Name: In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Erfahren Sie die quantitative und nicht-invasive EPR-Bewertung von Sauerstoff, pH-Wert und Redox-Status im Tumor-Mikromilieu von Brustkrebs-Mausmodellen. Diese Technik liefert wertvolle Einblicke für die zielgerichtete Krebstherapie.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NIH CA194013, CA192064 und U54GM104942 gewährt. Die WVCTSI ist für Start-up zum VVK, AB und TDE anerkannt. Die Autoren danken Dr. M. Gencheva und K. Steinberger für die Hilfe mit den anschaulichen Experimenten. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellten Methoden können für nicht-invasive in Vivo Beurteilung der kritischen Parameter der chemischen TME pO2, pH-Wert, Redox-Status und Konzentrationen von interstitiellen Pi und intrazellulären GSH. Magnet-Resonanz-Techniken, wie MRI und Low-Bereich EPR, sind die Methoden der Wahl für die nicht-invasive in Vivo Profilierung dieser TME-Parameter. MRI anatomische Strukturen visualisiert aber funktionelle Sensitivität fehlen. Im Gegensatz zu MRI bieten EPR-Techniken funktio...

Eine zentrale Rolle des TME in der Tumorprogression und Therapie ist immer geschätzt1. Unter wichtige physiologische Parameter von TME in soliden Tumoren, Gewebe Hypoxie2, Azidose3,4, hohe Reduzierung Kapazität5, erhöhte Konzentrationen von intrazellulären GSH-6,-7, und interstitielle Pi8 sind gut dokumentiert. Nicht-invasive in-vivo pO2, pH-Wert, Pi, GSH und Redox Bewertungen bieten einzigartige Einblicke in die biologischen Prozesse im TME und voraus-Tools für präklinische Screening von Anti-Krebs-Medikamente und TME-gezielte therapeutische Strategien zu helfen. Eine vernünftigen Radiofrequenz Eindringtiefe im Gewebe durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) und Low-Bereich EPR-basierte Techniken macht sie das am besten geeignete Ansätze für nicht-invasive Beurteilung dieser TME-Parameter. MRI stützt sich weitgehend auf bildgebende Wasser Protonen und ist weit verbreitet in klinischen Einrichtungen, anatomische Auflösung bieten aber funktionelle Lösung fehlt. Die Kernspinresonanz Phosphor-31 (31P-NMR) Messungen der extrazellulären Pi Konzentration und pH-Wert basierend auf ein Signal von endogenen Phosphat sind potentiell attraktiv für TME Charakterisierung, aber sind normalerweise um ein Vielfaches maskiert höheren intrazellulären Pi Konzentrationen9,10. Im Gegensatz dazu EPR-Messungen setzen auf Spektroskopie und Bildgebung des speziell entworfen paramagnetische Sonden, funktionelle Lösung bereitzustellen. Beachten Sie, dass exogene EPR-Sonden einen Vorteil gegenüber exogenen haben Sonden NMR wegen der viel höheren inneren Empfindlichkeit des EPR und Fehlen von endogenen Hintergrund EPR Signalen. Die jüngste Entwicklung von einer Doppelfunktion pH und Redox Nitroxyl probe11 und multifunktionale Trityl Sonde12 bietet unübertroffene Möglichkeiten für in Vivo gleichzeitige Messungen von mehreren TME-Parameter und ihre Korrelation Analysen unabhängiger Sonde Verteilung und Uhrzeit der Messung. Unseres Wissens gibt es keine anderen Methoden zur Verfügung, um gleichzeitig in Vivo physiologisch wichtigen chemischen TME Parameter in lebendigen Subjekten, z. B. pO2pHe, Pi, Redox und GSH bewerten.
Sonden für In Vivo Funktionsmessungen:
Abbildung 1 zeigt die chemische Strukturen der paramagnetischen Sonden TME Zugriff auf Parameter, darunter Partikel- und lösliche Sonden verwendet. Hohe funktionale Empfindlichkeit, Stabilität in lebendem Gewebe und minimale Toxizität sind ein paar Vorteile, die partikuläre Sonden bevorzugt über lösliche Sonden für in Vivo EPR Pulsoxymetrie machen. Zum Beispiel haben partikuläre Sonden Retentionszeiten auf dem Gelände des Gewebes Implantat im Vergleich zu löslichen Sonden für longitudinale Messung des Gewebes pO2 über mehrere Wochen erhöht. Auf der anderen Seite lösliche Sonden übertreffen partikuläre Sonden durch die Bereitstellung von räumlichen gelöst Messungen mittels EPR-basierte bildgebende Verfahren sowie die begleitende Analysen von mehreren Funktionalitäten (pO2, pH, Pi, Redox, und GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Abbildung 1. Chemische Strukturen der paramagnetischen Sonden, die TME Bewertung Assay zusammenbauen. Dazu gehören die Partikel pO2 Sonde, LiNc-Auftrieb (R = - O (CH2)3CH3), und lösliche Sonden: Doppelfunktion pH und Redox Sonde, NR; GSH-Sensitive Sonde, RSSR; und multifunktionale pO2, pH und Pi-Sonde von der extrazellulären Mikroumgebung, die Hoffnung Sonde. Die Synthese von diese Sonden wurde in die angegebenen Referenzen 11,12beschrieben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>L-Band EPR-Spektrometer</td><td>Magnettech, Deutschland</td><td></td><td>L-Band (1,2 GHz) Elektronen-Paramagnetresonanz (EPR) Spektrometer zur Erfassung von in vitro und in vivo Spektren paramagnetischer Moleküle</td></tr><tr><td>&nbsp; Temperatur & Gas-Controller&nbsp;</td><td>Noxygen, Deutschland</td><td></td><td>Temperatur & Temperatur Gasregler zur Steuerung und Einstellung der Temperatur und Gaszusammensetzung&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutathion reduziert)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; Mäuse</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 murine Brustkrebszellen</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Wildtyp-Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Ausschlussfarbstoff&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat einbasisch</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoseoxydase</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Zirkulator E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter Orion</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuO-Sonde</td><td>Im Haus</td><td></td><td>Die Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanin-Sonde wurde gemäß Ref 13</td></tr><tr><td>NR-Sonde</td> synthetisiert <td>Im Haus</td><td></td><td>Die Nitroxidsonde wurde gemäß Ref 11 synthetisiert</td></tr><tr><td>RSSR-Sonde</td><td>Im Haus</td><td></td><td>Die Di-Nitroxid-Sonde wurde gemäß Ref 15 synthetisiert</td></tr><tr><td>sonde</td><td>Im Haus</td><td></td><td>Die monophoshonierte Triarylmethylsonde wurde gemäß ref 12 synthetisiert</td></tr></tbody></table>

