Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die frühen Entwicklungsprozesse des Gehirns menschlicher neuronaler Vorläuferzellen schnell und reproduzierbar zu charakterisieren und die Auswirkungen wichtiger extrazellulärer Faktoren auf die Regulierung dieser Prozesse zu definieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Neuropsychiatrie und neurologische Entwicklungsstörungen zu beantworten, z. B. ob alle Betroffenen die gleiche zelluläre Anomalie haben oder ob jeder die spezifische Dysfunktion einer Person aufweist. Der Hauptvorteil unseres Protokolls besteht darin, dass es schnell, hochreproduzierbar und einfach zu implementieren ist.

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in neurologische Entwicklungsstörungen zu erhalten, kann sie auch zur Untersuchung neurodegenerativer und neuropsychiatrischer Erkrankungen wie Alzheimer und Depressionen verwendet werden. Eine visuelle Demonstration einiger dieser Methoden ist notwendig, da einige Techniken das Verschieben von Zellen von einer Schale in eine andere beinhalten oder morphologische Analysen erfordern, die am besten durch visuelle Demonstration vermittelt werden. Um die menschlichen neuralen Vorläuferzellen anzuheben, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Aspirieren Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung und geben Sie 500 Mikroliter 1X-Zellablösungslösung in eine Vertiefung mit den neuralen Vorläuferzellen. Inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie anschließend eine P1000-Pipette, um 500 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzuzufügen, die bei Raumtemperatur gehalten wird, um die Zellen zu waschen und zu entfernen.

Übertragen Sie dann die Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Vertiefung erneut mit einem Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung und geben Sie die Wäsche in die Tube. Als nächstes drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g, um das Pellet zu bilden.

Entsorgen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in ein bis fünf Millilitern vorgewärmtem DMEM F12-Medium. Platte 100.000 Zellen in dreifachen Wells in einer 24-Well-Platte. Geben Sie nach 46 Stunden tritiiertes Thymidin in das Kulturmedium und inkubieren Sie es zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Dann, nachdem Sie das Medium entfernt haben, fügen Sie 300 Mikroliter vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen auseinander zu brechen und die DNA freizusetzen. Schalten Sie dann den Zellharvester ein und schalten Sie die Pumpe ein. Legen Sie ein Filterpapier in den Cell Harvester.

Sammeln Sie die Röhrchen des Zellharvesters in einer leeren leeren Schale. Drücken Sie dann auf Vorwäsche, um das Filterpapier zu befeuchten. Legen Sie die Sammelröhrchen in die Probenvertiefungen und legen Sie los.

Verwenden Sie eine heiße Lichtquelle, um das Filterpapier zu trocknen, und ordnen Sie die entsprechenden Fläschchen auf dem Fach an. Stanzen Sie Papierblätter in die Fläschchen aus und geben Sie dann zwei Milliliter flüssigen Szintillationscocktail in jedes Fläschchen. Inkubieren Sie die Fläschchen eine Stunde lang im Szintillationszähler, bevor Sie die Maschine in Betrieb nehmen, um die Minutenzählungen jeder Probe zu erhalten, die die aktive DNA-Synthese widerspiegeln.

Aussaat von 500.000 Zellen in einer 35-Millimeter-Kulturschale. Rühren Sie dann die Schale in alle Richtungen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen 46 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann zwei Mikroliter pro Milliliter fünf Millimolare EdU in die Kultur und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang. Als nächstes dissoziieren und pelletieren Sie die Zellen. Geben Sie dem Zellpellet drei Milliliter 30%iges Expansionsmedium mit oder ohne Wachstumsfaktoren oder Medikamente.

Einen Milliliter der Zellsuspension auf die vorbeschichteten Schalen aufbringen und die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Anzahl der neuralen Vorläuferzellen in Kultur zu untersuchen, markieren und bereiten Sie nach zwei Tagen Mikrozentrifugenröhrchen vor. Saugen Sie dann das Medium aus der Vertiefung an, fügen Sie 200 Mikroliter 1X Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie nach der Zellablösung 300 Mikroliter 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zelllösung mehrmals zu pipettieren und die Zellen von der Platte zu lösen. Übertragen Sie dann die Zelllösung in das vorbereitete 1,5-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen zwei- bis dreimal um.

Entnehmen Sie mit einer Pipette 50 Mikroliter Zellen auf halber Höhe des Röhrchens und geben Sie es in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen zur Trypanblau-Lösung. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Um die Neurosphäre zu bilden, pipettieren Sie einen Milliliter 100%iges Expansionsmedium in eine 35-Millimeter-Schale ohne Beschichtungssubstrat.

