Name: Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung neuronaler Vorläuferzellen aus embryonalem und postnatalem Hirngewebe zur Analyse epigenetischer Modifikationen, insbesondere der Histonmarke H3K79me2, mittels Chromatin-Immunpräzipitation.

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Wir danken für die Unterstützung der CGN-Anbau-Protokoll im Labor herstellen Henriette Bertemes. Dieser Methode Papier wurde von der DFG-geförderten CRC992 medizinische Epigenetik unterstützt, durch die Finanzierung zu TV. Die Autoren erkennen die Unterstützung von Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning und Prof. Rolf Backofen, Bioinformatik, Universität Freiburg, Deutschland finanziert Collaborative Research Center 992 medizinische Epigenetik (DFG Stipendium SFB 992/1 2012) Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF Grant 031 A538A RBC (de.) NBI)).

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte

Es gibt zwei große Möglichkeiten, um führen Sie Chromatin Immunopräzipitation um die genomische Belegung der Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren, Histon-Code-Leser, Autoren oder Radiergummis zu erkennen. Eine ist die native ChIP-Methode mit Nuklease verdaut, native Chromatin für Immunopräzipitation, und die andere ist die vorgestellte Methode mit PFA-repariert, abscherend Chromatin, in dem die Nukleosomen und andere DNA-attached Proteine kovalent an die DNA gebunden sind 39. native ChIP ...

