Name: Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Einrichtung eines Mausmodells für kleine Fasern-Neuropathie mit Resiniferatoxin. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Schmerzmechanismen und sensorischen Nervenverletzungen in vivo.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) und Ziel für die Top Universitäten Grant (TP105PR15), Kaohsiung Medical University, Taiwan.

Die beschriebenen Verfahren sind im Einklang mit ethischen Richtlinien für Labor Tiere30, und das Protokoll genehmigt wurde, durch die Tier Ausschuss von Kaohsiung medizinische Universität, Kaohsiung, Taiwan.
1. Aufbau der RTX Neuropathie
Vorsicht: RTX ist neurotoxisch und gefährlich. Kontakt fungiert es als reizend auf die Augen, die Schleimhäute und die oberen Atemwege. Nicht einatmen und während RTX Vorbereitung Labor Brillen und Mäntel tragen. Spülen Sie mit viel Wasser bei Hautkontakt oder nach der Handhabung.
<ol><li>Ein 200 µL Mischung aus gleicher Lautstärke von Tween 80 und absoluten Ethanol (100 µL für jedes Lösungsmittel) 1 mg RTX Pulver hinzufügen.</li>
	<li>Aliquoten RTX-Lösung (12 µL/Vial) und bei-20 ° C, für bis zu 3 Monate lagern. Dies stellt die RTX-Lager; nach Ablauf die restliche RTX-Lösung zu verwerfen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die RTX-Aktie mit normalen Kochsalzlösung zu einem Endvolumen von 600 µL. Die Endkonzentration der RTX-Lösung sollte 0,01 %, entspricht 1 µg RTX in 10 µL Fahrzeuglösung.</li>
	<li>8 Wochen alten erwachsenen männlichen ICR Mäuse (35-40 g) als Versuchstiere verwenden und verwalten eine Einzeldosis von RTX-Lösung (Dosis: 200, 50 und 10 µg/kg, beziehungsweise) intraperitoneal (i.p.) mit einer Mikroinjektion Spritze für die Mäuse. Mäusen wurde durch Inhalator mit 5 % Isofluran für Tiefe Anästhesie betäubt. Wenn Mäuse Rücknahme Aktion der Extremitäten während RTX Injektion zeigten, nehmen Mäuse länger Einatmen der Anästhesie. Beispiel: Wenn die Maus 40 g wiegt, dann wird es 20 µL der RTX-Lösung, repräsentieren die Dosis von 50 µg/kg erhalten.</li>
	<li>Geben Sie eine Gruppe von Mäusen ein gleiches Volumen des Fahrzeugs (10 % Tween 80 und 10 % absolute Ethanol in Kochsalzlösung), als Kontrolle.</li>
	<li>Nach der Injektion RTX zurück die Mäuse zu einem Kunststoffkäfig auf einer 12 h Licht/12-h dunkel-Zyklus und liefern Nahrung und Wasser Ad Libitum.</li>
</ol>2. Bewertung der neuropathischen Verhalten
Hinweis: Halten Sie die Tiere in einer komfortablen Umgebung (Schritt 1.6) erlauben Erholung nach der Injektion. Am 7. Tag Post RTX Injektion (D7) führt jedes Tier die Heizplatte und von Frey Haar Filament Tests am selben Tag zur Zeit Bias reduzieren und die Effizienz der behavioral Tests zu fördern. Bringen Sie die Tiere um ein ruhiges Zimmer, das auf eine stabile Luftfeuchtigkeit (40 %) und Temperatur (27 ° C) gehalten wird für die Optimierung von tierischen Akklimatisation und Verringerung der Umweltauswirkungen während der Verhaltens-Prüfung. Stören Sie die Tiere nicht während Testzeiten; die behavioral Tests sind wöchentlich geplant.
