Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

Die Methode der Riesenpflaster in Kombination mit ionenselektiven Mikroelektroden ist eine vielseitige Methode, um Ionenflüsse zu detektieren und zu quantifizieren. Konkret wird es verwendet, um die Protonenflüsse zu messen, die durch die Aktivität des elektroneutralen Ionentransporters, des Natrium-Wasserstoff-Austauschers oder NHE, erzeugt werden, der auf der Zellmembran exprimiert wird. Der Natrium-Wasserstoff-Austauscher erzeugt in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran einen Gradienten von Protonen, der hier als orangefarbener Ring dargestellt ist.

Dieser Gradient von Protonen über die Zellmembran wird durch eine Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung in Kombination mit einer Technik gemessen, bei der eine protonenselektive Mikroelektrode verwendet wird. Die protonenselektive Mikroelektrode wird nahe an die Zelloberfläche bewegt, wo sie den Fluss der Protonen aufzeichnet, die sich aus den Zellen herausbewegen, hier in Position A.Und weg von der Zelloberfläche, wo sie die in der durch Position B angegebene Lösung vorhandene freie Protonenkonzentration aufzeichnet.Und dann, zurück zu Position A, nahe der Zellmembran, in einer repetitiven, oszillierenden Bewegung. Die Spannungsdifferenz von A nach B wird aufgezeichnet und ist abhängig vom Vertreter der NHE-Aktivität.

Transporter-Ionen wie Protonen durch die Zellmembran beeinflussen lebenswichtige Prozesse. Daher werden Änderungen des pH-Werts durch eine Reihe von Molekülen streng reguliert, darunter der Natrium-Protonen-Austauscher, ein Plasmamembran-Protonenausschlusssystem. Die oszillierende pH-Mikroelektrode in Kombination mit der Ganzzell-Patch-Klemmung ist ein neuartiger Ansatz zur Untersuchung des Protonenflusses, der durch die Natrium-Proton-Austauscheraktivität vermittelt wird.

Die Anwendung dieser Methoden überwindet einige der Haupteinschränkungen der typischerweise verwendeten Techniken zur Messung der Natrium-Proton-Austauscheraktivität, wie z. B. mäßige Empfindlichkeit und Zeitauflösung sowie eine weitere gute Kontrolle der intrazellulären Umgebung. Ich werde die Methoden zusammen mit meinem Mitarbeiter Dr. Victor Babich demonstrieren. Dr. Matthew Henry wird der Erzähler sein.

Wir werden eine Anwendung dieser Methode demonstrieren, indem wir die Aktivität des Natrium-Proton-Austauschers Isoform drei messen, der ein wichtiger Regulator der Absorption von Salz im Wasser über den Darm und das Nierenepithilium ist. Die protonenselektiven Mikroelektroden zur Messung der Protonenkonzentration werden aus Standardröhren aus Borosilikatglas hergestellt. Borosilikatglaselektroden mit einem Außendurchmesser von 1,2 Millimetern und ohne Filament werden mit einem vertikalen Abzieher nach einem herkömmlichen Doppelzugprotokoll gezogen.

Es erhält man eine Pipettenspitze mit einem Durchmesser von zwei bis drei Mikrometern. Die Pipetten werden mit der Pipettenspitze nach oben in einen Glashalter gelegt. Als nächstes wird eine Mischung hergestellt, um die Pipetten zu silikonisieren.

Es wird in ein Glas gegossen und der Deckel fest verschlossen. Die Pipetten werden 24 bis 48 Stunden lang mit der Silikonisierungsmischung inkubiert. Seien Sie vorsichtig, bereiten Sie die Mischung vor und silikonisieren Sie die Pipetten bei Raumtemperatur in einem gut belüfteten chemischen Rauchabzug.

Füllen Sie die Pipette mit dem entsprechenden ionenselektiven Harz zurück und legen Sie sie vorsichtig senkrecht mit der Pipettenspitze nach unten in einen Glashalter. Zur Vorbereitung der Patch-Klemmung ziehen Sie zunächst Patch-Klemmpipetten aus dünnwandigem Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von zwei Millimetern und einem Innendurchmesser von 1,4 Millimetern in einem vertikalen Abzieher nach dem herkömmlichen Doppelzugprotokoll. Verwenden Sie eine Mikroschmiede, die auf einem Tisch eines inversen Mikroskops montiert ist, um eine breite Pipettenspitze herzustellen.

Positionieren Sie die Pipette nahe an dem dicken Platindraht der Mikroschmiede. Schalten Sie die Heizung mit einem Fußschalter ein, der den Strom ein- und ausschaltet. Erhitzen Sie das Glas mit niedrigem Schmelzpunkt, das die Mitte des dicken Platindrahts der Mikroschmiede bedeckt, und bewegen Sie dann die Pipettenspitze nahe an das geschmolzene weiche Glas.

Durch die Erwärmung wird der Platindraht leicht in Richtung Mitte bewegt. Der Platindraht kehrt in die Ausgangsposition zurück und die Pipettenspitze bricht. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der gewünschte Spitzendurchmesser erreicht ist, und wenden Sie schließlich Hitze an, um die Spitze zu glätten.

Die Pipettenspitzen haben einen Durchmesser von 10 Mikrometern, nachdem sie mit der Mikroschmiede poliert wurden. Die Verwendung des dicken Platindrahtes ist insofern von Vorteil, als es nach dem Einschalten des Stroms zu einer geringen Ausdehnung kommt und die Möglichkeit einer Überhitzung des Drahtes und der Pipette bei übermäßigem Strom geringer ist. Nachdem die Zellen mit Trypsin dissoziiert wurden und die Trypsinisierung blockiert ist, werden die Zellen auf einem Schüttler mit Schaukeln gehalten, um die Bildung von Klumpen zu verhindern.