Die sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen des Gehirns sind hoch komplex und anfällig für körperliche und ökologischen Veränderungen. Das Gehirn besteht aus drei allgemeine Teile der Hind-, Mittel-, und Vorderhirn, die zutiefst verbunden sind. Im Vorderhirn kann das Telencephalon in einer dorsalen Telenzephalon (DT) und einer ventralen Telencephalon (VT) unterteilt werden. Die DT von Mäusen besteht aus sechs kortikalen Schichten, die zwischen E11.5 und E18.5 in einer Art und Weise der "Inside-Out"1gebildet werden. Der VT umfasst die ganglionic Eminenzen in Entwicklung, die später die Basalganglien2,3bilden. Verschiedene Zelltypen lassen sich einteilen in den Säugetier-Zentralnervensystem wie Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten4, die in einem Temporo-räumliche Weise5zu entwickeln. Zunächst entstehen die neurale Vorläuferzellen (NPCs) verschiedene Arten von Neuronen, Interneuronen in der VT und Projektion Neuronen in der DT und später nach Gliazellen (z.B. Astrozyten6). Während der kortikalen Entwicklung, die oberflächlichste Schicht (Schicht I), Cajal-Retzius-Zellen enthält zuerst gebildet ist. Anschließend generieren NPCs zwischen E12.5 und E14.5, neuronale Tiefenschichten (VI, V) beim zwischen 14,5 und 16,5, Stammväter Anlass zu Oberschicht (IV-II) Neuronen7,8. Neuronale Identität wird von verschiedenen Morphogen-induzierte Temporo-räumliche transkriptionelle Programmen und zusätzlich durch epigenetische Programme2angegeben.
Das Kleinhirn, die motorische Koordination beteiligt ist, befindet sich in dem Hinterhirn und zwischen E10 und grob P20 in Mäusen9entwickelt. Es enthält die zerebelläre Kortex und zerebelläre Kerne10. Die Erwachsenen zerebelläre Kortex besteht aus drei Schichten, die äußerste molekulare Schicht, die Purkinje-Zellschicht und der innersten Körnerschicht enthält körnige Neuronen10. Die zerebelläre Granulat-Zellen sind die kleinsten Neuronen und repräsentieren rund 80 % aller Neuronen in der vertebrate Gehirn-11. Sie entwickeln aus Vorstufen in der externen germinal Zone gelegen und durchwandern der Purkinje Zelle Schicht auf ihre Ziel-12. Wie die Entwicklung des Kleinhirns im Telencephalon, durch mehrere wichtige Morphogens reguliert wird, definiert die bestimmte Zeit und Raum-abhängige Funktionen und initiieren transkriptionelle Programme10.
Die Entwicklung der kortikalen und zerebelläre Schichten wird durch transkriptionelle Ausdruck der spezifischen Morphogens und damit der Chromatin-Staat der DNA gesteuert. In einer vereinfachten Ansicht können Euchromatin als transcriptionally aktiv und Heterochromatin als transcriptionally leisen Regionen Chromatin Staaten aufgeteilt werden. Das Nukleosom als die grundlegende Maßeinheit des Chromatins enthält zwei Kopien von jedem Core-Histone H2A, H2B, H3 und H4, umgeben von 147 Basenpaare der DNA-13. Histone werden durch Methylierung, Acetylierung Phosphorylierung, Ubiquitination, Sumoylierung, ADP-Ribosylation, Deamination und Prolin Isomerisierung14,15hoch posttranslational modifiziert. Histon-Lysin-Methylierung gilt als die stabilste Histon-Modifikation, die Transkription, Replikation, Rekombination16, DNA-Schäden Antwort17und genomische Prägung18steuert. Lysines können Mono-, di- oder Tri-methylierte19 und erscheinen nicht nur auf den zugänglichen Histon-Schwänzen, sondern auch innerhalb der globulären Domäne der Histone20. Spezifische Methylations H3K4 und H3K36 vor allem mit Euchromatin verbunden sind, spezifische Methylations bei H3K9, H3K27 oder H4K20 sind vor allem in heterochromatischen Regionen gefunden, obwohl alle Rückstände der Histon Schweif14, liegen 19,21. H3K79-Methylierung befindet sich innerhalb der Histon globulären Domäne und transkriptionelle Aktivität, sondern auch mit transcriptionally inert genomische Regionen22zugeordnet wurde. Die Änderung ist evolutionär konserviert, da es in Hefe, Thymus Kalb, Huhn und menschlichen23beobachtet hat. H3K79 Mono, di und Trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sind durch die Histon-Methyltransferasen DOT1L24,25 und die nukleare SET Domain-haltige Protein 2 (Nsd2)26katalysiert. DOT1L ist in Proliferation, DNA-Reparatur und Mobilfunk umprogrammieren27verwickelt. Verlust von Dot1l bei Mäusen führt zu einer pränatalen Tod um die Entwicklungsphase E10.528,29. Während der Entwicklung von Herz und Myocardiocyte Differenzierung unbedingt DOT1L gen Ausdruck Verordnung30. In das zentrale Nervensystem, DOT1L Funktion im Neuralrohr Entwicklung31einbezogen werden könnte, sie engagiert sich bei der Unterdrückung der Tbr1-Ausdruck im Vorderhirn Entwicklung32, und funktionieren in der Verordnung von ER-Stress Antwort Gene33. Die Kontext-abhängige Aktivierung oder unterdrücken Einwirkung von H3K79me, vor allem mit in Vivo Situationen wie die Entwicklung des zentralen Nervensystems, ist bis heute nur teilweise verstanden32. Da H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 befindet, ist es im Vergleich zu Änderungen auf die flexible Histone Tails23sterisch weniger zugänglich. Um die Funktion der H3K79-Methylierung zu verstehen, brauchen wir zuverlässige und reproduzierbare Analyse-Methoden, seine Lage und genomische Umwelt bestimmen. In diesem Methoden-Papier präsentieren wir Ihnen Isolationsmethoden von verschiedenen neuronalen Vorläuferzellen (CPC-Gebote für den Kortex) und CGNPs für das Kleinhirn, wirksame DOT1L Inhibitor Behandlung und eine ChIP-Methode H3K79 Methylierung mittels qPCR oder Sequenzierung zu verschiedener Zeit analysieren Punkte während der kortikalen und zerebelläre Entwicklung. Für einen Überblick über das Protokoll und seine Möglichkeiten siehe Abbildung 1.