Name: Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Lernen Sie die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen in Tumorzellen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung einzelner DNA-Schäden und deren Reparaturmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Das Projekt wurde von der deutschen José Carreras Leukämie Stiftung (DJCLS 14 R/2017) unterstützt.

alle hier beschriebene Methoden wurden von der Ethik Komitee II in die medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg zugelassen. Schriftliche Einwilligung von allen Personen eingeholt wurde.
 1. Vorbereitung der Materialien <ol><li>Antikoagulans-Stammlösung: bereiten ein Antikoagulans Stammlösung 200 IE Heparin pro mL in 0,9 % Natriumchlorid. Füllen Sie jeweils die Röhrchen (zeichnen Sie Volume 9 mL) mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung vor Entnahme der Proben Blut oder Knochenmark.</li>
	<li>Lyse-Lösung für die Erythrozyten: bereiten die 10 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten mit 82,91 g Ammoniumchlorid, 7,91 g Ammonium Bicarbonat und 2 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic sauren Lösung einen pH-Wert von 8,0 durch Auflösen der Wirkstoffe in bidestilliertem Wasser für ein Gesamtvolumen von 1 L.</li>
	<li>Fixierung Lösung: hinzufügen 8.3 µL einer 1 M Kalilauge zu 360 mg Paraformaldehyd (PFA) in einem Mikrotiter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis 1 mL-Markierung des Rohres und Wärme der Röhre in einem Heizblock bei 95 ° C, 1 mL einer 36 % PFA Lösung zu bekommen. Ein Rohr mit einer Kapazität von 15 mL übermitteln Sie 1 mL 36 % PFA Lösung. Die Lösung 1 mL 36 % PFA, 9 mL einer 4 % PFA Vorratslösung zu fügen Sie 8 mL PBS hinzu. Aliquoten 4 % PFA-Stammlösung und Speicher bei-18 ° C bis zur Fixierung der Zellen nutzen. 
	Achtung: (1) Kalilauge ist ätzend. Beachten Sie Augen-und Haut. (2) PFA ist krebserregend. Vermeiden Sie Hautkontakt und Inhalation. Bereiten Sie die Fixierung-Lösung unter einer Haube.</li>
	<li>Permeabilisierung Lösung: hinzufügen 50 µL Octoxinol 9 bis 50 mL PBS zu einer Lösung von ca. 0,1 % Octoxinol 9.</li>
	<li>Blockiert Lösung: bereiten Sie 5 % und 2 % blockieren von Lösungen durch Mischen der Protein Blockierungsmittel mit PBS und Store bei 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Proben <ol><li>Fibroblasten in der Zellkultur: pflegen menschliche Fibroblasten der Zelllinie NHDF in einer befeuchteten 5 % CO 2 Atmosphäre bei 37 ° C in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 4 mM Glutamin, und 1 % Penicillin/Streptomycin.
	<ol><li>Vorbereitung der einen Objektträger mit Anhänger Fibroblasten <ol><li>Entfernen Sie das Medium aus der Flasche (75 cm 2 Wachstumsbereich) mit exponentiell wachsenden NHDF Fibroblasten. Fügen Sie 10 mL PBS in den Kolben. Vorsichtig waschen anhaftenden Fibroblasten durch manuell Schütteln der Flasche für 1 min.</li>
			<li>Die PBS zu entfernen und fügen Sie 1 mL Trypsin in den Kolben. Schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle adhärente Zellen von Trypsin abgedeckt werden. Die Trypsin aus der Flasche zu entfernen. Legen Sie die Flasche in den Brutkasten für 5 min bei 37 ° c</li>
			<li>Nehmen die Flasche aus dem Inkubator und 10 mL RPMI 1640 Medium in den Kolben. Pipette das Medium nach oben und unten mehrmals die Fibroblasten zu zerstreuen.</li>
			<li>Der dispergierten Fibroblasten auf jeweils zwei Felder der Objektträger 0,3 mL pipette und setzen Sie die Folie in den Brutkasten für 24 h, so dass die Fibroblasten zur Folie haften. Für Immunostaining von γH2AX und 53BP1 in Kernen von Fibroblasten, fahren Sie mit Schritt 3.1.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Patientenproben <ol><li>Blutproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung und fügen 7 mL Blut in die Rohre. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren die G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3).</li>
		<li>Knochenmarkproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung (Schritt 1.1) und fügen Sie 7 mL Knochenmark in den Rohren. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren der G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3). Verwenden Sie CD34 Microbeads und Zell-Trennsäulen für die Isolierung von CD34 + Zellen.</li>
		<li>Isolierung von mononukleären Zellen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung 
