Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Das übergeordnete Ziel der Immunfluoreszenzmikroskopie gamma-H2AX und 53BP1 ist es, die Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in verschiedenen Geweben zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Krebsforschung zu beantworten, etwa wie genetische Instabilität in Tumorzellen entsteht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass einzelne DNA-Doppelstrangbrüche sichtbar gemacht und die Reparaturprozesse analysiert werden können.

Verfahren wird von Susanne Brendel, einer Technikerin unseres Labors, vorgeführt. Beginnen Sie das Experiment mit der Herstellung von Lösungen, beginnend mit der gerinnungshemmenden Stammlösung mit 200 Internationalen Einheiten Heparin pro Milliliter in 0,9 % Natriumchlorid. Füllen Sie jedes der Entnahmeröhrchen mit zwei Millilitern Antikoagulanzien-Stammlösung, bevor Sie die Blut- oder Knochenmarkproben entnehmen.

Als nächstes bereiten Sie die 10-fache Lyselösung für rote Blutkörperchen mit 82,91 Gramm Ammoniumchlorid, 7,91 Gramm Ammoniumbicarbonat und zwei Millilitern 0,5 molare Ethylendiamenetetracedic-Säurelösung auf einen pH-Wert von 8,0 vor, indem Sie die Mittel in doppelt destilliertem Wasser für ein Gesamtvolumen von einem Liter auflösen. Bereiten Sie dann die Fixierlösung vor, indem Sie 8,3 Mikroliter einer einmolaren Kaliumhydroxidlösung zu 360 Milligramm Paraformaldehyd oder PFA in ein Mikrotiterröhrchen geben. Füllen Sie das Röhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zur Ein-Milliliter-Markierung des Röhrchens und erhitzen Sie das Röhrchen in einem Heizblock auf 95 Grad Celsius, um einen Milliliter einer 36-prozentigen PFA-Lösung zu erhalten.

Füllen Sie den einen Milliliter 36-prozentige PFA-Lösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen um. Und fügen Sie acht Milliliter PBS hinzu, um eine neun Milliliter vierprozentige PFA-Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie die vierprozentige PFA-Stammlösung und lagern Sie sie bei minus 18 Grad Celsius, bis sie für die Zellfixierung verwendet wird.

Als nächstes bereiten Sie die Permeabilisierungslösung vor, indem Sie 50 Mikroliter Octoxynol 9 bis 50 Milliliter PBS hinzufügen, um eine Lösung von etwa 0,1 % Octoxynol 9 zu erhalten. Bereiten Sie schließlich fünf prozentige und zwei prozentige Blockierungslösungen vor, indem Sie das Proteinblockierungsmittel mit PBS mischen. Um die Blut- oder Knochenmarkproben vorzubereiten, entnehmen Sie die Röhrchen, die mit zwei Millilitern der gerinnungshemmenden Stammlösung gefüllt sind.

Entnahme von sieben Millilitern Blut oder Knochenmark pro Röhrchen unter sterilen Bedingungen durch Venenpunktion bzw. Knochenmarkpunktion. Lagern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur. Nach der Lagerung über Nacht verdünnen Sie die heparinisierte Blutprobe eins zu eins mit PBS und die heparinisierte Knochenmarkprobe im Verhältnis eins zu drei mit PBS.

Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie zweimal in die Pipette hinein- und wieder herausziehen. Geben Sie als Nächstes ein Volumen Density Gradient Medium in eine frische Tube. Schichten Sie das verdünnte Blut oder Knochenmark vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium und achten Sie darauf, die beiden Schichten nicht zu vermischen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und 400 g. Ziehen Sie die obere Plasmaschicht mit einer Pipette ab. Ernten Sie dann vorsichtig die mononukleären Zellen in der Schicht über dem Dichtegradientenmedium. Übertragen Sie die mononukleären Zellen in ein frisches Röhrchen und fügen Sie mindestens drei Volumen PBS hinzu.

Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie zweimal in die Pipette hinein- und wieder herausziehen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen. Nach dem Schleudern den Überstand entfernen.