Dies geschieht bis zu zwei Stunden nach der Trypsinisierung. Der elektrophysiologische Aufbau besteht aus einem Temperaturregler zur Regelung der Temperatur der Lösung im Perfusionssystem. Alle Experimente werden bei etwa 37 Grad Celsius durchgeführt.

Und ein optischer Filterumschalter zur Steuerung des Filterrads für die Fluoreszenzbildgebung. Eine Ventilsteuerung für das Perfusionssystem zur Regelung des Öffnens und Schließens der Ventile des Perfusionssystems. Und der Temperaturregler zur Regelung der Temperatur der Aufnahmekammer.

Ein Oszilloskop zur Beobachtung von Wellenformen und ein Patch-Clamp-Verstärker. Ein Computer, auf dem diese Capmeter-Software ausgeführt wird. Und ein Elektrometer zur Aufzeichnung des ionenselektiven Mikroelektrodensignals.

Und ein Differenzverstärker zur Verstärkung des Signals des Elektrometers. Der elektrophysiologische Aufbau ist auch mit einem inversen Mikroskop mit Tischregler, zwei Mikromanipulatoren mit Controllern, die auf der linken und rechten Seite des Mikroskops positioniert sind, und dem Perfusionssystem mit Inline-Lösungsheizung ausgestattet. Nachdem die ionenselektive Mikroelektrodenpipette an den Mikromanipulator montiert wurde, füllen Sie die Patch-Klemmpipette mit der intrazellulären Lösung zurück.

Stellen Sie sicher, dass die Lösung die Spitze der Pipette erreicht. Es kann mehrere sanfte Klopfbewegungen erforderlich sein, um Blasen in der Spitze der Pipette zu entfernen. Montieren Sie dann die Patch-Klemmpipette an der Kopfstufe des Elektrophysiologie-Setups.

Übertragen Sie gesund erscheinende Zellen vorsichtig in die Aufnahmekammer, die mit einem definierten Volumen der Badelösung gefüllt ist. Es ist wichtig, den Kopftisch in einem Winkel von 45 Grad zur horizontalen Achse zu halten. Dadurch wird ein Eintrittswinkel für die Pipette gewährleistet, der für die Ausbildung einer hochbeständigen Dichtung geeignet ist.

Während die Patch-Clamp-Pipette in der Badlösung abgesenkt wird, üben Sie einen kleinen Überdruck auf die Pipette aus, um die Wahrscheinlichkeit eines Blockierens der Spitze zu verringern. Wählen Sie eine Zelle aus und nähern Sie sich ihr mit einem kleinen Überdruck. Hören Sie auf, die Pipette der Patch-Klemme zu bewegen, sobald sich die Spitze in der Nähe der Zelle befindet.

Senken Sie die ionenselektive Mikroelektrode in der Badlösung ab, bis sie die gleiche Brennebene wie die Pipettenspitze der Patch-Klemme hat. Wenn sich die Pipette mittig über der Zelle befindet, aktivieren Sie die Versiegelung, indem Sie einen kleinen Unterdruck ausüben. Eine Mega-Ohm-Dichtung wird innerhalb weniger Sekunden erreicht.

Stellen Sie sicher, dass das Haltepotenzial vom Verstärker bei null Millivolt gehalten wird. Zum Schluss brechen Sie die Zellmembran mit einer Reihe kurzer Saugimpulse auf und starten die Aufnahme. Mit der Riesenpatch-Recording-Methode ist es möglich, Lösungen in der Glaspipette über ein Intrapipetten-Perfusionssystem schnell zu perfundieren, um den intrazellulären Gehalt an Ionen, Lipiden und Proteinen zu verändern.

Positionieren Sie die ionenselektive Mikroelektrodenpipette nahe an der Zelle, die von der Patch-Clamp-Pipette gehalten wird, und starten Sie die Oszillation der ionenselektiven Mikroelektrodenpipette, indem Sie sie zur und von der Zelle bewegen. Die Anwendung dieser Technik ermöglicht es, die molekulare Regulation des Natrium-Wasserstoff-Austauschers zu untersuchen. Unter Ausnutzung der Riesenpflaster-Methode wurde die intrazelluläre Zusammensetzung von ATP und Lipiden durch ein Intrapipetten-Perfusionssystem modifiziert.

Die intrazelluläre Perfusion von Apyrase, die intrazelluläres ATP hydrolysiert und den Phosphoinositidgehalt verringert, führte zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität der NHE-Isoform 3. Der Apyrase-Effekt auf die NHE3-Aktivität wurde durch die intrazelluläre Perfusion des Phosphoinositids PIP2 nicht umgekehrt. Sie wurde jedoch durch die intrazelluläre Perfusion des Phophoinositids PIP3 rückgängig gemacht.

Bei der Messung der NHE-Aktivität werden die Vorteile der Kombination der protonenselektiven Mikroelektroden- und Patch-Clamping-Methoden genutzt. Dies ermöglicht die Untersuchung der molekularen Grundlagen hinter der differentiellen Regulation von NHE durch Phosphoinositide und nachgeschaltete Signalkaskaden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Aktivität des Natrium-Protonen-Austauschers mit einer oszillierenden pH-Mikroelektrode in Kombination mit allen Zellpflasterklemmen messen können.

Und ein Beispiel für die mögliche Anwendung der Methoden.