<ol><li>Messung der thermischen Latenzen mit der heißen Platte test<ol>
<li>Legen Sie das Tier sanft auf eine heiße Metallplatte (27 cm × 29 cm) mit einem transparenten Plexiglas Käfig (Länge × Breite × Höhe: 22 cm × 22 cm × 25 cm; Abbildung 1A). Stellen Sie die Temperatur der heißen Metallplatte auf 52 ° C.</li>
		<li>Starten Sie die Dauer der thermischen Latenz des Tieres auf der Heizplatte mit den Schritt-on, eingebaute Timer der Heizplatte zu messen, sobald das Tier Hinterpfoten der heißen Platte berühren, und beobachten Sie die Reaktionen des Tieres Hinterpfoten. Wenn das Tier schütteln zeigt, der Hinterpfoten lecken, oder springen, während auf der Heizplatte entfernen Sie und erfassen Sie die Dauer, die das Tier auf der heißen Platte blieb. Diese Zeitdauer definiert die thermische Latenz des einzelnen Tieres. Erfassen die thermische Wartezeit auf die nächste 0,1 s.</li>
		<li>Führen Sie für jede Testsitzung drei Studien mit 30-min-Takt für die Normalisierung der Reaktion nach dem letzten Test der Heizplatte. Wenn das Tier keine Reaktion auf die Heizplatte zeigt, beenden die Sitzung nach 25 s, potentiellen Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messung von mechanischen Schwelle mit der von Frey Haar Glühfaden testen<ol>
<li>Setzen Sie das Tier auf maßgeschneiderte Metallgitter (Maschenweite: 5 mm × 5 mm) mit einem semi-transparenten Zylinder Plexiglas Käfig (Durchmesser: 13 cm; Höhe: 12 cm) (Abbildung 1 b) für die Akklimatisation für mindestens 2 h.</li>
		<li>Gelten Sie die unterschiedlichen Kalibern der von Frey Haar Filamente für plantar und Umgebung: die Hindpaw mit der wechselvollen Methode31. Beginnen Sie Erstantrag aus dem mittleren Kraft eines Satzes von Frey Haar Filamente für die Dauer von Filament Anwendung von 5-8 s.</li>
		<li>Verwenden Sie ein 2 min Intervall zwischen Filament Anwendungen, tierische Normalisierung zu optimieren. Ändern Sie die angewandte Filament Kraft anhand des Tieres letzte Antwort. Hinweis: Eine Reihe von Frey Haar Filamente besteht aus 0.064, 0,085 0.145, 0,32, 0,39, 1,1 und 1,7 g Krafteinleitung. Zum Beispiel wenn Hindpaw Rückzug mit einer Vorspannkraft von 0,32 g aufgetreten ist, dann gelten Sie 0,145 g. In Ermangelung einer Pfote Rückzug wird eine 0,39 g-Kraft angewendet. Dann vier weitere Fäden unterschiedlicher Kräfte gelten basierend auf den vorangegangenen Antworten und die mechanische Schwelle bemisst sich nach einem veröffentlichten Formel31.</li>
		<li>Für jeden Test-Session sind die bilateralen Hinterpfoten. Führen Sie drei Versuche für jedes Hindpaw. Den Durchschnitt dieser sechs mechanischen Schwellen als mittlere mechanische Schwelle (mg) eines jeden Tieres ausdrücken.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56651/56651fig1.jpg"> Abbildung 1: Maßgeschneiderte Käfig aus Plexiglas und Metall mesh für die Bewertung des neuropathischen Schmerzes im Mausmodell der Resiniferatoxin (RTX)-induzierte kleine Faser Neuropathie. (A, B) Diese Diagramme zeigen die Ausstattung zur Messung (A) die thermische Latenzen durch eine heiße Metallplatte (27 cm × 29 cm) mit einem transparenten Plexiglas Käfig (Länge × Breite × Höhe: 22 cm × 22 cm × 25 cm) und (B) die mechanische Schwelle durch eine individuelle Meta bewerten l-Gitter (Maschenweite: 5 mm × 5 mm) mit einem semi-transparenten Zylinder Plexiglas Käfig (Durchmesser: 13 cm; Höhe: 12 cm) in den Mäusen mit kleine Faser RTX-induzierte Neuropathie. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56651/56651fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
(3) Biopsie Aufbereitung und Auswertung von IENFs Innervation der Haut
<ol><li>Nach Verhalten testen die Tiere mit 5 % Isofluran zu betäuben und die Tiere durch intrakardiale Perfusion mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB) (pH 7,4), gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (4P) in 0,1 M PB zu opfern.</li>
