Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Effizienz bei der Transplantation von tumorinitiierenden Lungenkrebszellen in die Atemwege von Mäusen zu erhöhen. Diese Methode kann dazu beitragen, neue präklinische Modelle zu etablieren, um Schlüsselfragen der Krebsbiologie zu beantworten, einschließlich der Ursachen von Arzneimittelresistenzen und des Zusammenhangs zwischen Fibrose und Lungenkrebs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Transplantationseffizienz von tumorinitiierenden Zellen in die Lunge einer Vielzahl von Mausstämmen erhöht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie, da sie es uns ermöglicht, eine größere Vielfalt von menschlichen Lungenkrebs-Subtypen zu modellieren, von denen bekannt ist, dass sie unterschiedlich auf die Behandlung ansprechen. Für dieses Protokoll muss den Mäusen zunächst Bleomycin injiziert werden. Dann, nach 14 Tagen, werden die Tumorzellen injiziert.

Das Vorgehen bei beiden Injektionen ist sehr ähnlich und wird hier beschrieben. Zwei Stunden vor der Injektion den Bleomycin-Fond auf Eis auftauen und auf die Arbeitskonzentration verdünnen. Bewahren Sie es auf Eis auf.

Für einen Zellbolus lassen Sie eine Zellsuspension herstellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Eingriffszeit für jede Maus beträgt insgesamt etwa 10 Minuten. Achten Sie darauf, die richtige Anästhesie mit einer Zehenkneifung zu bestätigen und tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf.

Wenn die Maus zu diesem Zeitpunkt dunkles Haar hat, rasieren Sie den gesamten Rippenbereich sowohl ventral als auch dorsal, damit er korrekt abgebildet werden kann. Platzieren Sie dann die Maus auf der Intubationsplattform, indem Sie sie mit dem Rücken gegen die Plattform an den Vorderzähnen befestigen. Wenn ein Zellbolus injiziert werden soll, suspendieren Sie ihn jetzt mit sanfter Verreibung.

Beleuchten Sie nun die obere Brustregion, öffnen Sie den Mund und ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit einer flachen Pinzette heraus. Bereiten Sie einen IV-Katheter für die Luftröhre vor, indem Sie die Nadel entfernen, und positionieren Sie sie dann über der Trachealöffnung. Führen Sie dann den Katheter in die Luftröhre ein, bis sich die Oberseite des Katheters in der Nähe der Vorderzähne befindet, und beleuchten Sie das Innere des Katheters, um seine Platzierung zu bestätigen.

Geben Sie dann die 50 Mikroliter frisch hergestelltes Bleomycin oder Zellsuspension direkt in den Katheter. Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volumen den Katheter hinunter wandert. Entfernen Sie dann den Katheter und entsorgen Sie ihn in 10%iger Bleiche.

Wenn die Maus die Flüssigkeit nicht einatmet, überwachen Sie sorgfältig ihre Atmung und passen Sie die Katheterposition an. Wenn die Maus aufhört zu atmen, entfernen Sie sofort den Katheter und lassen Sie die Maus atmen, bevor Sie den Katheter wieder einführen. Nachdem Sie den Katheter entfernt haben, setzen Sie den Eingriff fort, um fünf behandelte Mäuse zu haben, die noch anästhesiert sind und bereit für die Bildgebung sind.

Legen Sie die Maus zur Genesung auf ein von der IACUC zugelassenes Heizkissen in einen Aufwachkäfig und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt hat. Zwei bis drei Minuten nach der Injektion der Zellen injizieren Sie 100 Mikroliter Luciferin retroorbital mit einer Insulinnadel. Wechseln Sie das Auge, das für die Injektion verwendet wird, bei jeder Bildgebungssitzung ab.

Nach einer Wartezeit von mindestens zwei Minuten werden bis zu fünf Mäuse in einem tierischen Biolumineszenz-Imager in der sternalen Liegeposition positioniert und unter Verwendung der Lumineszenzeinstellungen ein dorsales Bild aufgenommen. Passen Sie im Bedienfeld die Auflösungs- und Empfindlichkeitseinstellungen an, um die Lumineszenz der Zellen zu messen. Beginnen Sie bei den meisten Anwendungen mit drei Minuten, stellen Sie das Binning auf mittel ein, stellen Sie die Blende auf eins ein, stellen Sie das Sichtfeld auf d ein und stellen Sie die Motivhöhe auf 1,5 ein.

