Name: Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Luciferase-Komplementierung in Nicotiana benthamiana zur quantitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Diese schnelle Methode ermöglicht präzise Messungen mit Luminometer oder CCD-Kamera.

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Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20140919), der National Natural Science Foundation of China (31470375), die Priorität akademischen Programm Entwicklung von Jiangsu Hochschuleinrichtungen und Qing Lan Projekt unterstützt.

1. Vorbereitung der Pflanzen (8 Wochen)
<ol><li>Setzen Sie 50 Nicotiana Benthamiana Samen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL 5 % NaClO und 0,1 % Triton x-100 (V/V) Lösung und lassen für 5 min um die Samen zu sterilisieren.</li>
	<li>Spülen Sie die Samen mit sterilem Wasser 5 Mal und auszusetzen Sie Samen in 200 µL steriles Wasser.</li>
	<li>Sorgfältig Ort einzelne Samen auf der Oberfläche des MS-Agar Medium (1 L: 1 x Murashige & Skoog Salze, 10 g Saccharose, pH 5.8 (KOH), 1 % Agar) mit feinen Spitzen und Geschäft mittleren Platten in 4 ° C für 3 Tage, um die Keimung zu synchronisieren. Hinweis: Um die Mikrobe Kontamination zu vermeiden, führen Sie diesen Schritt auf einer sauberen Werkbank. Es ist nicht notwendig, das Rohr während der Sterilisation zu schütteln.</li>
	<li>Mittlere Platten unter normalen Wachstumsbedingungen (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 weiße Lichtintensität) für 10 Tage, und übertragen Sie dann die gekeimten Sämlinge in Boden. Hinweis: Legen Sie ein Sämling Wurzeln in Erde und nicht beschädigen Sie die Wurzeln. Decken Sie das Fach mit einer transparenten Kunststoff-Abdeckung über Nacht weiterhin Feuchtigkeit.</li>
	<li>Wachsen Sie Pflanzen in ein kontrolliertes Wachstum Zimmer auf einer 16 h/8 h hell/dunkel-Zyklus und 70 % Luftfeuchtigkeit. 7 Wochen alten N. Benthamiana Pflanzen sind bereit für die Agrobacteriumtumefaciens Infiltration (Abb. 1A). Hinweis: Wasser Pflanzen und Schädlinge zu kontrollieren, wie notwendig, um die Pflanzen gesund zu halten.</li>
</ol>(2) transiente Expression in N. Benthamiana Blättern (7-10 Tage)
<ol><li>Liefern 150 ng der Plasmide (pEGAD-HA-LUC Kontrolle Plasmid, leerer Vektor und konstruierte Plasmid für LCI assay, in diesem Fall verwendeten wir pCAMBIA1300-Nluc und pCAMBIA1300-Cluc für Plasmid Bau) in A. Tumefaciens zuständigen Zelle Stamm GV3101 mit einem Standard-Elektroporation-Methode.</li>
	<li>Kultur A. Tumefaciens Luria-Bertani (LB) Agar Medium (1 L: 10 g NaCl, Hefeextrakt 5 g, 10 g Tryptone, 1,5 % Agar) mit 50 µg/mL von Kanamycin und 50 µg/mL von Rifampicin bei 28 ° C für 4 Tage. Hinweis: Die Auswahl der Antibiotika richtet sich nach den Vektor und die A. Tumefaciens Belastung verwendet.</li>
	<li>Impfen eine einzelne A. Tumefaciens Kolonie von jeder Platte in 3 mL LB-Medium flüssig, enthält 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL von Rifampicin und schütteln bei 220 u/min bei 28 ° C für 24 h, Zellkultur zu verbreiten.</li>
	<li>Übertragen Sie 75 µL Bakterienkultur in 15 mL frisches LB flüssigen Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL von Rifampicin, verdünnen es mit einem Faktor von 200. Kultur die Bakterien bei 220 u/min bei 30 ° C für ca. 8 h bis OD600 zwischen 0,5 bis 1,0 ist.</li>
	<li>Übertragen der A. Tumefaciens Flüssigkultur in 15 mL Zentrifuge Röhren und Zentrifugieren bei 4.000 x g und 4 ° C für 15 min. überstand verwerfen und unterbrechen das Pellet in 15 mL Transformationslösung Pellet zu waschen.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr bei 4.000 x g und 4 ° C für 15 min und verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie waschen noch einmal.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL Transformationslösung und halten Sie für 2 h bei Raumtemperatur. Passen Sie die Dichte von A. Tumefaciens Pellet Zellen mit Transformationslösung, bis die Endkonzentration von OD600 0,5 oder Mischung zwei Proben in gleicher Lautstärke für Tests gekoppelten Proteininteraktionen ist.</li>
