Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Das übergeordnete Ziel der Isolierung intakter und reiner pflanzlicher Mitochondrien ist die Untersuchung der Atmung, der mitochondrialen Zusammensetzung, der Biogenese und des Stoffwechsels. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der pflanzlichen Energiebiologie zu beantworten, wie z.B. die Bedeutung von Mitochondrien und Stresstoleranz unter sich ändernden Umweltbedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ausreichende Mengen an reinen, intakten und funktionsfähigen Mitochondrien aus relativ kleinen Mengen pflanzlichen Gewebes isoliert werden konnten.

Das Verfahren wird von Wenhui Lyu und Jennifer Selinski aus meinem Labor demonstriert. Waschen Sie am Tag der mitochondrialen Isolierung den Gradientenausgießer und den PVC-Schlauch mit deionisiertem Wasser, um die Gradienten vorzubereiten. Neigen Sie sich, um zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis zu positionieren, so dass der Auslass des Schlauchs die Wand der Röhrchen berührt.

Drehen Sie dann den schwarzen Hebel nach unten, um die Verbindung zwischen der inneren und der äußeren Kammer zu schließen. Stellen Sie den Gradientenausgießer mit dem Magnetrührstab in der Innenkammer auf einen Magnetrührer. Gießen Sie dann 35 ml schwere Gradientenlösung in die innere Kammer.

Geben Sie die Hälfte der schweren Gradientenlösung mit 300 mL pro Stunde durch die Peristaltikpumpe in zwei Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gehalten werden. Gießen Sie dann 35 mL Lichtgradientenlösung in die äußere Kammer. Drehen Sie sofort den schwarzen Hebel halb nach oben, um die Verbindung zwischen der inneren und der äußeren Kammer wiederherzustellen, damit sich die Lösungen vorsichtig vermischen.

Das gesamte Gradientengemisch wird mit einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Stunde aus den Kammern ausgestoßen, um zwei kontinuierliche Gradienten von 0 % bis 4,4 % PVP zu bilden. Halten Sie die Gradienten vor der Verwendung immer auf Eis. Es ist wichtig, das Pflanzengewebe nicht zu übergründen, da sonst die Mitochondrien abgebaut werden.

Schneiden Sie für eine einzige Zubereitung das gesamte Rosettengewebe von mindestens 80 vier Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen ab, die auf Erde gewachsen sind. Geben Sie dann die Hälfte des geschnittenen Pflanzengewebes in einen abgekühlten großen Mörser und Stößel mit 75 ml Mahlmedium. Anschließend werden mit Mahlmedium vier Schichten Filtrationsmaterial mit einer Porengröße von 20 bis 25 m befeuchtet.

Verwenden Sie einen Kunststofftrichter, um die Homogenität durch alle vier Schichten des Filtermaterials zu filtern, und sammeln Sie sie in einem 500-ml-Konuskolben. Verwenden Sie zusätzlich 75 ml Schleifmedium, um die andere Hälfte des Gewebes zu zerkleinern. Kombinieren Sie dann das gesamte Homogenat im Filtrationsmaterial, um so viel wie möglich herauszufiltern.

Verwenden Sie 150 ml Schleifmedium, um das restliche Gewebe auf dem Filtermaterial zu zerkleinern, und filtrieren Sie es in einen 500-ml-Konuskolben. Verteilen Sie das gefilterte Homogenat in acht vorgekühlten 50-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen. Und zentrifugieren Sie bei 2.500 g bei vier Grad Celsius in einem Festwinkelrotor fünf Minuten lang.

Nachdem der Überstand in saubere Zentrifugenröhrchen gegossen wurde, wird erneut bei 17.500 g bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang in einem Rotor mit festem Winkel zentrifugiert. Lassen Sie 3 ml Überstand im Röhrchen. Anschließend mit einem feinen Pinsel das Pellet im restlichen Überstand vorsichtig wieder suspendieren.

Geben Sie 10 ml Waschpuffer mit einfacher Stärke in jedes der Röhrchen und poolen Sie alle vier Röhrchen in einem Zentrifugenröhrchen, was insgesamt zwei Röhrchen ergibt. Stellen Sie das Volumen mit einem Waschpuffer mit einfacher Stärke auf 50 ml ein und wiederholen Sie die Zentrifugationsschritte. Verteilen Sie das Pellet mit einer sehr kleinen Menge Waschpuffer mit dem feinen Pinsel und verwenden Sie dann eine Pipette, um das rohe mitochondriale Pellet in einem Röhrchen zu sammeln.

