Name: In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Erfahren Sie die quantitative und nicht-invasive EPR-Bewertung von Sauerstoff, pH-Wert und Redox-Status im Tumor-Mikromilieu von Brustkrebs-Mausmodellen. Diese Technik liefert wertvolle Einblicke für die zielgerichtete Krebstherapie.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NIH CA194013, CA192064 und U54GM104942 gewährt. Die WVCTSI ist für Start-up zum VVK, AB und TDE anerkannt. Die Autoren danken Dr. M. Gencheva und K. Steinberger für die Hilfe mit den anschaulichen Experimenten. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellten Methoden können für nicht-invasive in Vivo Beurteilung der kritischen Parameter der chemischen TME pO2, pH-Wert, Redox-Status und Konzentrationen von interstitiellen Pi und intrazellulären GSH. Magnet-Resonanz-Techniken, wie MRI und Low-Bereich EPR, sind die Methoden der Wahl für die nicht-invasive in Vivo Profilierung dieser TME-Parameter. MRI anatomische Strukturen visualisiert aber funktionelle Sensitivität fehlen. Im Gegensatz zu MRI bieten EPR-Techniken funktio...

Eine zentrale Rolle des TME in der Tumorprogression und Therapie ist immer geschätzt1. Unter wichtige physiologische Parameter von TME in soliden Tumoren, Gewebe Hypoxie2, Azidose3,4, hohe Reduzierung Kapazität5, erhöhte Konzentrationen von intrazellulären GSH-6,-7, und interstitielle Pi8 sind gut dokumentiert. Nicht-invasive in-vivo pO2, pH-Wert, Pi, GSH und Redox Bewertungen bieten einzigartige Einblicke in die biologischen Prozesse im TME und voraus-Tools für präklinische Screening von Anti-Krebs-Medikamente und TME-gezielte therapeutische Strategien zu helfen. Eine vernünftigen Radiofrequenz Eindringtiefe im Gewebe durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) und Low-Bereich EPR-basierte Techniken macht sie das am besten geeignete Ansätze für nicht-invasive Beurteilung dieser TME-Parameter. MRI stützt sich weitgehend auf bildgebende Wasser Protonen und ist weit verbreitet in klinischen Einrichtungen, anatomische Auflösung bieten aber funktionelle Lösung fehlt. Die Kernspinresonanz Phosphor-31 (31P-NMR) Messungen der extrazellulären Pi Konzentration und pH-Wert basierend auf ein Signal von endogenen Phosphat sind potentiell attraktiv für TME Charakterisierung, aber sind normalerweise um ein Vielfaches maskiert höheren intrazellulären Pi Konzentrationen9,10. Im Gegensatz dazu EPR-Messungen setzen auf Spektroskopie und Bildgebung des speziell entworfen paramagnetische Sonden, funktionelle Lösung bereitzustellen. Beachten Sie, dass exogene EPR-Sonden einen Vorteil gegenüber exogenen haben Sonden NMR wegen der viel höheren inneren Empfindlichkeit des EPR und Fehlen von endogenen Hintergrund EPR Signalen. Die jüngste Entwicklung von einer Doppelfunktion pH und Redox Nitroxyl probe11 und multifunktionale Trityl Sonde12 bietet unübertroffene Möglichkeiten für in Vivo gleichzeitige Messungen von mehreren TME-Parameter und ihre Korrelation Analysen unabhängiger Sonde Verteilung und Uhrzeit der Messung. Unseres Wissens gibt es keine anderen Methoden zur Verfügung, um gleichzeitig in Vivo physiologisch wichtigen chemischen TME Parameter in lebendigen Subjekten, z. B. pO2pHe, Pi, Redox und GSH bewerten.
Sonden für In Vivo Funktionsmessungen:
Abbildung 1 zeigt die chemische Strukturen der paramagnetischen Sonden TME Zugriff auf Parameter, darunter Partikel- und lösliche Sonden verwendet. Hohe funktionale Empfindlichkeit, Stabilität in lebendem Gewebe und minimale Toxizität sind ein paar Vorteile, die partikuläre Sonden bevorzugt über lösliche Sonden für in Vivo EPR Pulsoxymetrie machen. Zum Beispiel haben partikuläre Sonden Retentionszeiten auf dem Gelände des Gewebes Implantat im Vergleich zu löslichen Sonden für longitudinale Messung des Gewebes pO2 über mehrere Wochen erhöht. Auf der anderen Seite lösliche Sonden übertreffen partikuläre Sonden durch die Bereitstellung von räumlichen gelöst Messungen mittels EPR-basierte bildgebende Verfahren sowie die begleitende Analysen von mehreren Funktionalitäten (pO2, pH, Pi, Redox, und GSH).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg"> Abbildung 1. Chemische Strukturen der paramagnetischen Sonden, die TME Bewertung Assay zusammenbauen. Dazu gehören die Partikel pO2 Sonde, LiNc-Auftrieb (R = - O (CH2)3CH3), und lösliche Sonden: Doppelfunktion pH und Redox Sonde, NR; GSH-Sensitive Sonde, RSSR; und multifunktionale pO2, pH und Pi-Sonde von der extrazellulären Mikroumgebung, die Hoffnung Sonde. Die Synthese von diese Sonden wurde in die angegebenen Referenzen 11,12beschrieben. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>L-Band EPR-Spektrometer</td><td>Magnettech, Deutschland</td><td></td><td>L-Band (1,2 GHz) Elektronen-Paramagnetresonanz (EPR) Spektrometer zur Erfassung von in vitro und in vivo Spektren paramagnetischer Moleküle</td></tr><tr><td>&nbsp; Temperatur & Gas-Controller&nbsp;</td><td>Noxygen, Deutschland</td><td></td><td>Temperatur & Temperatur Gasregler zur Steuerung und Einstellung der Temperatur und Gaszusammensetzung&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutathion reduziert)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; Mäuse</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Met-1 murine Brustkrebszellen</td><td>Inhouse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Wildtyp-Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Ausschlussfarbstoff&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat einbasisch</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoseoxydase</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Zirkulator E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter Orion</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiNc-BuO-Sonde</td><td>Im Haus</td><td></td><td>Die Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanin-Sonde wurde gemäß Ref 13</td></tr><tr><td>NR-Sonde</td> synthetisiert <td>Im Haus</td><td></td><td>Die Nitroxidsonde wurde gemäß Ref 11 synthetisiert</td></tr><tr><td>RSSR-Sonde</td><td>Im Haus</td><td></td><td>Die Di-Nitroxid-Sonde wurde gemäß Ref 15 synthetisiert</td></tr><tr><td>sonde</td><td>Im Haus</td><td></td><td>Die monophoshonierte Triarylmethylsonde wurde gemäß ref 12 synthetisiert</td></tr></tbody></table>