	<li>Infiltrieren Sie suspendierte Zellen in der 4th 7th -Blätter mit einer 1 mL nadellosen Spritze (Abbildung 1B-C). Nach Infiltration Pflanzen sofort mit einer schwarzen Kunststoffabdeckung abdecken und das Tablett in der Dunkelheit für 12 h. Danach wachsen Sie Pflanzen wie üblich für 2 bis 4 Tage vor Erkennung LUC Aktivitäten. Hinweis: Wählen Sie gesunde Blätter von ähnlicher Größe. Das Eindringen von vier verschiedene Zonen in einem Blatt ist in Ordnung.</li>
</ol>3. Erkennung von Luciferase Aktivität (ein Tag)
Hinweis: Es gibt zwei Möglichkeiten um Luciferase-Aktivität zu überwachen. Eine basiert auf Bildgebung, und das andere ist, quantitativ Luciferase-Aktivität zu messen.
<ol><li>
Bildgebendes Verfahren
	<ol>
<li>Nehmen Sie eine infiltrierte Blatt und bringen Sie die gesamte Broschüre auf MS-Agar Medium.</li>
		<li>Sprühen Sie Luciferin arbeiten Puffer auf der Blattoberfläche adaxial mit einer 50-mL-Sprühflasche. Halten Sie die Materialien in der Dunkelheit für 5 min um die Chlorophyllfluoreszenz-Auto zu stillen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein wenig Licht gekühlten CCD imaging-Geräte (bis-30 ° C gekühlt) Aufnahmen (Abbildung 2). Die Licht-eingereicht Expositionszeit beträgt 50 ms und Lumineszenz Erkennung dauert 1 min. Hinweis: Stellen Sie die Parameter entsprechend der Maschine benutzt. Niedrigere Temperaturen erhöhen das Signal-Rausch-Verhältnis um die Bildqualität zu verbessern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ messen Sie Lumineszenz direkt mit einem kommerziellen Luminometer.<ol>
<li>Sorgfältig Blatt Fragmente (ca. 0,25 cm2) aus dem Filterbereich der N. Benthamiana Blätter schneiden Sie aus und Tauchen Sie die Blatt-Scheibe in 100 µL deionisiertes Wasser in einer weißen 96-Well-Platte (Abbildung 3).</li>
		<li>10 µL Luciferin Arbeit Puffer und lassen für 5 Minuten. Führen Sie dann bestimmte Behandlungen um die Protein-Interaktion-Dynamik zu studieren. Hinweis: Erkennen der Lumineszenz mit einem Luminometer zu verschiedenen Zeitpunkten der Luciferase-Aktivität-Dynamik zu erhalten, die die Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen unter bestimmten Behandlung darstellen. Diese Methode hat Vorteile für eine große Anzahl von Protein-Paare gleichzeitig testen. Für diejenigen ohne eine kommerzielle Luminometer untersuchen die Luciferase Protein Häufigkeiten von western-Blot, daher beziehen sich auf die LUC Aktivität quantitativ. Wenn Licht nicht unbedingt erforderlich ist, nur halten Sie die Platte in die Luminometer und Messen Sie Lumineszenz zu verschiedenen Zeitpunkten zu. Andernfalls verschieben Sie die Platte in eine Kammer Wachstum während der Erkennung Lücke. Um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, verwenden Sie mindestens drei biologische repliziert. Obwohl LUC Aktivitäten aus verschiedenen Infiltration Zonen variieren, entsprechen ihre wechselnden Muster nach der Normalisierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Protokoll ist einfach und reproduzierbar für das Studium in Vivo Protein-Protein-Interaktionen und besonders geeignet zur Erkennung von Proteindynamik Interaktion unter exogenen Behandlung. Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist N. Benthamiana Infiltration. Um Infiltration Erfolg zu gewährleisten, müssen die Pflanzen sehr gesund sein. Ein weiterer kritischer Faktor ist, wenn Luciferase Aktivität nach eindringen zu überprüfen. Es gibt keine richtige Antwort auf diese Frage. Fors...

