Die Einnahme von Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel für die Bestimmung der Fluid-Aufnahme Fähigkeiten bei Insekten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, physiologische Parameter der Fütterung von flüssigkeitsfressenden Insekten unter Verwendung einer Saccharoselösung zu bewerten, die mit fluoreszierenden magnetischen Nanopartikeln gemischt wird. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entomologie zu beantworten, wie z.B. Struktur, Funktionsbeziehungen von Insektenmundwerkzeugen und Insektenfütterungsmechanismen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir feststellen können, ob Insekten in der Lage sind, Flüssigkeiten aufzunehmen, die entweder als Tümpel oder als Flüssigkeitsfilme vorliegen.

Bei dieser Demonstration werden Blauflaschenfliegen verwendet, da ihre Flüssigkeitsaufnahmefähigkeit und ihre Mundwerkzeugmorphologie gut dokumentiert sind. Stubenfliegen, Kohlschmetterlinge und andere flüssigkeitsfressende Insekten könnten verwendet werden. Besorgen Sie sich Fliegenpuppen und legen Sie sie in eine Klimakammer mit 18 Stunden Licht pro Tag und 23 Grad Celsius.

Nachdem die erwachsenen Tiere aus ihren Puppen geschlüpft sind, füttern Sie sie vor dem Experiment nicht. Für das experimentelle Lebensmittel bereiten Sie 20-prozentige Saccharoselösung mit 0,5 Milligramm Nanopartikeln pro Milliliter vor. Bereiten Sie dann eine Zuführstation vor, die aus einem Manipulator, einer Klemme und einer Zuführstufe besteht.

Halten Sie das Futter in der Fütterungsphase mit einem konkaven Schieber. Bereiten Sie außerdem verschiedene Nylonnetzfilter und Membranfilter mit unterschiedlichen Porengrößen vor, um den konkaven Objektträger abzudecken. Beginne damit, die Körper, Beine und Flügel des Insekts in ein gefaltetes Seidenpapier einzuwickeln.

Lassen Sie nur die Kopf- und Mundwerkzeuge frei. Halten Sie dabei das Insekt gesichert, indem Sie seine Flügel zusammenkneifen. Befestigen Sie nun die in Seidenpapier eingewickelten Flügel zwischen zwei Objektträgern.

Klemmen Sie dann die beiden Schlitten und befestigen Sie die Klemme an einem Manipulator. Sichern Sie dann das Insekt mit dem Manipulator über der Fütterungsstufe. Geben Sie anschließend 30 Mikroliter Fütterungslösung in die Mitte des konkaven Objektträgers und decken Sie die Lösung mit einem porösen Stück Filterpapier ab.

Das Tröpfchen verteilt sich entlang des Filterpapiers und füllt die Poren. Positionieren Sie dann das Insekt so, dass die distalen Bereiche der Mundwerkzeuge mit dem benetzten Filterpapier in Kontakt kommen können, so dass nur der flache Teil des Objektträgers erreicht werden kann und das Insekt nicht aus dem konkaven Bereich fressen kann. Verlängern Sie nun mit einer Insektennadel die Mundwerkzeuge auf das Filterpapier und lassen Sie das Insekt 45 Sekunden lang fressen.

Wenn das Insekt kein Interesse an der Fütterung bekundet, halten Sie die Mundwerkzeuge mit der Nadel für die Füllung 45 Sekunden lang an das Filterpapier. Damit ist das Fütterungsprotokoll abgeschlossen. Laden Sie für das Sezieren ein 50-Milliliter-Uhrglas mit genügend PBS, um den Körper des Insekts zu bedecken.

Richten Sie dies zusammen mit allen Präparierwerkzeugen am Mikroskop ein. Entferne nun das Insekt aus dem Seidenpapier und halte die Flügel geschlossen. Entfernen Sie dann den Kopf, die Beine und die Flügel mit einer Feder-Mikropräparierschere und legen Sie den Brustkorb und den Bauch in das PBS.

Um den Darm zu präparieren, fassen Sie zunächst die distale Abdomenkutikula und schneiden Sie die Nagelhaut in anteriorer Richtung entlang der lateralen Seite vom hinteren Ende bis zum Thorax. Achten Sie besonders darauf, dass nur die Nagelhaut durchtrennt wird und der Verdauungskanal nicht beschädigt wird. Entfernen Sie anschließend die Bauchhaut, den Fettkörper und andere Strukturen mit Hilfe von Insektennadeln, bis nur noch der Brustkorb und der Verdauungskanal im Uhrglas übrig bleiben.

Identifizieren Sie nun die Ernte. Es handelt sich um eine sackartige Struktur, die sich in der Nähe der Verbindungsstelle von Brustkorb und Hinterleib befindet. Machen Sie bei Bedarf zusätzliche Schnitte in den Brustkorb, um den Kropf freizulegen.

Schneiden Sie dann den restlichen Thorax ab, so dass nur der Verdauungskanal und der Kropf übrig bleiben. Um das Vorhandensein von aufgenommenen Nanopartikeln zu testen, beginnen Sie mit einer feinen Präparierzange, um die Pflanze zur Bildgebung auf ein Deckglas zu übertragen. Seien Sie vorsichtig, um ein Reißen der Ernte zu vermeiden.

Bilden Sie den Ausschnitt sofort auf einem inversen konfokalen Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung mit dem CY3-Kanal oder dem Phasenkontrast ab. Um aufgenommene Nanopartikel zu identifizieren, schwenken Sie einen magnetischen Rührstab etwa 10 Millimeter von der Pflanze entfernt. Jede Hin- und Herbewegung dauert etwa eine Sekunde.

Während Sie den Magneten schwenken, bewegen Sie den Operationstisch langsam, um nach Bewegungen der Nanopartikel in der nahezu transparenten Pflanze zu suchen. Sind die Nanopartikel in der Pflanze vorhanden, schwingen sie im Gleichklang mit dem magnetischen Rührstab. Ein Insekt, das sich von einer porösen Oberfläche von einer Lösung ernährt, muss über die Plateauinstabilität eine stabile Flüssigkeitsbrücke schaffen, um den Kapillardruck zu überwinden, der die Flüssigkeit in den Poren hält.

Es wird vorhergesagt, dass die Größe des Fresskanals eines Insekts die kleinste Porengröße bestimmt, von der aus es sich ernähren kann. Nachdem Insekten präpariert wurden, um zu beurteilen, ob Nanopartikel aufgenommen wurden, wurden ihre Mundwerkzeuge abgebildet, um die Größe des Speisekanalkanals zu messen. Bei Fliegen wurden der Durchmesser der Pseudotrachea und der Mundöffnung gemessen.

Die Analyse der aufgenommenen Nanopartikel deutet auf einen engen Zusammenhang zwischen der Größe der distalen Mundteilleitung und der kleinsten Porengröße hin, von der sich ein Insekt ernähren kann. Dieser Zusammenhang ist bei den proximalen Mundwerkzeugen nicht zu beobachten. Folglich würde die Flüssigkeitsaufnahme für Dipterane zuerst in der Pseudotrachea und nicht in der Mundöffnung erfolgen, und die Kapillarwirkung muss eine wichtige Rolle bei der Nahrungsaufnahme spielen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Insekten mit einer Nanopartikellösung füttern, sie sezieren, um ihre Ernte zu isolieren, und dann die Ernte auf die Nanopartikel untersuchen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, während der Dissektionen vorsichtig zu sein. Wenn die Ernte platzt, kann sie den flüssigen Inhalt und die Nanopartikel verschütten und so Ihre Probe ruinieren.