in vivo epr-bewertung der ph, po2, redox-status, und konzentrationen von phosphat und glutathion in der tumor-mikroumgebung

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit der Low-Bereich Elektron paramagnetischen Resonanz (EPR)-basierte Techniken in Kombination mit funktionalen paramagnetischen Sonden quantitative Angaben zu den chemischen Tumor Mikroumgebung (TME), einschließlich p O2, pH-Wert, Redox-Status, Konzentrationen von interstitiellen anorganischem Phosphat (Pi) und intrazellulären Glutathion (GSH). Insbesondere eine Anwendung einer neu entwickelten lösliche multifunktionale Trityl Sonde bietet unübertroffene Möglichkeit für in Vivo gleichzeitige Messungen von pH, pO2 und Pi E Xtracellular Raum (Hoffnung Sonde). Die Messungen der drei Parameter, die mit einer einzigen Sonde erlauben ihre Korrelation Analysen unabhängig von Sonde Verteilung und Zeit der Messungen.

Gewebe p O 2 Bewertung der LiNc-Auftrieb mit Sonden:
Mit dem Verfahren unter Schritt 1.1 beschrieben, haben wir die Kalibrierung von frisch zubereiteten LiNc-Auftrieb Mikrokristalle Aussetzung durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die typische Sauerstoff Abhängigkeit die Linienbreite der LiNc-Auftrieb ...

Low-Bereich (L-Band, 1,2 GHz) Elektron paramagnetischen Resonanz mit löslichen Nitroxyl und Trityl Sonden wird zur Beurteilung der physiologisch wichtigen Parameter in den Tumor Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs gezeigt.

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Das übergeordnete Ziel dieser in vivo elektronenparamagnetischen Resonanztechnologie ist es, die physiologisch relevanten Parameter der lokalen Gewebemikroumgebung im präklinischen Umfeld in Tiermodellen von Krebs quantitativ und nichtinvasiv zu bewerten. Diese Technik basiert auf der Kombination von Fluorofeld-APR mit speziellen funktionalen paramagnetischen Sonden, um quantitative Informationen über die Oxygenierung des Gewebes als CDT im Dock-Status sowie über interstitielle organische Phosphat- und interzelluläre Konzentrationen zu liefern. Diese nicht-invasive Technik bietet einen einzigartigen Einblick in die Welt der Tumormikroumgebung und der Tumorregenese und kann zur zukünftigen rationalen Gestaltung von Krebstherapeutika beitragen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen.Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auf die Wechselbeziehung des Gehirns zwischen den Anwendungsparametern multifunktionaler APR-Sonden. Dies bietet zusätzliche Einblicke in die zugrunde liegenden biologischen Mechanismen. Neben mir und Andrey werden Marieta Gencheva und Dr. Benoit Driesschaert sowie eine Doktorandin, Kayla Steinberger vom IMMR Center, das Verfahren demonstrieren.Um die partikels

in-vivo-epr-assessment-ph-po2-redox-status-concentrations-phosphate

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Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung eines Tiermodells, das es ermöglicht, die Auswirkungen von Tumorhypoxie auf die Metastasierung direkt zu testen und die Mechanismen ihrer Wirkung zu entschlüsseln. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf das Ewing-Sarkom konzentrieren, kann ein ähnlicher Ansatz auf andere Tumorarten angewendet werden.

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Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für die In-Vivo Bildgebung des Glioblastoms Xenotransplantate

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Wir haben eine reproduzierbare Methode entwickelt, um die Internalisierung von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem Adenosintriphosphat (ATP), einem ATP-Surrogat, mit hoher zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Wir validierten unsere Methode mit unabhängigen In-vitro- und In-vivo-Assays - humane Tumorzelllinien und immundefiziente Mäuse, die mit menschlichem Tumorgewebe xenotransplantiert wurden.

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In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO₂, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

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