Um Wachstum mit seiner Umwelt zu koordinieren, haben Pflanzen entwickelt, elegante Signalwege spüren, transduzieren und Signalisierung Signale reagieren. Wie die Läufer in einem Staffellauf sind Proteine notwendig Spieler in der Pflanze Signaltransduktion. Es ist weithin anerkannt, dass Protein-Protein Wechselwirkung (PPI) eine wichtige Rolle für die zelluläre Kommunikation spielt. Protein-Phosphorylierung, Acetylierung und Abbau sind alle abhängig von physikalische Interaktion zwischen einem Zielprotein und seine modifizierende Enzyme. Z. B. Jasmonate ZIM-Domain Protein (JAZ) Familie Proteine interagieren mit Transkriptionsfaktor MYC2 und unterdrücken die transkriptionelle Aktivität1,2. Angesichts der Bedeutung der PPI erforschte große Protein Interactomes in Pflanzen wurden vor kurzem3,4,5. Diese Interaktom Ergebnisse weiter zeigen die komplexen regulatorischen Netzwerk, das diverse Zellfunktionen koordiniert.
Es gibt einige etablierte Ansätze für die Überwachung der PPI. Hefe-zwei-Hybrid (Y2H)-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Erkennung von PPI. Y2H ist einfach durchzuführen und eignet sich für einen schnellen Test, Protein-Interaktionen zu untersuchen. Y2H ist auch am meisten benutzt für das screening von unbekannten Interaktionspartner für das spezifische Protein von Interesse. Jedoch weil Y2H vollständig in der Hefe erfolgt, kann nicht es spiegeln die reale Szenario im Werk Zellen und bringt hohe falsch positiv Rate. Eine weitere ähnliche Strategie ist die Pulldown-Assay. In der Regel zwei Proteine sind zum Ausdruck gebracht und von Escherichia coli Zellen gereinigt und dann gemischt und immobilisiert zum Nachweis von Protein-Interaktionen. Obwohl diese Methode nicht zeitaufwändig ist, kann nicht es in Vivo Interaktion Ergebnisse entweder erhalten. Zwecken in Vivo Interaktion ist co-Immunopräzipitation (co-IP) die beliebtesten Assay, die qualitativ hochwertige Antikörper gegen Immunoprecipitate das Protein des Interesses erfordert und nicht ausgeschlossen, der indirekten PPI. Darüber hinaus variieren die Ergebnisse aufgrund der komplizierten experimentellen Verfahren in co-IP in der Regel mit individuellen Erfahrungen.
Reporter basierte Rekonstitution Assays fördern stark die Erkennung von in Vivo PPI. Diese Methoden umfassen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)6, bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC)7und die Glühwürmchen Luciferase Komplementierung imaging (LCI) Assay8. Diese drei Ansätze besser als co-IP entsprechend direkt in Vivo PPI, Bund und BiFC benötigen spezielle Mikroskope, Fluoreszenz-Signale zu erkennen und nicht einfach die Intensität der Interaktion quantifizieren. Im Gegensatz dazu nutzt LCI Firefly Luciferase, die nach der Reaktion mit seiner Substrat Luciferin Leuchten wird. Noch wichtiger ist, kann PPI Intensität vom Wert der Luciferase-Aktivität bestimmt werden. LCI gibt also nicht nur ob zwei Proteine interagieren oder nicht, sondern bietet auch Informationen über die Interaktion Dynamik bei der Behandlung. Zwar gibt es einige bewährten Methoden für die Überwachung der Interaktion Dynamik (basierend auf Oberflächen Plasmon Resonanz oder Thermo-Stabilität Verschiebungen)9,10, erfordern diese Ansätze empfindliche Instrumente oder spezifische Kennzeichnung. Im Gegensatz dazu ist LCI einfacher zu erkennen.
Das Prinzip für LCI ist, dass die amino-terminalen und Carboxylgruppen-Terminal Hälften der Luciferase (benannt N-Luc oder C-Luc) wurden fusioniert mit Protein A und B und diese zwei Schmelzverfahren Proteine wurden gleichzeitig in Pflanzenzellen ausgedrückt. Protein A mit B-Protein interagiert, werden die beiden Hälften der Luciferase wiederhergestellt werden, um eine aktive Luciferase Enzym sein. Luciferase-Aktivität kann mit einem Luminometer oder CCD-Kamera erkannt werden. Es ist nicht notwendig, stabile Transformanten für LCI zu erhalten; transiente Expression ist genug, um eine qualitativ hochwertige Interaktion Ergebnis zu erhalten.
RING-Typ E3 Ubiquitin Ligase konstitutive Photomorphogenic 1 (COP1) mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren interagiert und fördert deren Abbau durch die 26S Proteasom11. Einige von diesen COP1 ausgerichtete Transkriptionsfaktoren sind positive Regulatoren für Photomorphogenesis. In der Dunkelheit interagiert COP1 mit Suppressor Phytochrom a-105 1 (SPA1), die COP1 E3 Aktivität8verbessert. Nach Wahrnehmung des Lichts werden Photorezeptoren COP1 SPA1 Interaktion um COP1 Aktivität hemmen und dann stabilisieren COP1 Substrate12,13,14aufzuheben. Dieses Beispiel veranschaulicht die biologische Bedeutung der PPI zu studieren und die Bestimmung der PPI Dynamik.