in vivo epr-bewertung der ph, po2, redox-status, und konzentrationen von phosphat und glutathion in der tumor-mikroumgebung

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit der Low-Bereich Elektron paramagnetischen Resonanz (EPR)-basierte Techniken in Kombination mit funktionalen paramagnetischen Sonden quantitative Angaben zu den chemischen Tumor Mikroumgebung (TME), einschließlich p O2, pH-Wert, Redox-Status, Konzentrationen von interstitiellen anorganischem Phosphat (Pi) und intrazellulären Glutathion (GSH). Insbesondere eine Anwendung einer neu entwickelten lösliche multifunktionale Trityl Sonde bietet unübertroffene Möglichkeit für in Vivo gleichzeitige Messungen von pH, pO2 und Pi E Xtracellular Raum (Hoffnung Sonde). Die Messungen der drei Parameter, die mit einer einzigen Sonde erlauben ihre Korrelation Analysen unabhängig von Sonde Verteilung und Zeit der Messungen.

Gewebe p O 2 Bewertung der LiNc-Auftrieb mit Sonden:
Mit dem Verfahren unter Schritt 1.1 beschrieben, haben wir die Kalibrierung von frisch zubereiteten LiNc-Auftrieb Mikrokristalle Aussetzung durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die typische Sauerstoff Abhängigkeit die Linienbreite der LiNc-Auftrieb ...

Low-Bereich (L-Band, 1,2 GHz) Elektron paramagnetischen Resonanz mit löslichen Nitroxyl und Trityl Sonden wird zur Beurteilung der physiologisch wichtigen Parameter in den Tumor Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs gezeigt.