Fügen Sie dann eine Million neuronale Vorläuferzellen in jede dieser Platten hinzu und inkubieren Sie die Platte 48 bis 96 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um die Platte für die Migration der Neurosphären vorzubereiten, lösen Sie die Aliquote des ECM-imitierten Gels in sechs Millilitern 30%igem Expansionsmedium auf. Geben Sie einen Milliliter ECM-mimisches Gel mit 30 % Expansionsmedium in eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.

Inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Um die Neurosphären zu plattieren, entnehmen Sie mit einer Pipette die Zellen im Medium aus der 35-Millimeter-Schale und übertragen sie in ein konisches Röhrchen. Drehen Sie dann das Röhrchen bei 100 G, um die Neurosphären zu pelletieren.

Suspendieren Sie das Pellet dann in ein bis drei Millilitern vorgewärmtem 30%-Expansionsmedium. Pipettieren Sie als Nächstes 200 Mikroliter der resuspendierten Neurosphären in die Sechs-Well-Platte, die das ECM-mimische Gel mit 30%igem Expansionsmedium enthält, und schütteln Sie die Platte. Inkubieren Sie die Platte dann 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Aspirieren Sie das EZM-mimische Gel mit 30%igem Expansionsmedium und fixieren Sie die Zellen dann 30 Minuten lang mit 4%igem Paraformaldehyd. Um die Neurosphären zu analysieren, nehmen Sie Bilder mit Phasenkontrasteinstellungen bei 10-facher Vergrößerung auf. Verwenden Sie die NIH ImageJ-Software, um die durchschnittliche Migration der Neurosphären zu messen.

Verwenden Sie auf ImageJ das Freihandlinienwerkzeug, um die äußere Kontur der Neurosphäre nachzuzeichnen. Verwenden Sie dann die Funktion "Messen", um die Spurfläche zu berechnen, und verfolgen Sie die innere Zellmasse der Kugel. Subtrahieren Sie die innere Zellmasse von der gesamten Neurosphärenfläche, um die durchschnittliche Migration zu quantifizieren.

Die immunzytochemische Färbung wurde durchgeführt, um die Expression von Zytoskelettproteinen und Transkriptionsfaktoren wie SOX2, PAX6 und Nestin in neuralen Vorläuferzellen bei Passage drei zu untersuchen. Als nächstes wurden Phasenkontrastbilder aufgenommen, um die neuritentragenden Zellen zu identifizieren. Aus dem Bild geht hervor, dass Zellen mit Fortsätzen, die gleich oder länger als zwei Zellkörper sind, als neuritentragend gelten, während Zellen mit Fortsätzen, die kürzer als zwei Zellkörper sind, nicht als neuritentragend gelten.

Um die Bildung von Neurosphären zu bestätigen, wurden Phasenkontrastbilder aufgenommen, die zeigen, dass Neurosphären, die zum 72-Stunden-Zeitpunkt gesammelt wurden, zwischen 80 Mikrometer und 120 Mikrometer groß sind und daher für Migrationsassays verwendet werden können. Um die proliferative Kapazität zu definieren, wurden neurale Vorläuferzellen unter Kontroll- oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bedingungen gezüchtet und auf das Vorhandensein von EdU gefärbt. Die Phasenkontrast-Fluoreszenzbilder zeigen, dass Zellen, die mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor behandelt wurden, einen höheren Anteil an Zellen aufweisen, die in der S-Phase aktiv sind, wie die EdU-Färbung zeigt.

Um das Wachstum von Neuriten zu überprüfen, wurden die Zellen anschließend unter Kontrollbedingungen untersucht und mit PACAP verglichen. Phasenkontrastbilder wurden aufgenommen und zeigen eine Zunahme der Anzahl von Zellen mit Neuriten unter PACAP-Behandlung. Um die Migration der Neurosphäre zu verstehen, wurden die Zellen dann mit PACAP-Neuropeptiden behandelt.

Die erhaltenen Phasenkontrastbilder zeigen eine erhöhte Neurosphärenmigration im Vergleich zur Kontrolle. Unser Protokoll enthält viele Techniken und Assays, die jeweils unterschiedlich viel Zeit in Anspruch nehmen. Nach der Beherrschung kann die Einrichtung eines durchschnittlichen Assays zwei bis drei Stunden und die Analyse von 30 Minuten bis drei Stunden dauern.

Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass Sie hochwertige neurale Vorläuferzellen verwenden und dass diese Zellen unter allen Bedingungen mit Ausnahme des Neurosphären-Assays vollständig dissoziiert und gleichmäßig verteilt sind. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Analysen durchgeführt werden, darunter Western Blotting, QRT-PCR, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik, um die zugrundeliegenden Mechanismen zu charakterisieren. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.