werden.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die kombinierte Expression von CreER zusammen mit einer induzierbaren transgenen R shRNA-Expression in Maus-Hepatozyten in vivo, die durch hydrodynamische Schwanzveneninjektion erreicht wird. Das Verfahren wird von Eric Hübner, einem Medizinstudenten aus unserem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Kombination von 150 Nanogramm Eintrittsvektor, der die kurze Haarnadel-RNA für das Zielprotein enthält, mit 150 Nanogramm pTC-Tet-Vektor und TE-Puffer zu einem Gesamtvolumen von acht Mikrolitern.Übertragen Sie dann die LR-Klonase-Enzymmischung II auf Eis und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Während der Inkubation zweimal vortexen. Geben Sie dann zwei Mikroliter LR-Klonase-Enzymmischung II zur Reaktion und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius.Nach der Inkubation stoppen Sie die Reaktion, indem

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zum Knockout des Zielgens unter Verwendung eines Tamoxifen-induzierbaren Cre-Rekombinase-Systems nach intraperitonealer Injektion von Tamoxifen in einem Mausmodell.

CreER-LoxP-System-basierte Zielgen-Inaktivierung: Ein Tamoxifen-induzierbares Cre-Rekombinase-System für den Zielgen-Knockout in einem Mausmodell

Dieses Video demonstriert das Genexpressionssystem von Tetracyclin oder Tet-On in einem Mausmodell. In Gegenwart von Doxycyclin, einem Tetracyclin-Derivat, wird das Tet-On-System, bestehend aus reversem Tetracyclin-kontrolliertem Transaktivatorprotein, aktiviert und exprimiert das interessierende Gen.

Induzierbare Tet-On-regulierbare systembasierte Genexpression in vivo: Ein Tetracyclin-induziertes Genexpressionssystem für die Aktivierung der Zielgentranskription im Mausmodell

Dieses Video beschreibt die Technik der genetischen in vivo Transfektion von murinen Hepatozyten durch hydrodynamische Schwanzveneninjektion. Dieses Transfektionssystem erzeugt eine langfristige Expression des Transgens in den Hepatozyten.

Hydrodynamischer Gentransfer: Eine Technik zur In-vivo-Transfektion von exogener DNA in murinen Hepatozyten durch Injektion von Schwanzvenen

In-vivo-Transfektion von nackter DNA durch hydrodynamische Genübertragung führt Gene in das Gewebe eines Tieres mit minimalen Entzündungsreaktion. Ausreichende Mengen an Genprodukt erzeugt werden, so dass Genfunktionen und Regelung sowie die Proteinstruktur und Funktion untersucht werden.

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Hier präsentieren wir ein neuartiges humanisiertes Mauslebermodell, das in Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelten Zell-Knockout-Mäusen (TRECK)/SCID-Mäusen nach der Transplantation von unreifen und expandierbaren humanen Leberstammzellen erzeugt wurde.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.

Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung primärer Maushepatozyten aus der Leber und zur Elektropolatierung von CRISPR-Cas9 als Ribonukleoproteine und mRNA, um ein therapeutisches Zielgen zu stören, das mit einer erblichen Stoffwechselerkrankung der Leber assoziiert ist. Die beschriebenen Methoden führen zu einer hohen Lebensfähigkeit und einem hohen Grad an Genmodifikation nach der Elektroporation.

Elektroporationsvermittelte Abgabe von Cas9-Ribonukleoproteinen und mRNA in frisch isolierte primäre Maus-Hepatozyten

Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Lernen Sie die stabile Transfektion von Maus-Hepatozyten in vivo mittels hydrodynamischer Schwanzveneninjektion mit induzierbaren Transposon-Vektoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Leberkrebsmechanismen und Regeneration.

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion (Video) | JoVE Journal

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

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