		Hinweis: Mononukleäre Zellen sind von Blut und Knochenmarkproben durch Dichte Gradienten Zentrifugation 17 , 18 , 19 isoliert.
		<ol><li>Verdünnt den heparinisierten Blutprobe in einem Verhältnis von 1:1 mit PBS und der heparinisierten Knochenmarkprobe in einem Verhältnis von 1:3 mit PBS. Aussetzen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zweimal.</li>
			<li>Volumen Dichte Gradienten Medium zu einem neuen Schlauch. Sanft Schicht verdünnten Blut oder Knochenmark auf das Dichte-Gradienten-Medium. Achten Sie darauf, nicht die beiden Schichten mischen.</li>
			<li>Zentrifugieren der Röhre für 30 min bei Raumtemperatur und 400 X g. Abziehen der oberen Plasmaschicht mit der Pipette. Dann ernten Sie sorgfältig die mononukleären Zellen in der Schicht über das Dichte-Gradienten-Medium. Übertragen der mononukleären Zellen in ein frisches Gefäß.</li>
			<li>Mindestens drei Bände von PBS hinzufügen der mononukleären Zellen in der Röhre. Aussetzen Sie die Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.</li>
			<li>Nach dem Spin den Überstand zu entfernen und 10 mL 4 ° C, 1 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten. Aufschwemmen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal, und das Rohr für 5 min auf Eis legen. Dann fügen Sie 30 mL PBS bei 4 ° C und Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.</li>
		</ol></li> <li>Vorbereitung der Cytospins <ol><li>bereiten Sie zwei Cytospins mit mononukleären Zellen von Patientenproben (d. h., ein Cytospin für γH2AX Immunfluoreszenz Färbung und eine Cytospin für γH2AX und 53BP1 kombiniert Immunfluoreszenz-Färbung) durch Zentrifugieren (300 X g, 10 min) von 1,0 x 10 5 Zellen für jede Zubereitung ( Abbildung 3 und 4).</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz Färbung <ol><li>Fixierung und Permeabilisierung: befestigen Sie die Zellen mit 200 µL 4 % PFA 10 min. lang. Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen vorsichtig dreimal mit 30 mL PBS für 5 min auf einem Labor-Shaker. Dann permeabilize die Zellen mit 200 µL von 0,1 % Octoxinol 9 für 10 min. die Zellen sanft dreimal waschen mit 30 mL 5 % blockieren Lösung für 5 min auf einem Labor-Shaker. Blockieren Sie die Zellen in 30 mL frische 5 % blockiert Lösung für 1 h</li>
	<li>Inkubation mit Antikörpern <ol><li>inkubieren, eine Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und die weitere Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und eine polyklonale Kaninchen Anti-53BP1 Antikörper (1: 500) über Nacht bei 4 ° c</li>
		<li>Nach Inkubation der Zellen vorsichtig waschen 3 Mal mit 30 mL 2 % blockieren Lösung für jede 5 min auf einem Labor-Shaker.</li>
		<li>Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488-konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper (1: 500) und die zweite Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488 konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper ( 1: 500) und ein Esel Alexa555-konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 500) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li> <li>Eindeckmittel: setzen Sie die Folie mit den Zellen in eine Schüssel geben und die Zellen vorsichtig dreimal für jeweils 5 min auf einem Labor-Shaker mit 30 mL PBS waschen. Entfernen Sie die PBS und montieren Sie die Zellen mit Eindeckmittel mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmittel gelegt, so dass keine Luftblasen sind eingebettet. Warten Sie mindestens 3 h zum Härten des Mediums Montage vor der Analyse der Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie.</li>
</ol> 4. Analyse von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte <ol><li>Fluoreszenz-Mikroskopie: γH2AX und 53BP1 Brennpunkte in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit Filter für DAPI, Alexa 488 und Cy3 während der Bildgebung auf ein 100 X Objektiv zu analysieren Vergrößerung. Bilder mit einer Kamera aufnehmen und verarbeiten der Bilder mit entsprechenden Imagingsoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der Bildung und Reparatur des DSB in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten. Wichtige Parameter, die Einfluss auf das Ergebnis der Experimente sind die Phase des Zellzyklus, die Agenten für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen, die die Antikörper und die Hardware und Software von dem Fluoreszenzmikroskop verwendet.
Die Beeinflussung des Zellzyklus γH2AX Brennpunkte Muster zeigte sich vo...