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Category: Antibody Abkürzung/Comment: Immunoblot Verdünnung 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Category: Antikörper Abkürzung/Kommentar: Immunoblot Verdünnung 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050<</td><td>strong>Category: Antibody Abkürzung/Comment: ChIP Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td><Category:> Antibody Abkürzung/Comment: Immunoblot Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td>Category: Antibody Abkürzung/Comment: ChIP Ctrl Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Tubulin alpha</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>Category: Antibody Abkürzung/Comment: Immunoblot Verdünnung 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CCM</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für die Analyse von geschertem Chromatin</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Borsäure pH 8,4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CPC-Kultivierung</td></tr><tr><td>CFX Connect RT PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>Category: ChIP Analysis Abkürzung/Kommentar: Nachweissystem für qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Magnetische Kügelchen, für ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>Category: DOT1L Inhibition Abkürzung/Comment: Für die DOT1L-Hemmung in Zellkulturen</td></tr><tr><td>Ethylendiamin Tetraessigsäure</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: EDTA</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CPC-Isolierung und CGM</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767<</td><td>strong>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CGNP-Isolierung</td></tr><tr><td>Glutathion (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für die Zellfixierung</td></tr><tr><td>GoTaq Mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category: ChIP Analysis Abkürzung/Kommentar: DNA-Polymerase-Mastermix für qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution Life</td><td>Technologies</td><td>14025-100<</td><td>strong>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: HBSS</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CPC-Kultivierung</td></tr><tr>von<td>Lithiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: LiCl</td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: Fluorostrometer für die DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit für Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Category: ChIP Analysis Abkürzung/Comment: Kit für die Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex-Oligos für Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category: ChIP Analysis Abkürzung/Comment: Oligos für die Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternative</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: Für ChIP-Puffer</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: PFA, für die Zellfixierung</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: PSN, für CCM und CGM</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: PBS, für die CPC-Isolierung</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>Category: ChIP Analysis Abkürzung/Comment: Visualisierung von Farbstoff für die DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CGNP-Isolierung</td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin-Hydrobromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655<</td><td>strong>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für die CPC-Kultivierung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: KCl, für CGM</td></tr><tr><td>Proteasehemmer</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment:Kit für die DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: Für ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: Für DOT1L-Hemmung in Zellkulturen</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Kommentar: für Elutionspuffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: NaCl, für ChIP-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP</td></tr><tr><td>Natrium Dodecylsulfat</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: SDS, für ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Kommentar: Für die CGNP-Isolierung</td></tr><tr><td>Superoxiddismutase (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CCM</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: TRIS, für ChIP-Puffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Für ChIP-Puffer</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Category: Cell culture Abkürzung/Comment: Für CPC-Isolierung</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Category: ChIP Abkürzung/Comment: Zur Präparation von Kügelchen</td></tr><tr><td>Weitere Laborgeräte: Neubauer-Zählkammer, Inkubator, Rotator, Shaker, Dissektionsset, Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM: Kortikales Zellmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CGM: CGNP-Zellkulturmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von neuronalen vorläuferzellen gefolgt von chromatin immunopräzipitation histon 3 lysin 79 dimethylation marke