<table><tbody><tr><td>Transformationslösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Morpholineethansulfonsäure</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27,8 mM Glukose</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; M Acetosyringon</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5,7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Luciferin Arbeitspuffer</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Luciferin Kaliumsalz</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGIE</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0,025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O bis 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase komplementierung imaging assay in nicotiana benthamiana blätter für transient bestimmung proteinprotein interaktion dynamik

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-Protein-Interaktionen sind grundlegende Mechanismen zur Weiterleitung von Signaltransduktion in den zellulären Prozessen; Daher, Identifizierung von neuartigen Proteinprotein Interaktion Paare und Überwachung Proteindynamik Interaktion sind von besonderem Interesse für das aufdecken, wie Pflanzen auf Umweltfaktoren und/oder Entwicklungsstörungen Signale reagieren. Eine Fülle von Ansätzen wurde entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, in Vitro oder in Vivozu untersuchen. Unter ihnen ist die kürzlich ins Leben gerufene Luciferase Komplementierung imaging (LCI) Assay die einfachste und schnellste Methode für den Nachweis der in Vivo Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Test ist Protein A oder B-Protein mit der amino-Terminal oder Carboxylgruppen-Terminal Hälfte des Luciferase, verschmolzen. Wenn Protein A mit B-Protein interagiert, werden die beiden Hälften der Luciferase wiederhergestellt werden, um eine funktionelle und aktive Luciferase Enzym bilden. Luciferase-Aktivität kann mit einem Luminometer oder CCD-Kamera aufgezeichnet werden. Im Vergleich mit anderen Ansätzen, zeigt die LCI-Assay Protein-Protein-Interaktionen sowohl qualitativ als auch quantitativ. Agrobakterium Infiltration in Nicotiana Benthamiana Blättern ist ein weit verbreitetes System für transiente Proteinexpression. Mit der Kombination von LCI und transiente Expression zeigen dieser Ansätze, dass die körperliche Interaktion zwischen COP1 und SPA1 allmählich nach Jasmonat-Behandlung reduziert wurde.

Drei wichtige Schritte können in diesem Luciferase Komplementierung Protokoll für ein Studium Proteinprotein Interaktionen in Vivo, einschließlich Pflanzenwachstum, Tabak Infiltration und die Luciferase Assay herausgegriffen. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist flüssige A. Tumefaciens in N. Benthamiana Blätter (Abbildung 1) infiltrieren.
Hier ist ein Beispiel fü...