	<li>Schneiden Sie die erste Wegelagerer die beiden Hinterpfoten nach Perfusion und Post-fixieren sie in 4P für ein weiteres 6 h Übertragung der Straßenräuber Gewebe auf 0,1 M PB bei 4 ° C für die langfristige Lagerung.</li>
	<li>Cryoprotect Wegelagerer mit 30 % Saccharose in PB über Nacht und in einer vertikalen plantar Oberfläche Art und Weise in 30 µm dicke Scheiben schneiden. Beschriften Sie die Straßenräuber Abschnitte nacheinander und anschließend zu speichern in Frostschutzmitteln bei-20 ° C. Hinweis: Die Frostschutzmittel Zusammensetzung lautet wie folgt: destilliertes Wasser, Ethylen Glyzerin, Glycerin und 2 X PB in einem 3:3:3:1 Verhältnis.</li>
	<li>Um ausreichende Probenahme sicherzustellen, wählen Sie jeden dritten Abschnitt die Straßenräuber.<ol>
<li>Setzen Sie die gewählten Straßenräuber Abschnitte auf beschichteten Objektträgern und trocknen sie.</li>
		<li>Eine Kunststoff-Abdeckung auf die Folie und den Prozess mit standard Immunostaining Verfahren zu decken.<ol>
<li>Die Straßenräuber Abschnitte mit 1 % H2O2 in Methanol für 30 min zu stillen und blockieren mit 0,5 % fettfreie Trockenmilch und 0,1 % Triton x-100 in 0,5 M Tris-Puffer (Tris) für 1 h.</li>
			<li>Inkubieren Sie Straßenräuber Abschnitte mit Antiseren gegen Pan axonalen Marker, PGP 9.5 (aufgewachsen in Kaninchen, 1:1, 000), über Nacht bei 4 ° c</li>
			<li>Brüten Sie Straßenräuber Abschnitte mit einem biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG sekundäre Antikörper bei Raumtemperatur (RT) für 1 h, und dann mit dem Avidin-Biotin-Komplex bei RT 45 min inkubieren.</li>
			<li>Visualisieren Sie das Reaktionsprodukt mit 0,05 % 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) Lösung für 45 s. Dann waschen Sie Straßenräuber Abschnitte mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie für die Montage. Hinweis: Die primären und sekundären Antiseren werden mit 0,5 % fettfreie Trockenmilch in 0,5 M Tris verdünnt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) DRG Abschnitt Vorbereitung und Auswertung von verletzten kleinem Durchmesser Neuronen
<ol><li>Sezieren die 4th und 5th lumbale DRG und Post-Update für eine weitere 2 h.</li>
	<li>Cryoprotect DRG-Gewebe mit 30 % Saccharose in PB über Nacht und nacheinander der 8 µm Dicke schneiden, legen Sie auf Objektträger und Label. DRG-Abschnitte in einem-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren.</li>
	<li>Immunostain DRG Abschnitte im 80 µm-Takt um ausreichend Probenahme sicherzustellen.<ol>
<li>Führen Sie DRG Immunostaining Verfahren als diejenigen der Straßenräuber Abschnitte, mit Ausnahme der Doppel-Kennzeichnung immunofluorescent Verfahren. Alternativ sind ATF3 (aufgewachsen in Kaninchen, 1: 100), eine Verletzung Marker und Peripherin (aufgewachsen in Maus; 1:800), einem kleinem Durchmesser neuronalen Marker in der primären Antiseren.</li>
		<li>Inkubieren Sie DRG-Abschnitte mit der Mischung von primären Antiseren über Nacht bei 4 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren DRG Abschnitte mit entweder Texas rot oder Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugiert sekundäre Antiseren (1: 200), entspricht die entsprechende primäre Antiseren bei RT für 1 h und dann zur Quantifizierung montieren.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben

Wirksame Therapie der Neuropathie kleine Faser in der Klinik ist erforderlich für die funktionelle Erholung und Lebensqualität der Patienten zu fördern. Derzeit gibt es Mangel an eine therapeutische Anleitung targeting sensorischen Störung kleine Faser Neuropathie aufgrund mangelnder umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen zugrunde liegenden neuronalen Verletzung kleinem Durchmesser zugeordnet. Frühere Modelle der Neuropathie betroffen in der Regel sowohl große und kleine-Durchmesser Sinnesnerven; zum Beispie...