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Die Entwicklung des Gehirns ist ein komplexer Prozess, der in gewissem Sinne Temporo-räumliche von Steigungen von Morphogens und verschiedene transkriptionelle Programme gesteuert wird. Darüber hinaus haben die epigenetische Chromatin Modifikationen, wie Histon-Methylierung, für Aufbau und Pflege von bestimmten Zelle Schicksale in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Die überwiegende Mehrheit der Histon-Methylierung tritt auf die flexible Histon-Schweif, die Histon-Modifikatoren, Radiergummis und Histonproteine Leser zugänglich ist. Im Gegensatz dazu H3K79 Methylierung befindet sich in der globulären Domäne von Histon 3 und ist in verschiedenen Entwicklungsstörungen Funktionen beteiligt. H3K79-Methylierung ist evolutionär konserviert und finden in den unterschiedlichsten Arten von Homo Sapiens zu Saccharomyces Cerevisiae. Die Änderung tritt in unterschiedlichen Zellpopulationen innerhalb von Organismen, einschließlich des neuronalen Vorläuferzellen. Die Lage der H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 macht es schwierig zu beurteilen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden, zu isolieren und Kultur kortikalen Progenitor Zellen (CPCs) aus embryonalen kortikalen Hirngewebe (E11.5-E14.5) oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter (CGNPs) vom postnatalen Gewebe (P5-P7) und effizient immunoprecipitate H3K79me2 für quantitative PCR (qPCR) und genomweite Sequenzierung.

Allgemeine Systematik der neuronalen Vorläuferzellen Isolation, Anbau, H3K79me2 ChIP und ChIP-Analyse-Methoden: Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm H3K79me2 ChIP der kortikalen Vorläuferzellen zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung des embryonalen Gehirns oder zerebelläre granulare Neuron Stammväter in postnatale Phasen durchführen. Als ersten Schritt das Gehirn isoliert werden und das Telencephalon (zwischen E11.5 und E14.5) od...