Dieses Manuskript beschreibt ein einfache und schnelles experimentelles Verfahren für die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die basierend auf der Messung der Luciferase-Aktivität.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protein-Protein-Wechselwirkungen in einem transienten Expressionssystem quantitativ nachzuweisen. Dieses Maß kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in Quan-Signal-Transaktionsfeldern zu beantworten, z. B. wie wir die Richtungen unserer Proteinproteine nach einer chemischen oder umweltbedingten Behandlung quantitativ überwachen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Luminometer oder eine CCD-Kamera verwendet, um die luziferöse Aktivität zu erfassen, die die Richtungsintensität des Proteinproteins darstellt, so dass die Ergebnisse genauer sind.Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter einer Lösung, die fünf Prozent Natriumhypochlorit und null Komma ein Prozent Triton x hundert enthält, zu einem Einkomma fünf Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit Samen hinzu. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten ruhen, um die Samen zu sterilisieren. Waschen Sie dann die Samen fünfmal mit sterilem Wasser.Suspendieren Sie die gewaschenen Samen in zweihundert Mikrolitern sterilem Wasser. Legen Sie die einzelnen Samen mit feinen Spitzen vorsichtig auf die Oberfläche des plattierten MS-Agar-Mediums. Lagern Sie die Platten drei Tage lang bei vier Grad Celsius, um die Keimung zu synchronisieren.Bewahren Sie danach mittlere Platten zehn Tage lang unter normalen Wachstumsbedingungen auf. Setzen Sie die keimenden Sämlinge in die Erde um und achten Sie darauf, die Wurzeln nicht zu beschädigen. Decken Sie das Tablett über Nacht mit einer transparenten Plastikabdeckung ab, um die Feuchtigkeit zu erhalten.Züchte die Pflanzen sieben Wochen lang in einem kontrollierten Anbauraum, dann sind sie bereit für die Infiltration durch Agrobacterium tumefaciens. Zu Beginn geben Sie einhundertfünfzig Nanogramm Plasmide in den a-Tumefaciens-kompetenten Zellstamm GV3101. Die Röhrchen mit der a-Tumefaciens-Kultur in einen Schüttler geben und vier Stunden lang inkubieren.Übertragen Sie die Kultur mit einem Glasstab aus den Röhrchen auf LB-Medien. A-Tumefaciens und LB-Agarmedium vier Tage lang bei 28 Grad Celsius kultivieren. Bereiten Sie sich als Nächstes darauf vor, eine einzelne a-tumefaciens-Kolonie aus jeder Platte in ein eigenes Röhrchen mit drei Millilitern flüssigem LB-Medium zu inokulieren.Schütteln Sie bei 280 RBM bei 28 Grad Celsius für 24 Stunden, um die Kultur zu vermehren. Dann werden 75 Mikroliter der Bakterienkultur in 15 Milliliter frisches LB-Flüssigmedium überführt, das 15 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin enthält. Kultivieren Sie die Bakterien bei 220 U/min bei 30 Grad Celsius für etwa 8 Stunden, bis OD600 zwischen 0,5 und 1 liegt.Übertragen Sie danach die Kultur in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 4000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in 15 Millilitern Transformationslösung.Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 4000-facher Schwerkraft und 4 Grad Celsius. Wiederholen Sie dann den Suspensions- und Zentrifugationsschritt erneut. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Palette wieder in 5 Millilitern Transformationslösung.Lassen Sie die aufgehängte Palette zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei Dunkelheit ruhen. Geben Sie dann entweder die Transformationslösung in den OD600 ist 0,5 oder kombinieren Sie zwei Proben mit gleichem Volumen, um gepaarte Proteininteraktionen zu testen. Infiltrieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze suspendierte Zellen in das vierte bis siebte Blatt.Decken Sie die Pflanzen danach sofort 12 Stunden lang mit einer schwarzen Plastikabdeckung ab. Erstens sollten Pflanzen sehr gesund sein, um den Erfolg zu gewährleisten. Zweitens: Achten Sie darauf, dass während des Infiltrationsprozesses keine Blätter beschädigt werden.Bewahren Sie das Tablett 12 Stunden lang im Dunkeln auf. Lass die Pflanzen dann 2 bis 4 Tage lang unter normalen Bedingungen wachsen, bevor du die Luciferase-Aktivität feststellst. Um mit der bildgebenden Methode zu beginnen, lösen Sie ein infiltriertes Blatt.Legen Sie die gesamte Packungsbeilage auf einen Teller mit MS-Agar-Medium. Mit einer 50-Milliliter-Sprühflasche Luciferon Arbeitspuffer auf die adaxiale Seite der Blätter sprühen. Dann 5 Minuten im Dunkeln halten, um die Chlorophyll-Autofluoreszenz zu löschen.Verwenden Sie ein lichtgekühltes CCD-Imagine-Gerät, das auf minus 30 Grad Celsius gekühlt ist, um Bilder mit einer lichtgefüllten Belichtungszeit von 50 Millisekunden und einer Lumineszenzdetektionszeit von 1 Minute aufzunehmen. Schneiden Sie danach Blattfragmente aus dem Infiltrationsbereich der N-benthamiana-Blätter aus. Tauchen Sie die Fragmente in 100 Mikroliter deionisiertes Wasser in die Vertiefungen der 96-Well-Weißplatte.Fügen Sie zehn Mikroliter Luciferon-Arbeitspuffer hinzu. Den Teller 5 Minuten ruhen lassen. Führen Sie dann eine gewünschte spezifische Behandlung durch, um die Dynamik der Proteininteraktion zu untersuchen, und messen Sie die Lumineszenz direkt mit einem kommerziellen Luminometer.Hier ist die Demonstration der luziferen Aktivität zur Darstellung der COP 1 SPA 1 Wechselwirkungen zu sehen. Die luziferöse Aktivität, die durch Lumineszenz detektiert wird, wird mit einer CCD-Kamera abgebildet. Es wird beobachtet, dass COP 1 SPA 1-Wechselwirkungen zu einer Kupfermutation der funktionellen Luciferase führen.Die Luciferase-Aktivität unter der Behandlung mit Jasmin 8 im Laufe der Zeit wird dann bestimmt. COP 1 SPA 1 Wechselwirkungen, die durch Luciferase-Aktivität repräsentiert werden, nehmen in der Dunkelheit allmählich ab. Die Behandlung mit Jasmin 8 reduziert diese Wechselwirkungen weiter.Einmal gemeistert, kann diese Technik in 1 Woche durchgeführt werden, nachdem die Pflanzen fertig sind, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gesunde Pflanzen zu erhalten. Infiltrieren Sie Blätter vorsichtig und fügen Sie die Kontrollen richtig ein.Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Signaltransaktionen den Weg, um die Dynamik der Protein-Protein-Interaktion auf schnelle Weise zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tabakpflanzen anbaut, Agrobakterien in Tabakblätter infiltriert und luziferöse Aktivitäten erkennt.