Fügen Sie 10 Milliliter vier Grad Celsius 1x Lyselösung für rote Blutkörperchen hinzu. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie zweimal in die Pipette hinein- und wieder herausziehen und das Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis stellen. Fügen Sie dann 30 Milliliter PBS bei vier Grad Celsius hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen.

Verwenden Sie CD34-Mikrokügelchen und Zelltrennsäulen für die Isolierung von CD34-positiven Zellen. Präparation von zwei Zytospins mit mononukleären Zellen der Patientenproben durch Zentrifugation von eins mal 10 der fünf Zellen für jede Präparation. Fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern vierprozentigem PFA für 10 Minuten.

Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern PBS für jeweils fünf Minuten auf einem Shaker. Dann permeablizieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit 200 Mikrolitern 0,1 Prozent Octoxynol 9. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern einer fünfprozentigen Blockierungslösung für jeweils fünf Minuten auf einem Laborschüttler.

Blockieren Sie die Zellen eine Stunde lang in 30 Millilitern frischer, fünfprozentiger Blockierungslösung. Durch die Fixierung und Permeablisierung der Zellen mit vier Prozent Paraformaldehyd in 0,1 Prozent Octoxynol 9 bleiben die gamma-H2AX- und 53BP1-Herde deutlich erhalten. Inkubieren Sie ein Präparat der Zellen mit einem monoklonalen Maus-Anti-Gamma-H2AX-Antikörper und das andere Präparat der Zellen mit einem monoklonalen Maus-Anti-Gamma-H2AX-Antikörper und einem polyklonalen Kaninchen-Anti-53BP1-Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius.

Die Verwendung von bewährten anti-gamma-H2AX- und anti-53BP1-Antikörpern wird dringend empfohlen. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern zweiprozentiger Blockierungslösung für jeweils fünf Minuten auf einem Laborschüttler. Als nächstes inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einem konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper Alexa 488, der eins zu 500 in einer zweiprozentigen Blockierungslösung verdünnt ist.

Inkubieren Sie das zweite Präparat der Zellen mit einem konjugierten Alexa 488 Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper und einem Alexa 555 konjugierten Esel Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, der eins zu 500 in einer zweiprozentigen Blockierungslösung verdünnt wird. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 30 Millilitern PBS auf einem Laborschüttler. Entfernen Sie das PBS und mounten Sie die Zellen mit Eindeckmedium.

Setzen Sie vorsichtig einen Decklader auf das Eindeckmedium, damit keine Luftblasen eingebettet werden. Warten Sie mindestens drei Stunden, bis das Eindeckmedium ausgehärtet ist, bevor Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie analysieren. Analysieren Sie schließlich die gamma-H2AX- und 53BP1-Foki in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Filtern für DAPI, Alexa 488 und Cy3 ausgestattet ist, während der Bildgebung bei einer 100-fachen Objektvergrößerung.

Die Analyse von gamma-H2AX-Herden in Zellen ist in der G0-G1-Phase und der G2-Phase am genauesten, wenn gamma-H2AX-Herde als deutliche fluoreszierende Punkte erscheinen, wie in diesem repräsentativen Bild von Fibroblasten gezeigt. Im Gegensatz dazu wird die Analyse von gamma-H2AX-Foki in Zellen während der S-Phase durch dispergierte pannukleare gamma-H2AX-Speckles erschwert, die durch den Replikationsprozess verursacht werden. Die Immunfluoreszenzfärbung von gamma-H2AX wurde zur Quantifizierung von DNA-Doppelstrangbrüchen in bestrahlten Geweben verwendet und es konnte aufgeklärt werden, dass die Konzentrationen von gamma-H2AX-Foki in bestrahlten Lymphozyten proportional zur Bestrahlungsdosis sind.

Die Kolokalisation von gamma-H2AX- und 53BP1-Foki in CD34-positiven Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie deutet auf eine Förderung von 53BP1-vermittelten nicht-homologen Endverbindungsreparaturmechanismen an Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gamma-H2AX- und 53BP1-Immunfluoreszenzmikroskopie für die Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen durchführt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie das Immunblotting von phosphoryrelated ATM, ATR, Checkpoint-Kinase eins, Checkpoint-Kinase zwei und TP53 in Tumorzellen durchgeführt werden, um Veränderungen der DNA-Schadensantwort zu analysieren.