Umfassenden Workflow zur genomweiten Identifizierung und Ausdruck Meta-Analyse von der ATL E3 Ubiquitin Ligase Genfamilie in Grapevine

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine umfassende Charakterisierung einer Genfamilie in Pflanzen im Rahmen eines globalen Ansatzes zu erreichen, der die Definition der Genstruktur, der betroffenen Proteinmotive, der chromosomalen Lokalisation, der Genduplikationen und der Expressionsmuster umfasst. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Klassifizierung von Pflanzen in Familien zu beantworten, wie z. B. die weltweite genomische Identifizierung von Familienmitgliedern und ihre Transkriptomie liefert dies durch Genexpressionsanalyse. Der Hauptvorteil des gesamten Verfahrens besteht darin, dass eine vollständige Liste experimenteller Schritte zur Verfügung steht, um eine vollständige Charakterisierung der Genfamilie zu erreichen.

Dieses Verfahren kann auf jede Genfamilie jeder Pflanzenart angewendet werden, für die genetische Daten vorliegen. Darüber hinaus liefert dieser Ansatz wertvolle Informationen, um interessante Kandidaten für funktionelle Studien zu identifizieren. Das Ganze wird von Pietro Ariani aus meinem Labor vorgeführt.

Öffnen Sie die Blast-Webseite und klicken Sie auf den Abschnitt Protein Blast. Geben Sie im Feld Abfragesequenz eingeben die Aminosäuresequenz des Proteins ein, das als Sonde zur Identifizierung der anderen Familienmitglieder verwendet wird. Verwenden Sie ein Protein, das alle wichtigen Merkmale aufweist, die die Familie charakterisieren.

Wählen Sie anschließend im Feld Suchset aus, wählen Sie die Referenzproteindatenbank und den gewünschten Organismus aus. Wählen Sie nun in der Feldprogrammauswahl den PSI-BLAST-Algorithmus aus. Klicken Sie bei Bedarf auf Algorithmusparameter, um erweiterte Parameter wie maximale Zielsequenz und Scoring-Matrix anzupassen.

Der E-Wert ist der Schwellenwert, der für diese Suche von 005 auf 001 gesenkt wird. Klicken Sie auf die Schaltfläche BLAST, um die Analyse auszuführen. Deaktivieren Sie aus allen Sequenzen, die relative Übereinstimmungen mit der Abfrage anzeigen, die Einträge, die eindeutig nicht zur Familie gehören.

Klicken Sie dazu auf das Häkchen in der Spalte "Für PSI-BLAST auswählen". Führen Sie dann eine zweite PSI-BLAST-Iteration aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Los" klicken. Alle neu identifizierten Sequenzen werden gelb hervorgehoben.

Deaktivieren Sie erneut die Treffer, die nicht zur Familie gehören. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis der Algorithmus keinen relevanten Eintrag findet oder die Konvergenz erreicht. Sobald alle False-Positives aussortiert sind, sammeln Sie die Aminosäuresequenzen in einer FASTA-formatierten Datei und laden Sie die Datei in die Bioinformatik-Software-Suite hoch.

Wählen Sie als Nächstes alle importierten Sequenzen in der Liste aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausrichten/Zusammenfügen in der Symbolleiste. Klicken Sie dann auf Paarweise Mehrfachausrichtung und wählen Sie MUSKELAUSRICHTUNG und OK. Die Ausrichtung erfolgt nun unter Verwendung der Standardeinstellungen. Visualisieren Sie nun das Sequenzlogo des Alignments und untersuchen Sie die Gene visuell, um nach falsch-positiven Ergebnissen zu suchen.

Weitere Analysen der physikalischen Parameter und Domänen des Proteins, der chromosomalen Verteilung, der Duplikationen und der Organisation des Exon-Introns werden im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes analysieren wir die Beziehungen zwischen den Mitgliedern der ATL-Familie durch die Konstruktion eines qualitativ hochwertigen phylogenetischen Baums und die Definition einer Familiennomenklatur. Rufen Sie zunächst die arabischen Adopt-Systeliana-ATL-Sequenzen ab, die als Referenzen für eine Gennomenklatur für Weinreben erforderlich sind, aus der UmoProt-Datenbank als Referenz.

Erstellen Sie dann eine FASTA-Datei, die alle Nukleotidsequenzen der Weinrebe und die Mitglieder der Arabidopsis-Genfamilie für die phylogenetische Analyse enthält. Durchsuchen Sie nun die Homepage von phylogenie frankreich, und wählen Sie die Pipeline für die phylogeniebasierte Analyse aus. In den meisten Fällen ist ein Klick ausreichend, aber bei Bedarf ist es möglich, bestimmte erweiterte Einstellungen mit den erweiterten Optionen auszuwählen oder sogar eine vollständig angepasste Analyse mit den À-la-carte-Optionen.

Geben Sie als Nächstes einen Namen für die Analyse ein und laden Sie die FASTA-Datei hoch. Klicken Sie dann auf Senden, um die Analyse auszuführen. Wenn dieses Verfahren zu einer Fehlermeldung führt, führen Sie jeden Schritt der Phylogenie-Suite-Pipeline einzeln aus.

Gehen Sie zunächst auf die Homepage der MUSCLE-Software und laden Sie die FASTA-Datei hoch. Wählen Sie Pearson FASTA als Ausgabeformat aus und senden Sie es. Laden Sie als Nächstes die Datei im FASTA-Format herunter und beseitigen Sie alle schlecht ausgerichteten Positionen.