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Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter...

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Dieses Video zeigt den Split-Luciferase-Komplementationsassay zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Assay werden die Proteine von Interesse an kleine und große Fragmente des Luciferase-Enzyms getaggt. Wenn die Proteine interagieren, verbinden sich die großen und kleinen Fragmente zu einem aktiven Enzymkomplex, der in Gegenwart eines bestimmten Substrats eine helle Lumineszenz freisetzt, die gemessen werden kann.

Split-Luciferase-Komplementationsassay zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Auf subzellulärer Ebene werden Signalereignisse dynamisch durch Entwicklungs- und Umwelteinflüsse moduliert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das transiente Expressionssystem Tabak verwendet, um die dynamische Protein-Protein-Interaktion zu überwachen und die räumliche Organisation der Signaltransduktion in Pflanzenzellen aufzudecken.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Das hier vorgestellte Protokoll soll das Auftreten heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten N- und/oder C-Termini in lebenden Säugetierzellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays demonstrieren.

Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay

Wir beschreiben hier eine einfache Methode für die Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das mit GFP in Nicotiana benthamianaverschmolzen wird. Dieses Protokoll kann auf die Reinigung und Visualisierung zahlreicher Proteine erweitert werden, die die Säulenchromatographie nutzen. Darüber hinaus ist das Protokoll an das persönlich und virtuelle College-Lehrlabor anpassbar und bietet projektbasierte Erkundungen.

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

Hier stellen wir eine Methode zur Visualisierung der ternären Komplexbildung zwischen drei Proteinpartnern unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Proteine durch BiFC-basierten FRET-FLIM-Assay vor. Diese Methode ist wertvoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionskomplexen in vivo.

Bestimmung der dreigliedrigen Wechselwirkung zwischen zwei Monomeren eines MADS-Box-Transkriptionsfaktors und eines Calcium-Sensorproteins mittels BiFC-FRET-FLIM-Assay

Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Hier wird ein FRET-Protokoll vorgestellt, um die Assoziation von Histon-modifizierenden Enzymen mit Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die sie zu den Zielpromotoren für die epigenetische Regulation der Genexpression in Pflanzengeweben rekrutieren.

Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren in vivo durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Erfahren Sie die Luciferase-Komplementierung in Nicotiana benthamiana zur quantitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Diese schnelle Methode ermöglicht präzise Messungen mit Luminometer oder CCD-Kamera.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik (Video) | JoVE Journal

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

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