Kleine Faser Neuropathie bei neuropathischen Schmerzen, die durch Degeneration der IENFs hervorgeht, ist häufig in verschiedenen Arten von Bedingungen, wie z. B. DM und als Folge die neurotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika1,2, 3,4,5. IENFs sind die peripheren Terminals von kleinem Durchmesser Neuronen befindet sich in den dorsalen Wurzel Ganglien (DRG) und parallel in Fällen von IENF Degeneration6betroffen sind. Beispielsweise wurde die veränderte vorgelagerten genetische Transkription des neuronalen Somata durch die Hochregulierung des Aktivierens Transkription Faktor 3 (ATF3)6,7nachgewiesen. Darüber hinaus eignet sich die Bewertung der IENFs Innervation mit Hautbiopsie zur Diagnose von small Fiber Neuropathie5,8,9. Traditionell sind die Profile der IENFs auf die Hautbiopsie immunhistochemischen Nachweis der Protein-Genprodukt 9.5 (PGP 9.5)1,10,11angewiesen. Zusammengenommen, die pathologische Profile der DRG und IENFs reflektieren die Funktionszustand zugrunde liegende kleine Faser Neuropathie und möglicherweise ein Indikator für die funktionelle Folgen dieser Art von Neuropathie auf kleinem Durchmesser Neuronen.
Bisher haben mehrere experimentelle Modelle die Angelegenheit der IENF Degeneration in Fällen der Chemotherapie-induzierte Neuropathie12,13 und Nerv Schädigung durch Kompression oder Durchtrennung14,15 , 16. Diese experimentelle Modelle betroffen auch großem Durchmesser Nerven; Daher war es nicht möglich, den Beitrag der betroffenen Großrohre Nerven in den beobachteten kleine Faser Neuropathie; auszuschließen zum Beispiel hängt die Prüfung der Thermosensation Störung durch schädliche Rückzug funktionellen motorischen Nervenfasern17,18,19. So sind eine reine kleine Faser Neuropathie Modell zu etablieren und systematisch untersucht den pathologischen Status der neuronalen Somata und ihre peripheren kutanen Nervenfasern in kleinem Durchmesser Neuronen notwendig und unerlässlich.
RTX ist ein Analogon der Capsaicin und ein potenter Agonist, Transienten Rezeptor potential Vanilloid-Rezeptor 1 (TRPV1), der nozizeptiven Verarbeitung20,21,22vermittelt. Vor kurzem, periphere RTX Behandlung erleichtert neurogene Schmerzen23,24,25 , und eine intraganglionic Injektion von RTX induzierte irreversiblen Verlust der DRG-Neuronen-22. Die Wirkung der peripheren RTX-Verwaltung ist dosisabhängig20,26,27, die die vorübergehende Desensibilisierung oder Degeneration der IENFs geführt. Faszinierenderweise führte systematische Hochdosis-RTX Behandlung zu neuropathischen Schmerzen28, ein Symptom für kleine Faser Neuropathie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung Modus und Dosis von RTX deutliche pathologische Effekte und neuronalen Antworten produzieren; nämlich, periphere Verwaltung Schmerz Übertragung durch lokale Effekte29 verhindert und beeinflusst die neuronalen Somata, die neuropathischen Verhalten6entwickelt. Gemeinsam zeigen diese Erkenntnisse, dass RTX Multipotenz wirkt und die Frage aufgeworfen, ob gibt es eine bestimmte Dosis von RTX, die systematisch die peripheren Nerven, wie die peripheren IENFs und zentralen neuronalen Somata beeinträchtigen könnten. Wenn dies der Fall ist, möglicherweise RTX eine potenzielle Agent gezielt Einfluss auf kleinem Durchmesser Neuronen und kleine Faser Neuropathie in der Klinik zu imitieren. DM in der Klinik ist beispielsweise ein kompliziertes Thema, einschließlich Stoffwechselstörung und Neuropathologie der peripheren Nerven, die die wichtigsten Merkmale der kleine Faser Neuropathie sind. Die Mechanismen der kleine Faser DM-assoziierte Neuropathie konnte nicht den Beitrag der Stoffwechselstörung ausschließen, die nicht der Hauptwirkstoff, die periphere Nerven betreffen kann. Kleine Faser DM-assoziierter Neuropathie erfordert daher eine reine Tiermodell, das die Auswirkungen der systematischen Stoffwechselstörung ausgeschlossen werden konnte. Dieses Protokoll beschreibt die Arbeiten Dosis von RTX, eine typische kleine Faser Neuropathie Modell, einschließlich IENF Degeneration und kleinem Durchmesser Neuron Verletzungen, wie modifizierte Immunostaining Analyse zeigt zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Chemisches Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resiniferatoxin</td><td>Sigma</td><td>R8756</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidin</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-Biotin-Komplex</td><td>Vector</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primary Antisera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>Chemicon</td><td>MAB-1527</td><td></td></tr><tr><td>ATF3</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-188</td><td></td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>UltraClone</td><td>RA95101</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Sekundäre Antiseren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG-Vektor</td><td></td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Rot konjugierte Ziege Anti-Maus</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-075-146</td><td></td></tr><tr><td>Isothiocyanat (FITC)-konjugierter Esel Anti-Kaninchen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>IITC</td><td>Model 39</td><td></td></tr><tr><td>von Frey Filament</td><td>Somedic Sales AB</td><td>10-600-0001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>MaterialShandon</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Abdeckplatte</td><td>Thermo wissenschaftliche</td><td>72110017</td><td></td></tr><tr><td>Schiebegestell</td><td>Thermo wissenschaftliche</td><td>73310017</td><td></td></tr></tbody></table>

einrichtung ein mausmodell eine reine kleine faser neuropathie mit ultrapotent agonisten von transienten rezeptor potential vanilloid typ 1

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patienten mit Diabetes Mellitus (DM) oder diejenigen erleben die neurotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika entstehen Empfindung Störungen durch Degeneration und Verletzung von kleinem Durchmesser sensorischen Neuronen, als kleine Faser Neuropathie bezeichnet. Derzeitigen Tiermodelle der kleine Faser Neuropathie beeinflussen sowohl große und kleine-Durchmesser sensorischen Fasern und schaffen damit eine Neuropathologie zu komplex, um die Auswirkungen der verletzten kleinem Durchmesser sensorischen Fasern richtig einschätzen zu können. Daher ist es notwendig, ein experimentelles Modell der reinen kleine Faser Neuropathie, diese Fragen hinreichend zu prüfen zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Modell der kleine Faser Neuropathie speziell auf kleinem Durchmesser Sinnesnerven mit Resiniferatoxin (RTX), ein ultrapotent-Agonist der Transienten Rezeptor potential Vanilloid Typ 1 (TRPV1), durch eine einzelne Dosis von intraperitoneale Injektion als RTX Neuropathie bezeichnet. Dieser zeigte pathologischen Erscheinungen und Verhaltens-Anomalien, die die klinischen Merkmale der Patienten mit Neuropathie kleine Faser, einschließlich Intraepidermal Nervenfaser (IENF) Degeneration, insbesondere Verletzungen im nachahmen RTX-Neuropathie kleinem Durchmesser Neuronen und Induktion von thermischen Hypoalgesia und mechanische Allodynie. Dieses Protokoll getestet drei Dosen von RTX (200, 50 und 10 µg/kg, beziehungsweise) und kam zu dem Schluss, dass eine kritische Dosis von RTX (50 µg/kg) ist für die Entwicklung der typischen kleinen Faser Neuropathie Manifestationen erforderlich und ein veränderter Immunostaining Verfahren zur IENF Degeneration und neuronale Soma Verletzungen zu untersuchen. Das geänderte Verfahren ist schnell, systematische und wirtschaftliche. Verhaltens Bewertung des neuropathischen Schmerzes ist entscheidend für die Funktion von kleinem Durchmesser sensorischen Nerven zu zeigen. Die Bewertung der mechanischen Schwellen in experimentellen Nagetiere ist eine besondere Herausforderung, und dieses Protokoll beschreibt eine maßgeschneiderte Metallgewebe, die für diese Art der Bewertung bei Nagetieren geeignet ist. Zusammenfassend lässt sich sagen dass RTX Neuropathie ein neues und gut etablierten experimentellen Modell zur Bewertung der molekularen Bedeutung und Intervention zugrunde liegenden neuropathischen Schmerzen für die Entwicklung von Therapeutika.

