Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Dieses Manuskript beschreibt ein einfache und schnelles experimentelles Verfahren für die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die basierend auf der Messung der Luciferase-Aktivität.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protein-Protein-Wechselwirkungen in einem transienten Expressionssystem quantitativ nachzuweisen. Dieses Maß kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in Quan-Signal-Transaktionsfeldern zu beantworten, z. B. wie wir die Richtungen unserer Proteinproteine nach einer chemischen oder umweltbedingten Behandlung quantitativ überwachen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Luminometer oder eine CCD-Kamera verwendet, um die luziferöse Aktivität zu erfassen, die die Richtungsintensität des Proteinproteins darstellt, so dass die Ergebnisse genauer sind.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter einer Lösung, die fünf Prozent Natriumhypochlorit und null Komma ein Prozent Triton x hundert enthält, zu einem Einkomma fünf Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit Samen hinzu. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten ruhen, um die Samen zu sterilisieren. Waschen Sie dann die Samen fünfmal mit sterilem Wasser.

Suspendieren Sie die gewaschenen Samen in zweihundert Mikrolitern sterilem Wasser. Legen Sie die einzelnen Samen mit feinen Spitzen vorsichtig auf die Oberfläche des plattierten MS-Agar-Mediums. Lagern Sie die Platten drei Tage lang bei vier Grad Celsius, um die Keimung zu synchronisieren.

Bewahren Sie danach mittlere Platten zehn Tage lang unter normalen Wachstumsbedingungen auf. Setzen Sie die keimenden Sämlinge in die Erde um und achten Sie darauf, die Wurzeln nicht zu beschädigen. Decken Sie das Tablett über Nacht mit einer transparenten Plastikabdeckung ab, um die Feuchtigkeit zu erhalten.

Züchte die Pflanzen sieben Wochen lang in einem kontrollierten Anbauraum, dann sind sie bereit für die Infiltration durch Agrobacterium tumefaciens. Zu Beginn geben Sie einhundertfünfzig Nanogramm Plasmide in den a-Tumefaciens-kompetenten Zellstamm GV3101. Die Röhrchen mit der a-Tumefaciens-Kultur in einen Schüttler geben und vier Stunden lang inkubieren.

Übertragen Sie die Kultur mit einem Glasstab aus den Röhrchen auf LB-Medien. A-Tumefaciens und LB-Agarmedium vier Tage lang bei 28 Grad Celsius kultivieren. Bereiten Sie sich als Nächstes darauf vor, eine einzelne a-tumefaciens-Kolonie aus jeder Platte in ein eigenes Röhrchen mit drei Millilitern flüssigem LB-Medium zu inokulieren.

Schütteln Sie bei 280 RBM bei 28 Grad Celsius für 24 Stunden, um die Kultur zu vermehren. Dann werden 75 Mikroliter der Bakterienkultur in 15 Milliliter frisches LB-Flüssigmedium überführt, das 15 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin enthält. Kultivieren Sie die Bakterien bei 220 U/min bei 30 Grad Celsius für etwa 8 Stunden, bis OD600 zwischen 0,5 und 1 liegt.

Übertragen Sie danach die Kultur in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 4000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in 15 Millilitern Transformationslösung.

Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 4000-facher Schwerkraft und 4 Grad Celsius. Wiederholen Sie dann den Suspensions- und Zentrifugationsschritt erneut. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in 5 Millilitern Transformationslösung.

Lassen Sie die aufgehängte Palette zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei Dunkelheit ruhen. Geben Sie dann entweder die Transformationslösung in den OD600 ist 0,5 oder kombinieren Sie zwei Proben mit gleichem Volumen, um gepaarte Proteininteraktionen zu testen. Infiltrieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze suspendierte Zellen in das vierte bis siebte Blatt.

Decken Sie die Pflanzen danach sofort 12 Stunden lang mit einer schwarzen Plastikabdeckung ab. Erstens sollten Pflanzen sehr gesund sein, um den Erfolg zu gewährleisten. Zweitens: Achten Sie darauf, dass während des Infiltrationsprozesses keine Blätter beschädigt werden.

Bewahren Sie das Tablett 12 Stunden lang im Dunkeln auf. Lass die Pflanzen dann 2 bis 4 Tage lang unter normalen Bedingungen wachsen, bevor du die Luciferase-Aktivität feststellst. Um mit der bildgebenden Methode zu beginnen, lösen Sie ein infiltriertes Blatt.

Legen Sie die gesamte Packungsbeilage auf einen Teller mit MS-Agar-Medium. Mit einer 50-Milliliter-Sprühflasche Luciferon Arbeitspuffer auf die adaxiale Seite der Blätter sprühen. Dann 5 Minuten im Dunkeln halten, um die Chlorophyll-Autofluoreszenz zu löschen.

Verwenden Sie ein lichtgekühltes CCD-Imagine-Gerät, das auf minus 30 Grad Celsius gekühlt ist, um Bilder mit einer lichtgefüllten Belichtungszeit von 50 Millisekunden und einer Lumineszenzdetektionszeit von 1 Minute aufzunehmen. Schneiden Sie danach Blattfragmente aus dem Infiltrationsbereich der N-benthamiana-Blätter aus. Tauchen Sie die Fragmente in 100 Mikroliter deionisiertes Wasser in die Vertiefungen der 96-Well-Weißplatte.

Fügen Sie zehn Mikroliter Luciferon-Arbeitspuffer hinzu. Den Teller 5 Minuten ruhen lassen. Führen Sie dann eine gewünschte spezifische Behandlung durch, um die Dynamik der Proteininteraktion zu untersuchen, und messen Sie die Lumineszenz direkt mit einem kommerziellen Luminometer.

Hier ist die Demonstration der luziferen Aktivität zur Darstellung der COP 1 SPA 1 Wechselwirkungen zu sehen. Die luziferöse Aktivität, die durch Lumineszenz detektiert wird, wird mit einer CCD-Kamera abgebildet. Es wird beobachtet, dass COP 1 SPA 1-Wechselwirkungen zu einer Kupfermutation der funktionellen Luciferase führen.

Die Luciferase-Aktivität unter der Behandlung mit Jasmin 8 im Laufe der Zeit wird dann bestimmt. COP 1 SPA 1 Wechselwirkungen, die durch Luciferase-Aktivität repräsentiert werden, nehmen in der Dunkelheit allmählich ab. Die Behandlung mit Jasmin 8 reduziert diese Wechselwirkungen weiter.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 1 Woche durchgeführt werden, nachdem die Pflanzen fertig sind, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gesunde Pflanzen zu erhalten. Infiltrieren Sie Blätter vorsichtig und fügen Sie die Kontrollen richtig ein.

Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Signaltransaktionen den Weg, um die Dynamik der Protein-Protein-Interaktion auf schnelle Weise zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tabakpflanzen anbaut, Agrobakterien in Tabakblätter infiltriert und luziferöse Aktivitäten erkennt.