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Das übergeordnete Ziel dieser in vivo elektronenparamagnetischen Resonanztechnologie ist es, die physiologisch relevanten Parameter der lokalen Gewebemikroumgebung im präklinischen Umfeld in Tiermodellen von Krebs quantitativ und nichtinvasiv zu bewerten. Diese Technik basiert auf der Kombination von Fluorofeld-APR mit speziellen funktionalen paramagnetischen Sonden, um quantitative Informationen über die Oxygenierung des Gewebes als CDT im Dock-Status sowie über interstitielle organische Phosphat- und interzelluläre Konzentrationen zu liefern. Diese nicht-invasive Technik bietet einen einzigartigen Einblick in die Welt der Tumormikroumgebung und der Tumorregenese und kann zur zukünftigen rationalen Gestaltung von Krebstherapeutika beitragen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen.Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auf die Wechselbeziehung des Gehirns zwischen den Anwendungsparametern multifunktionaler APR-Sonden. Dies bietet zusätzliche Einblicke in die zugrunde liegenden biologischen Mechanismen. Neben mir und Andrey werden Marieta Gencheva und Dr. Benoit Driesschaert sowie eine Doktorandin, Kayla Steinberger vom IMMR Center, das Verfahren demonstrieren.Um die partikelsauerstoffempfindliche Sonde vorzubereiten, wiegen Sie zunächst 60 Milligramm der Mikrokristalle. Für die Kalibrierung der Sauerstoffempfindlichkeit suspendieren Sie Mikrokristalle in drei Millilitern dolbeckas modifiziertem Eagle-Medium. Fünf Minuten lang auf Eis mit einem Sonden-Ultraschallgerät bei 20 Kilohertz und sieben Watt Leistung in einem Fünf-Milliliter-Glasrohr mit rundem Boden beschallen.Als nächstes geben Sie einen Milliliter der beschallten Mikrokristalle in ein Glasröhrchen in den Oberflächenspulenresignator des L-Band-EPR-Spektrometers. Erfassen Sie kontinuierliche Wellen EPR-Spektren bei einer physiologischen Temperatur von 37 Grad Celsius und Sauerstoffkonzentrationen von null, eins, zwei, vier, acht und 20,9 Prozent. Zur Vorbereitung der pH- und Redoxsonde mit Doppelfunktion lösen Sie 6,34 Milligramm der Sonde in einem Milliliter Kochsalzlösung.Stellen Sie den pH-Wert mit kleinen Mengen Salzsäure oder Natriumhydroxid mit einem pH-Messgerät auf 7,2 ein. Um die pH-Kalibrierung der Nitroxidsonde durchzuführen, geben Sie zunächst 0,1 Milliliter der Sondenstammlösung zu 0,9 Millilitern von zwei Millimolaren Natriumphosphatpuffern, 150 Millimolar Natriumchlorid. Dann titriert die erhaltene ein-millimolare Sondenlösung mit Zuordnungen von Salzsäure oder Natriumhydroxid unter Verwendung eines pH-Messgeräts auf den erforderlichen pH-Wert.Nehmen Sie die EPR-Spektren der Proben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem L-Band-EPR-Spektrometer auf. Zur Vorbereitung der GSH-empfindlichen RSSR-Sonde lösen Sie 4,05 Milligramm der Sonde in einem Milliliter DMSO-Lösung. Bestimmen Sie als nächstes den Wert der Geschwindigkeitskonstante der Reaktion von RSSR mit GSH.Dazu werden zunächst 20 Mikroliter der RSSR-Stammlösung zu 0,98 Millilitern eines millimolaren Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,2, 150 millimolares Natriumchlorid gegeben, um eine 0,2 millimolare RSSR-Sondenlösung zu erhalten. Mischen Sie dann gleiche Volumina von 0,2 Millimolar RSSR-Lösung in einer der GSH-Lösungen, um eine Endkonzentration der Sonde bei 0,1 Millimolar und von GSH bei 0,5, einem oder 2,5 Millimolar zu erreichen. Unmittelbar nach dem Mischen der RSSR- und GSH-Lösung legen Sie die Probe in den EPR-Resignator und zeichnen Sie die EPR-Spektren alle 12 Sekunden für 10 Minuten auf.Berechnen Sie dann die Kinetik der Erhöhung der monoradikalen spektralen Amplitude für die multifunktionale HOPE-Sonde zur Bewertung des Sauerstoff-pH-Werts und des Pi. Lösen Sie 10,7 Milligramm der Sonde in einem Milliliter Kochsalzlösung auf und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Geben Sie dann 20 Mikroliter der vorbereiteten Stammlösung zu 0,98 Millilitern der Kochsalzlösung, um eine 0,2 Millimolare Sondenlösung zu erhalten.Für die Sondenkalibrierung des pH-Werts titrieren Sie 0,2 Millimolar der Sondenlösung durch Zugabe eines kleinen Volumens Natriumhydroxid oder Salzsäure, so dass die endgültige Verdünnung der Probe weniger als 1 %Die EPR-Spektren werden bei einem mittleren pH-Wert erfasst, wie im Textprotokoll beschrieben. Für die Kalibrierung der Sauerstoffempfindlichkeitssonde erfassen Sie EPR-Spektren der Sonde bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen, wie im Textprotokoll beschrieben. Für die Sondenkalibrierung von Pi ist die EPR-Spezra der Sonde bei verschiedenen Phosphatkonzentrationen zu erfassen.Verwenden Sie die radikalische Lösung mit einem pH-Wert nahe dem PKA und titrieren Sie sie mit verschiedenen Phosphatkonzentrationen. Halten Sie die Temperatur und die Gaszusammensetzung wie bisher. Im Falle des MET1-Tumormodells zur Internalisierung der partikulären Sonde in MET1-Zellen werden 100 Mikroliter der beschallten Suspension in einen T75-Kolben mit 10 Millilitern Nährmedium gegeben, das MET1-Zellen enthält.Alle Verfahren finden in einer Biosicherheitswerkbank statt und das Medium enthält Penicillin und Streptomycin, um mögliche Infektionen zu minimieren. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder bis sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen fünfmal mit 10 Millilitern PBS.Trennen Sie die Zellen mit fünf Millilitern Tripson EDTA. Nach der Entnahme der Zellen und dem Zentrifugieren wie zuvor wird die Zellprobe mit dem Ausschlussfarbstoff gefärbt, um die Lebensfähigkeit und Menge der Zellen zu bestimmen. Suspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von einer Million Zellen pro 100 Mikroliter in minimalem DMEM.Injizieren Sie mit einer Insulinspritze langsam 100 Mikroliter der Zellsuspension mit den internalisierten Mikrokristallen in die vier Brustfettpolster einer acht Wochen alten, weiblichen Wildtyp-Maus, wie im Textprotokoll beschrieben. Überwachen Sie die Tumorentstehung und das Tumorwachstum. Für EPR-spektroskopische Messungen werden die Mäuse durch Inhalation eines Luftisophloran-Gemisches mit einem Anästhesiegerät anästhesiert, wie im Textprotokoll beschrieben.Führen Sie Funktionsmessungen mit einem L-Band-EPR-Spektrometer durch, indem Sie den Oberflächenspulenresignator auf eine normale Brustdrüse oder einen Brusttumor aufsetzen. Fahren Sie mit dem Einstellen des Spektrometers fort. Bei löslichen Sonden sollten die EPR-Spektren unmittelbar nach der Sondeninjektion für fünf bis 10 Minuten erfasst werden.Erfassen Sie die EPR-Spektren von der implantierten Partikelsonde für fünf bis 10 Minuten über mehrere Wochen nach der Implantation. Analysieren Sie abschließend die EPR-Spektren und die Sonden, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist die spektrale EPR-Empfindlichkeit der partikulären LiNc-BuO-Sonde gegenüber Sauerstoff dargestellt.Das EPR-Spektrum wurde bei 0 % pO2 und 37 Grad Celsius gemessen. Repräsentativ für die Linienbreite des EPR-Spektrums der Sondensuspension auf den Sauerstoffpartialdruck sind dargestellt. Die Linienbreite nimmt linear mit pO2 zu.Ein Spektrum, das im Brusttumorgewebe einer anästhesierten weiblichen Maus gemessen wird, entspricht einem Gewebeteilsauerstoff von 7,5 Millimeter Quecksilbersäule. L-Band-EPR-Spektren der NR-Sondenlösung wurden bei 37 Grad Celsius bei verschiedenen pH-Werten aufgenommen. Die Abhängigkeit der beobachteten Hyperfeinspaltungskonstante vom pH-Wert wird aufgetragen und mit der Standard-Titrationskurve angepasst.Hier ist die multifunktionale Bewertung der Tumormikroumgebung zu sehen, die die sauerstoffempfindliche LiNc-BuO-Sonde in der Doppelfunktion pH in Redox-NR-Sonde kombiniert. Das beobachtete Triplett-Spektrum der NR wird mit der einzelnen EPR-Linie der LiNc-BuO-Sonde überlagert, die in den Tumor eingebettet ist. Hier wird die In-vivo-EPR-Bewertung der Glutathionkonzentrationen im intrazellulären Gewebe gezeigt.Die Kinetik der monoradikalen spektralen Peek-Intensitätsänderung, gemessen durch L-Band-EPR, im Mammatumor in der normalen Brustdrüse von FVBN-Mäusen unmittelbar nach intratissualer Injektion der RSSR-Sonde, ist dargestellt. Die schnellere Kinetik spiegelt die höhere GSH-Konzentration im Tumorgewebe wider. Die Technik unterstützt Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung mit den überragenden Möglichkeiten zur In-vivo-Durchführung zellphysiologischer wichtiger Parameter der Tumormikroumgebung und des Transpotentials für die Translation.Die Empfindlichkeit der Sonden nach den bisherigen Verfahren erfordert Fachwissen in der Synthesechemie und ist entscheidend für die Präsentation. Unser Zentrum berichtete über die Schwierigkeiten dieser Technologie und ging gemeinsam an die Standorte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Eine neue Elektronenspinresonanz (EPR) Verfahren, schnelle Scan - EPR (RS-EPR) wird für 2D - spektrale räumliche Abbildung gezeigt , die auf die traditionelle kontinuierliche Welle (CW) Technik überlegen ist , und eröffnet neue Orte für in - vivo - Bildgebung. Die Ergebnisse werden bei 250 MHz gezeigt, aber die Technik ist bei jeder Frequenz anwendbar.