Dieses Protokoll beschreibt eine neue Maus-Modell der RTX Neuropathie, betrifft insbesondere kleinem Durchmesser Neuronen, einschließlich IENF Degeneration, sensorische Störungen (Abbildung 2) zugeordnet. Nach dem hier beschriebenen Protokoll ausgestellten Tiere thermische Hypoalgesia und mechanische Allodynie D7 Post RTX Injektion. Dieses kleine Faser Neuropathie Modell, drei Dosen von RTX herstellen: 200, 50 und 10 µg/kg i.p Weg verabreicht wurden. Die RTX-...

Diese Studie stellt ein experimentelles Modell der reinen kleine Faser Neuropathie mit Resiniferatoxin (RTX). Eine einmalige Dosis von RTX (50 µg/kg) ist optimal für die Entwicklung eines Modells der kleine Faser-Neuropathie, die Patientencharakteristika imitiert und könnte dazu beitragen, die nozizeptiven molekularen Bedeutung zugrunde liegenden neuropathischen Schmerzen zu untersuchen.

Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Das übergeordnete Ziel dieses sensorisch spezifischen Neurotoxin-Verabreichungsverfahrens für Mäuse ist es, ein Modell für sensorische Neuropathie bei Kleintieren zu etablieren. Diese Technik hilft, die Gesetze der Verletzungen kleiner, sensorischer Fasern bei der sensorischen Neuropathie aufzudecken. Sein Hauptvorteil ist, dass es schnell und einfach ist.Diese Mäuse können helfen, wichtige Fragen im Bereich der sensorischen Neuropathie zu beantworten, z. B. welche Signalwege einen entscheidenden Beitrag für große sensorische Fasern leisten. Ziehen Sie zunächst persönliche Schutzausrüstung an und treffen Sie die richtigen Vorsichtsmaßnahmen, während Sie die Resiniferatoxin- oder RTX-Stammlösung herstellen. Verdünnen Sie ein Aliquot von 600 Mikrolitern in Kochsalzlösung für das Experiment und teilen Sie den Rest zur Lagerung in 12 Mikroliter Aliquot auf.Verwenden Sie für Testmäuse acht Wochen alte, erwachsene männliche ICR-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 35 und 40 Gramm. Verabreichen Sie eine Einzeldosis RTX-Lösung intraperitoneal mit einer Mikroinjektionsspritze. Als nächstes injizieren Sie eine zweite Gruppe von Mäusen mit dem gleichen Volumen des Vehikels, um als Kontrolle zu dienen.Nachdem Sie alle Injektionen durchgeführt haben, halten Sie die Mäuse in ihren Heimkäfigen und stellen Sie sicher, dass sie frei Zugang zu Futter und Wasser haben. Beginnen Sie nach sieben Tagen mit der Durchführung von Verhaltenstests einmal pro Woche. Führen Sie beide Tests am selben Tag in einem ruhigen Testraum mit stabiler Umgebung durch.Beginnen Sie mit der Messung der thermischen Latenzen der Tiere mit dem Heizplattentest. Stellen Sie eine Metallkochplatte auf 52 Grad Celsius ein. Setzen Sie dann ein Tier vorsichtig in einen transparenten Plexiglaskäfig auf der Heizplatte.Starten Sie einen Timer, sobald die Hinterpfoten des Tieres den heißen Käfig berühren. Wenn das Tier anfängt zu zittern, die Hinterpfoten zu lecken oder zu springen, nehmen Sie es heraus und notieren Sie, wie lange es der Herdplatte auf die Zehntelsekunde genau standgehalten hat. Wenn das Tier auf der Heizplatte keine Reaktion zeigt, beenden Sie die Sitzung nach 25 Sekunden, um mögliche Gewebeschäden zu vermeiden.Führen Sie drei Versuche pro Tier durch, mit einer Ruhezeit von 30 Minuten zwischen den Versuchen. Verwenden Sie später