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, epigenetische Veränderungen während der Gehirnentwicklung, insbesondere in der Großhirnrinde und im Kleinhirn, zu analysieren. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, z. B. wie Histonmodifikationen wie die H3K79-Methylierung die Entwicklung der kortikalen und zerebellären Schichtung beeinflussen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in vivo die Histonmodifikationen, locusspezifisch oder genomweit, in verschiedenen Hirnregionen zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten untersuchen können.Beginnen Sie mit Gehirnen von P5 bis P7 und MRT-Mäusen. Entfernen Sie alle Hirnhäute und Blutgefäße. Übertragen Sie dann drei bis fünf Cerebella pro Chip in 15-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie das Kleinhirn vor der Zentrifugation mit HBSS-Glukose. Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um das Gewebe zu sammeln. Nach der abschließenden Wäsche homogenisieren Sie das Kleinhirn, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren, bis die Fragmente 0,5 bis einen Kubikmillimeter groß sind.Entfernen Sie vorsichtig die gesamte Flüssigkeit, bis noch 2,5 Milliliter übrig sind. Geben Sie dann 0,05%iges Trypsin in das Röhrchen mit HBSS-Glukose, die das Kleinhirn enthält. Und inkubieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.Drehen Sie das Gewebe alle ein bis drei Minuten um. Nach der Inkubation stoppen Sie die Verdauung, indem Sie fünf Milliliter CGNP-Zellkulturmedium (CGM) hinzufügen und das Gewebe wie zuvor durch Zentrifugation sammeln. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand entfernt und ein Milliliter CGM hinzugefügt.Zerreiben Sie das Gewebe mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Fügen Sie dann fünf Milliliter CGM hinzu und inkubieren Sie die Mischung zwei Minuten lang auf Eis, um Gewebereste abzusetzen. Sobald sich das Gewebe abgesetzt hat, überführen Sie den Überstand in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie dann zwei Milliliter CGM in das Restgewebe und wiederholen Sie den Verreibungsvorgang, bevor Sie den Überstand entnehmen und die Gewebereste verwerfen. Bündeln Sie die Überstände aus jedem 15-Milliliter-Geweberöhrchen und zentrifugieren Sie, um die Kleinhirnzellen zu sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern CGM.Da Astrozyten schneller und stärker an Poly-D-Lysin haften als CGNPs, geben Sie bis zu vier Milliliter Zellsuspension in die Vertiefungen der Poly-D-Lysin-beschichteten 6-Well-Platten und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Astrozyten zu entfernen. Schütteln Sie die Platte, sammeln Sie den Überstand in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie den Überstand dann wie zuvor. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern CGM und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer.Nach vier bis sechs Stunden erscheinen die anhaftenden CGNPs rund und proliferativ. Die Zellen in CGM auf Poly-L-Ornithin-beschichtete Platten aussäen und bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 und 100 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubieren. Nach einem Tag in vitro oder DIV1 sind die meisten CGNPs rund und proliferieren.Einige CGNPs beginnen sich zu differenzieren und beginnen mit dem Wachstum von neuronalen Vorsprüngen. Um die kultivierten Zellen zu fixieren, geben Sie bis zu einem Milliliter 1 %PFA direkt in die Vertiefungen, die CGNPs enthalten. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei 22 Grad Celsius fügen Sie 53 Mikroliter Glycin hinzu und waschen Sie es zweimal mit drei Millilitern eiskaltem PBS.Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in einem Milliliter PBS zu ernten. Füllen Sie die Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen um und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1.000 g und vier Grad Celsius. Nach Entfernen des Überstands werden 700 Mikroliter Lysepuffer mit Proteaseinhibitor zugegeben und die Proben 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert.Während dieser Zeit werden die Proben alle fünf Minuten vortext. Teilen Sie die Probenröhrchen nach der Inkubation so auf, dass das Volumen 400 Mikroliter pro Röhrchen nicht überschreitet. Anschließend wird 10 Minuten lang mit maximaler Leistung beschallt, um das Chromatin der Lysezellen zu scheren.Nach 10 Minuten die Proben vortexen und dann die Beschallung und das Vortexen noch zwei weitere Male wiederholen. Überprüfen Sie das Lysat mit einem Phasenkontrastmikroskop oder Fluoreszenzmikroskop mit DAPI auf verbleibende Zellkerne. Pelletieren Sie die Zellreste, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius zentrifugieren.Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie den Überstand für den Vorreinigungsschritt. Um die Proben vorzuräumen, waschen Sie zunächst 20 Mikroliter unkonjugierte magnetische Kügelchen pro Probe in eiskaltem PBS-Tween. Entnehmen Sie die Wäschen mit Hilfe eines Magnetständers.Geben Sie dann 600 Mikroliter Verdünnungspuffer und 20 Mikroliter gewaschene magnetische Kügelchen zu jeder Probe für die Vorklärung und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Entfernen Sie die Kügelchen nach der Inkubation mit einem Magnetständer. Nehmen Sie dann 5 % jedes Lysats als Eingangsproben und frieren Sie sie bei minus 20 Grad Celsius ein.Die Antikörperkopplung kann durchgeführt werden, während die Proben vorab freigegeben werden. Waschen Sie wie zuvor 45 Mikroliter Protein A Magnetic Beads pro Chip mit eiskaltem PBS Tween. Nach der letzten Wäsche gibst du einen Milliliter eiskaltes PBS zu den Perlen.Fügen Sie dann drei Mikrogramm Antikörper pro 45 Mikroliter aliquotes Kügelchen hinzu. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator, um die Antikörper an die Kügelchen zu binden. Wenn die Inkubationszeit abgelaufen ist, resuspendieren Sie gewaschene Antikörper-gekoppelte Kügelchen in einem Beadsvolumen eiskaltem PBS.Teilen Sie jeden vorgeklärten Extrakt in zwei Röhrchen mit ca. 643,5 Mikrolitern auf. Geben Sie das gleiche Volumen an Verdünnungspuffer und antikörpergebundenen Kügelchen hinzu und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Am nächsten Tag waschen Sie die Kügelchen mit eiskalten Chipspuffern eins bis drei für jeweils 10 Minuten auf einem Rotator bei vier Grad Celsius, gefolgt von drei fünfminütigen Wäschen mit TE-Puffer.Elutionspuffer zugeben und eine Stunde lang bei 1.400 U/min in einem Shaker bei Raumtemperatur verdünnen. Nach Ablauf der Stunde fügen Sie jeder Chipprobe 10 Mikrogramm Rnase und den Eingabeproben fünf Mikrogramm hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf dem Shaker.Zum Schluss fügen Sie 100 Mikrogramm Proteinase K pro Chipprobe und 50 Mikrogramm pro Eingabe hinzu. Über Nacht bei 65 Grad Celsius bei 1.400 U/min inkubieren. Die H3K79-Dimethylierungswerte sind nach dreitägiger CPC-Kultivierung und DOT1L-Hemmung durch SGC 0946 verringert.Die QCPR nach Chip-Analyse zeigte, dass Gene mit hohen Histon-3-Lysin-79-Methylierungswerten zu Studienbeginn am besten auf die Inhibitorbehandlung ansprachen. Gene mit einer geringeren H3K79-Dimethylierungsabdeckung zeigten keine signifikante Veränderung der Methylierungsgrade. Diese Heatmap zeigt, dass die Methylierungsniveaus von Histan-3-Lysin-79 um die Startstelle der Transkription herum ihren Höhepunkt erreichen und zur Endpunkt der Transkription hin abnehmen.Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Chromatin-Immunpräzipitation an Histonmodifikationen in isolierten Gehirnzellen durchführt.

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Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

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Isolierung induzierter neuraler Vorläuferzellkolonien, die aus adulten humanen Fibroblasten stammen

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Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Epigenetische Mechanismen werden häufig in Gliom verändert. Chromatin Immunopräzipitation könnte verwendet werden, um die Auswirkungen der genetischen Veränderungen, die in Gliom zu studieren, die aus Änderungen in Histon Änderungen ergeben, die Chromatin Struktur und gen-Transkription regulieren. Dieses Protokoll beschreibt native Chromatin Immunopräzipitation auf murine Gehirn Tumor Neurosphären.

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Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke (Video) | JoVE Journal

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

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