Rapid-Scan-Elektronenspinresonanz eröffnet neue Wege für Imaging Physiologisch Wichtige Parameter<em&gt; In Vivo</em

Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung eines Tiermodells, das es ermöglicht, die Auswirkungen von Tumorhypoxie auf die Metastasierung direkt zu testen und die Mechanismen ihrer Wirkung zu entschlüsseln. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf das Ewing-Sarkom konzentrieren, kann ein ähnlicher Ansatz auf andere Tumorarten angewendet werden.

In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Wir beschreiben eine nicht-invasive in Vivo imaging-Protokoll, das schlanke und kostengünstige, Verwendung von L-012, eine Chemolumineszenz Luminol-Analog, zu visualisieren und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzielte eine excisional Wunde Mausmodell zu quantifizieren.

In Vivo Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Murine Wunde Modell

Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Wir haben eine reproduzierbare Methode entwickelt, um die Internalisierung von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem Adenosintriphosphat (ATP), einem ATP-Surrogat, mit hoher zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Wir validierten unsere Methode mit unabhängigen In-vitro- und In-vivo-Assays - humane Tumorzelllinien und immundefiziente Mäuse, die mit menschlichem Tumorgewebe xenotransplantiert wurden.

Fluoreszenzmikroskopie für ATP-Internalisierung, vermittelt durch Makropinozytose in menschlichen Tumorzellen und tumor-xenografierten Mäusen

Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung, Kultivierung und Visualisierung von menschlichen Krebserkrankungen, die Metastasen in die Peritonealoberflächen gebildet haben. Resezierte Tumorproben werden mit einem Vibratom geschnitten und auf permeablen Einsätzen kultiviert, um die Sauerstoffversorgung und Viabilität zu erhöhen, gefolgt von Bildgebung und nachgeschalteten Analysen mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie.

Kultivierung und Bildgebung von ex vivo organotypischen Pseudomyxoma-Peritonei-Tumorschnitten aus resezierten humanen Tumorproben

Quantitative 3D-Sauerstoffkarten von murinen Tumoren wurden nichtinvasiv mit Hilfe der Pulselektronen-Paramagnetischen Resonanz abgebildet. Ultraschall B-Modus und Power-Doppler wurden für die Anatomie und den Gefäßaufbau eingesetzt. Bilder aus beiden Modalitäten wurden überlagert, um eine multiparametrische Tumoranalyse zu ermöglichen.

Beurteilung der Tumorhypoxie: In vivo 3D-Sauerstoffbildgebung durch paramagnetische Elektronenresonanz 

Erfahren Sie die quantitative und nicht-invasive EPR-Bewertung von Sauerstoff, pH-Wert und Redox-Status im Tumor-Mikromilieu von Brustkrebs-Mausmodellen. Diese Technik liefert wertvolle Einblicke für die zielgerichtete Krebstherapie.

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO₂, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

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