Öffnen Sie das G-Block-Server-Tool, laden Sie die Alignment-FASTA-Datei hoch, wählen Sie DNA als Sequenztyp aus und wählen Sie die Stringenz, die am besten zur Analyse passt. Wählen Sie für eine Ausrichtung der ATL-Genfamilie der Weinrebe alle drei Optionen aus, die aufgrund der hohen Sequenzdivergenz für eine weniger strenge Selektion vorgeschlagen wurden. Klicken Sie dann auf Blöcke abrufen, um die Analyse auszuführen.

Um die Ergebnisse zu speichern, klicken Sie unten auf der Ausgabeseite auf die resultierende Ausrichtung und erstellen Sie eine neue FASTA-Datei. G-Blöcke eliminieren schlecht ausgerichtete Positionen in divergenten Regionen einer DNA oder des Prodding-Alignments, so dass sie für eine phylogenetische Analyse besser geeignet sind. Für diesen Schritt ist die Auswahl der imperialen Parameter für die Stringenz der Spalten entscheidend, um sicherzustellen, dass sie eine der drei Verbindlichkeiten darstellen.

Um den Stammbaum zu vervollständigen, wenden wir uns der Homepage von Phylogenie Frankreich zu. Wählen Sie dort die À-la-carte-Pipeline aus, und deaktivieren Sie die folgenden Optionen: Mehrfachausrichtung und Ausrichtungskuration. Klicken Sie anschließend auf Workflow erstellen, laden Sie die von G-Blöcken kuratierte FASTA-Datei hoch, wählen Sie das Bootstrapping-Verfahren aus und verwenden Sie die Standardparameter und -einstellungen.

Klicken Sie abschließend auf Senden, um die Analyse auszuführen. Damit ist der Schritt-für-Schritt-Prozess abgeschlossen. Nachdem der phylogenetische Baum erstellt wurde, reduzieren Sie die schlecht gestützten Zweige mit Bootstrap-Werten von weniger als 70 % und laden Sie dann die Endergebnisse im Newick-Format herunter, um sie weiter zu analysieren.

Das Textprotokoll enthält Anweisungen zur Vergabe eines Gennamens auf der Grundlage der Phylogenie. Erstellen Sie für dieses Protokoll eine angetippte, lineierte Textformatdatei mit arma-normalisierten Expressionswerten, die aus einer Genexpressionsbibliothek entnommen wurden. Organisieren Sie die Werte für jedes Familiengen in denselben Musterzeilen.

Führen Sie als Nächstes die hierarchische Bi-Cluster-Analyse mit einer Multi-Experiment-Viewer-Software durch. Laden Sie zunächst die Arbeitsdatenmatrix hoch und wählen Sie die Textdatei aus. Wählen Sie ein einfarbiges Array aus, und entfernen Sie das Häkchen aus der Ladeanmerkung, wenn keine automatische Anmerkung bereitgestellt wird.

Wählen Sie den Ausdruckswert ganz oben links in der Vorschau der Ausdruckstabelle aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden. Passen Sie als Nächstes die Daten an, indem Sie die Log2-Transformation und die Gen-/Zeilennormalisierung anwenden. Legen Sie dann das richtige Skalierungslimit fest.

Berechnen Sie nun die hierarchische Clusterbildung. Wählen Sie im Feld "Bestelloptimierung" die Option "Genblattreihenfolge optimieren" und "Probenblattreihenfolge optimieren" aus. Wählen Sie anschließend im Auswahlfeld für die Verknüpfungsmethode die Option Durchschnittliches Verknüpfungs-Clustering aus, und wählen Sie im Auswahlfeld für die Entfernungsmatrix die Option Pearson-Korrelation aus.

Klicken Sie dann auf OK, um die Analyse auszuführen. Zeigen Sie die Ergebnisse im linken Bereich des Fensters an und exportieren Sie die Heatmap, indem Sie im Dateimenü auf Bild speichern klicken. Das Gen, das Arabidopsis thaliana ATL2 am ähnlichsten ist, wurde laut einer BLAST-P-Suche verwendet, um die Mitglieder der ATL-Familie im Genom der Weinrebe zu untersuchen.

Die PSI-BLAST-Analyse konvergierte nach einigen Zyklen und lieferte eine Liste mutmaßlicher Gene in der Genfamilie. Das Vorhandensein der kanonischen Ring-H2-Domäne für jeden Kandidaten wurde durch visuelle Inspektion des MUSCLE-Alignments bewertet. Dadurch wurde die Suche auf 96 Gene von Weinreben eingegrenzt.

Eine phylogenetische Analyse der identifizierten Gene zum Vergleich mit der arabidopsis ATL-Genfamilie wurde für eine Nomenklatur verwendet. 13 von 96 ATLs von Weinreben erhielten einen spezifischen Identifikator als Arabidopsis-ATL-Genortholog. Die Kartierung der identifizierten Gene auf den globalen Genexpressionsatlas der Weinrebe unter Verwendung einer hierarchischen Bi-Cluster-Analyse zeigte, dass alle 96 in mindestens einem Gewebe exprimiert werden und fünf Expressionscluster identifiziert werden können.

Ein ähnlicher Ansatz wurde angewendet, um die Expression dieser Gene als Reaktion auf biotischen Stress zu untersuchen. Es gab eine direkte Beteiligung der ATL-Genfamilie als Reaktion auf eine Erregerinfektion, wobei 62 Gene eine signifikante Modulation in mindestens zwei Erkrankungen zeigten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit der Software umgehen, die zur Charakterisierung einer Genfamilie verwendet wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Merkmale einer bestimmten Genfamilie und die entsprechende Sonde, die für die Identifizierung des gesamten Genomfamilienmitglieds verwendet wird, sorgfältig zu definieren. Nach diesem Verfahren ist es möglich, die Evolution von Genfamilien und die Funktion von P30 zu untersuchen, indem zusätzliche phylogenetische Bäume erstellt werden, die auf anderen Arten als den für die Nomenklatur der Genfamilien erforderlichen Arten basieren.