Schichten Sie dann die mitochondriale Suspension vorsichtig mit einer Pipette auf zwei kontinuierlichen Gradienten von 0 % bis 4 % PVP. Verwenden Sie einen Waschpuffer mit einfacher Stärke, um das Gewicht der Röhrchen auszugleichen, und führen Sie einen Zentrifugationslauf bei 40.000 g bei vier Grad Celsius für 40 Minuten durch. Denken Sie daran, die Bremse auszuschalten.

Aspirieren Sie vorsichtig die oberen fünf Zentimeter der Lösung über dem Mitochondrienband. Verteilen Sie dann die mitochondriale Lösung in zwei saubere Röhrchen und füllen Sie sie mit Waschpuffer in einfacher Stärke. Decken Sie die Öffnung des Röhrchens mit Kunststoffparaffinfolie ab und drehen Sie sie mehrmals um, um den kolloidalen Dichtegradienten und die Mitochondrien gleichmäßig zu verteilen.

Dann zentrifugieren Sie bei 31.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit langsamer Bremse. Saugen Sie den Überstand an und stellen Sie das Röhrchenvolumen mit einem Waschpuffer mit einer einzigen Stärke auf bis zu 50 ml ein. Für das richtige Mischen mehrmals invertieren.

Die Lösung wird bei 31.000 g 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit langsamer Bremse zentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und sammeln Sie anschließend das mitochondriale Pellet in 500 l Waschpuffer mit einfacher Stärke, wobei Sie eine Pipette mit modifizierter 200-l-Spitze verwenden. Bei geöffnetem Kolben 970 l luftgesättigtes Atmungsmedium in die Reaktionskammer geben.

Geben Sie dann mit einer modifizierten Pipette 150 g mitochondriales Gesamtprotein und 500 M Adenosintriphosphat in die Reaktionskammer, um die mitochondriale Atmung zu bestimmen. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab, um die mitochondriale Suspension kontinuierlich zu rühren. Klicken Sie nach dem Schließen des Kolbens auf Aufzeichnung starten, um den Sauerstoffverbrauch aufzuzeichnen.

Warten Sie ein oder zwei Minuten, um nach einer linearen Sauerstoffverbrauchsspur zu suchen, die auf einen stabilen Sauerstoffverbrauch hinweist. Fügen Sie dann 5 mM Succinat hinzu und zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauch etwa zwei Minuten lang auf. Fügen Sie 1 mM Adenosindiphosphat hinzu und zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauch weitere zwei Minuten lang auf.

Fügen Sie als Nächstes 1 mM Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Wasserstoff hinzu und setzen Sie die Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs etwa vier bis acht Minuten lang fort. Fügen Sie dann Reagenzien hinzu, um den Cytochrom-C-Signalweg zu hemmen, und zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauch über alternative Oxidase etwa zwei Minuten lang auf. KCN, Myxothiazol und Antimycin A sind allesamt Atemwegsgifte.

Es ist wichtig, die Sicherheitshinweise in den Sicherheitsdatenblättern zu befolgen. Bitte beachten Sie, dass verschiedene Länder unterschiedliche Gesetze für die Verwendung dieser Inhibitoren in unseren Experimenten haben. Als nächstes fügen Sie 5 mM Dithiothreitol und 10 mM Pyruvat hinzu, um die alternative Oxidase zu aktivieren.

Und nehmen Sie weitere fünf bis sieben Minuten auf. Zum Schluss 500 mM N-Propylgallat hinzufügen und zwei Minuten lang aufnehmen. Ein repräsentativer Gradient, der das Vorhandensein einer grünlich-weißen mitochondrialen Fraktion in der Nähe des unteren Randes der Gradientenlösung zeigt.

Thylakoide und andere Verunreinigungen, die auf der Gradientenlösung vorhanden sind, sind in dunkelgrünen Bändern gekennzeichnet. Repräsentative Spuren des Sauerstoffverbrauchs durch Mitochondrien, um die Integrität der äußeren Membran vor der Messung des Sauerstoffverbrauchs zu zeigen. Die Integrität der äußeren Membran war gut erhalten und zu etwa 90 % intakt.

Repräsentative Spuren des Sauerstoffverbrauchs durch Mitochondrien nach Zugabe von Substraten, Inhibitoren und Effektoren. Die Ergebnisse zeigen einen kompromittierten Cytochrom c und einen alternativen Oxidase-Signalweg. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pflanzliche Mitochondrien isoliert und analysiert.