die durchschnittliche Zeit der drei Tests als Endergebnis des Tieres. Messen Sie als Nächstes die mechanische Empfindungsschwelle des Tieres.Setzen Sie das Tier in einen transparenten, runden Käfig mit einem Metallgitter als Boden. Nach der Akklimatisation tragen Sie die verschiedenen Kaliber der von Frey-Haarfäden mit der Auf-und-Ab-Methode auf den Plantarbereich der Hinterpfote auf. Für die erste Stimulation legst du ein Filament mit mittlerer Kraft für 5 bis 8 Sekunden auf.Warten Sie nach jeder Stimulation zwei Minuten und wenden Sie dann die nächste Kraft an, die auf der vorherigen Reaktion des Tieres basiert. Wenn sich die Hinterpfote zurückgezogen hat, verwenden Sie das nächstniedrigere Kaliber. Und wenn sich die Hinterpfote nicht zurückgezogen hat, verwenden Sie das nächstgrößere Filament.Fahren Sie mit diesem Vorgang fort, bis die Maus sechsmal angestoßen wurde. Berechnen Sie dann den mechanischen Schwellenwert mit einer festgelegten Formel. Führen Sie an jedem Testtag drei Versuche an jeder Hinterpfote durch.Drückt den Durchschnitt dieser sechs mechanischen Schwellenwerte als mittlere mechanische Schwelle jedes Tieres aus. Verwenden Sie zur Euthanasie 5 Prozent Isofluran, gefolgt von einer intrakardialen Perfusion. Entfernen Sie dann die ersten Fußballen der beiden Hinterpfoten und fixieren Sie sie sechs Stunden lang mit 4 Prozent PFA.Nach der Fixierung werden sie in 0,1 molaren Phosphatpuffer bei 4 Grad Celsius überführt. Dies dient als langfristige Aufbewahrungslösung. Vor der Kryosektion die Fußballen über Nacht in 30%iger Saccharose in PBS einweichen.Verwenden Sie am nächsten Tag einen Kryostaten, um 30-Mikrometer-Gewebescheiben zu machen, die senkrecht zur Plantaroberfläche schneiden. Beschriften Sie die Fußballenabschnitte nacheinander und lagern Sie sie dann in einer Anti-Feeze-Lösung bei minus 20 Grad Celsius. Bei der Bemusterung der Schnitte wird jeder dritte Schnitt ausgewählt und zum Trocknen auf einen beschichteten Objektträger übertragen.Decken Sie anschließend jede Seite mit einer Abdeckplatte ab und bearbeiten Sie sie mit einem Standard-Immunfärbeverfahren. Zuerst die Fußballenabschnitte mit 1%Wasserstoffperoxid in Methanol 30 Minuten lang abschrecken. Waschen Sie dann das Taschentuch dreimal bei Raumtemperatur, 0,5 molaren Tris-Puffer.Inkubieren Sie anschließend das Gewebe eine Stunde lang in Blocklösung. Inkubieren Sie die Schnitte dann über Nacht bei 4 Grad Celsius mit einem Anti-Sera gegen panaxonalen Marker. Waschen Sie die Schnitte am nächsten Tag dreimal mit Tris-Puffer und inkubieren Sie die Schnitte dann eine Stunde lang in biotinyliertem Anti-Kaninchen-IgG bei Raumtemperatur.Später verwenden Sie drei Waschgänge mit Tris-Puffer, um die ungebundenen Antikörper zu entfernen. Inkubieren Sie dann das Gewebe mit dem Avidin-Biotin-Komplex 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um das Reaktionsprodukt zu färben, tragen Sie kurz 45 Sekunden lang DAB-Lösung auf, waschen Sie dann die Fußpolsterteile mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie an der Luft, bevor Sie sie montieren.Nachdem Sie die Fußballen vom eingeschläferten Tier entfernt haben, präparieren Sie das vierte und fünfte lumbale DRG. Fixieren Sie dann das präparierte DRG-Gewebe zwei Stunden