War die Injektion erfolgreich, wird im oberen Brustbereich in einer Lunge oder in beiden Lungen ein Signal detektiert. Wenn sich Zellen am Eingang der Luftröhre ansammeln, war die Injektion nicht erfolgreich. Nachdem Sie das dorsale Bild aufgenommen haben, drehen Sie die Mäuse um, nehmen Sie ein ventrales Bild auf und passen Sie die Einstellung nach Bedarf an.

Nach der Bildgebung fahren Sie mit der postoperativen Versorgung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Wiederholen Sie dann dieses Bildgebungsprotokoll drei Tage nach der Transplantation und danach wöchentlich. Um die Bilder zu analysieren, verwenden Sie eine Biolumineszenz-Analysesoftware.

Laden Sie zunächst alle entsprechenden Bilder in die Serie. Dieser Abschnitt bezieht sich detailliert auf ein Softwarepaket. Erstellen Sie als Nächstes für jede Maus im ersten Bild der Serie einen quadratischen Bereich von Interesse und positionieren Sie ihn über dem oberen Brustbereich, der die gesamte Lungenregion abdeckt.

Greifen Sie dann mit einem Rechtsklick auf die Funktion "Alle Interessenbereiche kopieren" zu und verwenden Sie dieses Werkzeug, um dieselben Interessenbereiche auf jedes Bild in der Gruppe anzuwenden. Passen Sie dann in jedem Bild die Positionen der Quadrate an, um die obere Brust jeder Maus zu bedecken. Tun Sie dies sowohl für die ventrale als auch für die dorsale Ansicht.

Wählen Sie nun in der oberen linken Ecke des Bildfensters die Photonenfunktion aus. Wählen Sie dann die Option "Messen" aus. Die Daten aus den interessierenden Regionen werden dann in einer Ausgabetabelle als Gesamtfluss angezeigt.

Analysieren Sie diese Daten nach Bedarf. Wenn das Immunsystem geschwächt war, wurden athyme Mäuse mit Bleomycin behandelt. Vor der Zell-Bolus-Transplantation wurde bis zum 14. Tag eine vorübergehende Fibrose bei mit Bleomycin behandelten Mäusen beobachtet, jedoch nicht bei Vehikel-behandelten Mäusen.

Als nächstes wurden Zellen der etablierten humanen Lungenkrebszelllinie H2030 intratracheal in die Lunge dieser Mäuse eingebracht. Nach 35 Tagen wiesen Mäuse, die mit Bleomycin behandelt wurden, eine hohe Lungentumorlast auf. Bei vehikelbehandelten Tieren wurden jedoch keine Tumore nachgewiesen.

Die Lungentumorlast wurde histologisch bestätigt. Lungen, die mit Vehikel vorbehandelt wurden, wiesen keine Hinweise auf Tumorknötchen auf, während Bleomycin-vorbehandelte Lungen große Tumorknötchen aufwiesen. Nach der Transplantation einer metastasierten H2030 BrM 3-Zelllinie war die Biolumineszenz nach 39 bis 57 Tagen zu intensiv für die Bildgebung, so dass die Metastasierung in entfernten Organen ex vivo analysiert wurde.

Kleine Läsionen konnten in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass diese Methode vielversprechend ist, um spontan disseminierte Krankheiten zu untersuchen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 Minuten pro Käfig von fünf Mäusen ohne Bildgebung und 20 Minuten pro Käfig durchgeführt werden, wenn auch die Mäuse bildgebend gemacht werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Katheter richtig einzuführen und die Atmung des Tieres zu überwachen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie pharmakologische Studien oder die Aminoessigsäurechemie von entnommenem Gewebe durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie transplantierte Tumoren auf Medikamente ansprechen oder wie tumorstromale Wechselwirkungen für die Lunge spezifisch charakterisiert werden. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik auf verschiedene Mausstämme und Tumormodelle angewendet werden, einschließlich patientenabgeleiteter Xenotransplantate in einem physiologisch relevanten Umfeld. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bleomycin extrem gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Manipulation in einer Biohazard-Haube und die ordnungsgemäße Entsorgung getroffen werden sollten.