DNA wird kontinuierlich durch endogene beschädigt (z.B., Replikation Stress, reaktive Sauerstoffspezies, innere Instabilität von DNA) und exogene(z. B.chemische radikale, Bestrahlung) Quellen (Abbildung 1)1,2 ,3,4. Unter DNA-Schäden DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind besonders schwere Läsionen und Zelltod oder Karzinogenese induzieren können. Etwa 50 DSB ergeben sich pro Zelle und Zellzyklus5. In Säugetierzellen entwickelte homologe Rekombination (HR) und nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) als wichtigen Wege für die Reparatur des DSB (Abbildung 2). HR in späten S/G2-Phase tritt und nutzt eine intakte Schwester Chromatids als Vorlage für potenziell fehlerfreie Reparatur. Im Vergleich dazu ist NHEJ während des Zellzyklus aktiv und potenziell mutagene wie Basenpaare hinzugefügt oder vor der Ligatur der gebrochenen enden reseziert werden. Darüber hinaus kann Alternativen Ende-Verbindung als eine langsame mutagene Back-up Repair-Mechanismus bei NHEJ Mangel6,7betraut sein.
DSB induzieren die Phosphorylierung des Histon H2AX Serin 139 in einer Region von mehreren Megabase Paaren um jede DSB. Bildenden nuklearen Brennpunkte werden benannt γH2AX Brennpunkte und nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie-8. ΓH2AX fördert die Einstellung von weiteren DSB-responsive Proteine und Chromatin umgestalten, DNA-Reparatur und Signal Transduction9beteiligt ist. Da jeder γH2AX Schwerpunkt gilt, einen einzigen DSB zu vertreten, ist die Quantifizierung der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie möglich, die nachweislich in Krebszelllinien und Patientenproben10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist eine weitere wichtige Protein bei der Vermittlung von DSB-Reparatur. Es ist bei der Rekrutierung von DSB-responsive Proteine, Checkpoint Signalisierung und der Synapsis DSB endet15beteiligt. Darüber hinaus spielt die 53BP1 eine entscheidende Rolle bei der DSB Reparatur Weg Wahl. Es löst die Reparatur des DSB in Richtung NHEJ, während HR verhindert16ist. In Betracht der echte Funktionen γH2AX und 53BP1 in der DSB-Reparatur möglicherweise die simultane Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie eine nützliche Methode für die genaue Analyse der Bildung und Reparatur des DSB.
Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 in Zellkernen durchführen. Insbesondere ist die Technik in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF, in x-ray bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen und CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie angewendet. Die Einzelheiten des Verfahrens sind im Zusammenhang mit den vorgestellten Ergebnissen hingewiesen.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Medium für Zellkultur</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Ratiopharm</td><td></td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Heparin 5.000 I.E. / mL</td></tr><tr><td>Natriumchloridlösung 0,9%</td><td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Bestandteil der gerinnungshemmenden Stammlösung</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Medium zur Isolierung mononukleärer Zellen</td></tr><tr><td>Trypsin-Lösung 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzym zur Dissoziation von Fibroblasten in Zellkultur</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Isolierung von CD34+ myeloischen Vorläuferzellen</td></tr><tr><td>Diagnostische Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; Tisch-Zentrifuge&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytospin Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckel</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Deckel für das Arbeiten ohne Mikroröhrchen</td></tr><tr><td>Zytobehälter</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Cyto Behälter mit 2 konischen</td></tr><tr><td>Bohrungen Clipträger</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Träger zur Aufnahme eines Zytobehälters und eines Objektträgers</td></tr><tr><td>Stützeinsatz</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Stützeinsatz für Halten eines Clipträgers</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergens zur Permeabilisierung von Zellmembranen</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxidlösung 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Notwendig für die Herstellung der Paraformaldehyd-Lösung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Ausgewogene Salzlösung</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Blockierungsmittel</td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti-& gamma H2AX Antikörper (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Primärer Antikörper zum Nachweis von &gamma; H2AX</td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Anti-53BP1-Antikörper (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Primärer Antikörper zum Nachweis von 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-konjugierter Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Enthält DAPI für die Färbung von DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 CCD-Kamera</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>Kamerasystem für digitale Aufzeichnung</td></tr><tr><td>Isis-Software</td><td>Metasystems</td><td>Nicht zutreffend</td><td>Mikroskop-Software</td></tr></tbody></table>

immunfluoreszenz-mikroskopie von γh2ax und 53bp1 für die analyse der bildung und reparatur der dna double-strand breaks

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind schwere DNA-Läsionen. Analyse der Bildung und Reparatur des DSB ist in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Genom Integrität, Genotoxizität, Strahlenbiologie, Altern, Krebs und Arzneimittelentwicklung. In Erwiderung auf DSB ist die Histon H2AX Serin 139 in einer Region mit mehreren Megabase Paare bilden diskrete nuklearen Herde nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie phosphoryliert. Darüber hinaus 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist ein weiteres wichtiges DSB-responsive Protein Förderung der Reparatur des DSB bei nonhomologous Ende-homologe Rekombination zu verhindern. Entsprechend den spezifischen Funktionen der γH2AX und 53BP1 möglicherweise die kombinierte Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ein vernünftiger Ansatz für eine detaillierte Analyse des DSB. Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll ergänzt durch methodische Hinweise für die Durchführung der Technik. Insbesondere zeigt sich der Einfluss des Zellzyklus auf γH2AX Brennpunkte Muster in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. Darüber hinaus ist der Wert der γH2AX Brennpunkte als Biomarker in Röntgenstrahlung bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen dargestellt. Zu guter Letzt wird die genetischer Instabilität in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 untersucht.

Analyse der γH2AX Herde in den Zellen ist in der G0/G1-Phase und G2-Phase als γH2AX Herde als verschiedene fluoreszierende Punkte (Abbildung 5A) erscheinen am genauesten. Im Gegensatz dazu wird durch verteilte Pan-nuklearen γH2AX Flecken verursacht durch den Replikationsprozess (Abb. 5 b) Analyse der γH2AX Brennpunkte in Zellen in der S-Phase erschwert.
Fixierung der Ze...

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Das übergeordnete Ziel der Immunfluoreszenzmikroskopie gamma-H2AX und 53BP1 ist es, die Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in verschiedenen Geweben zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Krebsforschung zu beantworten, etwa wie genetische Instabilität in Tumorzellen entsteht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass einzelne DNA-Doppelstrangbrüche sichtbar gemacht und die Reparaturprozesse analysiert werden können.Das Verfahren wird von Susanne Brendel, einer Technikerin unseres Labors, vorgeführt. Beginnen Sie das Experiment mit der Herstellung von Lösungen, beginnend mit der gerinnungshemmenden Stammlösung mit 200 Internationalen Einheiten Heparin pro Milliliter in 0,9 % Natriumchlorid. Füllen Sie jedes der Entnahmeröhrchen mit zwei Millilitern Antikoagulanzien-Stammlösung, bevor Sie die Blut- oder Knochenmarkproben entnehmen.Als nächstes bereiten Sie die 10-fache Lyselösung für rote Blutkörperchen mit 82,91 Gramm Ammoniumchlorid, 7,91 Gramm Ammoniumbicarbonat und zwei Millilitern 0,5 molare Ethylendiamenetetracedic-Säurelösung auf einen pH-Wert von 8,0 vor, indem Sie die Mittel in doppelt destilliertem Wasser für ein Gesamtvolumen

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrang Streifen mit γH2AX Bildung als einen molekularen Marker hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Foci nach Exposition von Zellen gegenüber Strahlung.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

Die Quantifizierung der DNA-Doppelstrangbrüche auf der Grundlage γH2AX Brennpunkten hat sich zu einem wertvollen Werkzeug, vor allem in der Strahlenbiologie, für die Auswertung von Gewebe Strahlenempfindlichkeit und die Auswirkungen der Strahlung modifizierende Verbindungen. Hier zeigen wir die Verwendung eines Immunfluoreszenztest zur Quantifizierung von γH2AX Brennpunkte in Gewebeproben.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

Die mikroskopische Analyse von γH2AX Herde, die im Anschluss an die Phosphorylierung von H2AX an Ser-139 in Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche zu bilden, hat sich zu einem wertvollen Werkzeug in der Strahlenbiologie. Hier haben wir ein Antikörper gegen mono-methylierte Histon H3 an Lysin 4 als epigenetische Marker aktiv Transkription Euchromatin, um die räumliche Verteilung der Strahlung induzierten γH2AX Bildung innerhalb des Zellkerns zu bewerten.

Auswertung der räumlichen Verteilung der γH2AX folgenden ionisierender Strahlung

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.

Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Hier stellen wir ein einfaches und schnelles Protokoll für den Nachweis von Proteininteraktionen an DNA-Schadensstellen vor.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

Lernen Sie die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen in Tumorzellen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung einzelner DNA-Schäden und deren Reparaturmechanismen.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Weitere Videos entdecken