lang in vier Prozent PFA bei Raumtemperatur. Als nächstes kryoschützen Sie das DRG-Gewebe über Nacht mit 30% Saccharose in PBS.Schneiden Sie sie am nächsten Tag in Acht-Mikron-Abschnitte. Platzieren Sie sie auf Folien und beschriften Sie sie. Lagern Sie diese Abschnitte bei minus 80 Grad Celsius.Verwenden Sie die gleiche Methode wie für die Fußballenabschnitte, außer bei der Markierung, fügen Sie ATF-3, einen Verletzungsmarker, und Peripherin, einen neuronalen Marker mit kleinem Durchmesser, in die primären Anti-Seren ein und lassen Sie diese Reaktion über Nacht laufen. Nach dem Waschen der Abschnitte werden sie mit den entsprechenden sekundären Anti-Seren inkubiert. Montieren Sie dann nach einer weiteren Reihe von Wäschen die Abschnitte zur Quantifizierung.Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges Mausmodell der Resiniferatoxin-Neuropathie, die spezifisch Neuronen mit kleinem Durchmesser betrifft, einschließlich IENF-Degeneration, die mit sensorischen Störungen verbunden ist. Die Dosis von 50 Mikrogramm pro Kilogramm wurde als kritisch eingestuft und eine höhere Dosis war häufig tödlich. Sieben Tage nach der RTX-Injektion zeigten die Tiere eine thermische Hypoalgesie und eine mechanische Allodynie.Bei der kritischen Dosis kam es zu einer IENF-Degeneration und einer ausgeprägten ATF-3-Induktion. Bei den verletzten Neuronen handelte es sich um periphere Neuronen mit positivem Durchmesser mit kleinem Durchmesser. Im Gegensatz dazu führte die niedrige Dosis von RTX nicht zu einer Small-Fiber-Neuropathie und zeigte keine Veränderungen der Innervation.Auch zeigte die niedrige Dosis keine ATF-3-Induktion, einen Marker für neuronale Verletzungen. Daher wird die kritische Dosis von 50 Mikrogramm RTX pro Kilogramm für die Anwendung des beschriebenen Verfahrens empfohlen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein reines sensorisches Neuropathiemodell einrichten können.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der kleinen sensorischen Neuropathie, bis hin zu ihrem Produktbeitrag zur Verletzung kleiner sensorischer Nerven und zur Entwicklung neuropathischer Schmerzen. Vergessen Sie nicht, dass RTX neurotoxisch und gefährlich ist und die Augen, die Schleimhaut und die oberen Atemwege reizen kann. Vermeiden Sie Inhalationen und tragen Sie eine Laborbrille und einen Mantel, während Sie RTX handhaben.Bei Hautkontakt und nach der Handhabung mit viel Wasser abspülen.

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Forschung

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Dieses Video demonstriert das Testen der sensorischen Nervenfunktion in einem Mausmodell, indem eine Seite chirurgisch denerviert und die andere als Kontrolle belassen wird. Die Reaktion auf mechanische Stimulation bestätigt die Rolle der sensorischen Nerven.

Testen der sensorischen Nervenfunktion in einem operativ denervierten Mausmodell

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung eines Small-Fiber-Neuropathiemodells bei Mäusen unter Verwendung des TRPV1-Agonisten Resiniferatoxin (RTX). Es beschreibt die Schritte bei der Verabreichung von RTX an Mäuse und erklärt, wie RTX den neuronalen Tod in sensorischen Neuronen mit kleinem Durchmesser induziert und damit das Neuropathiemodell etabliert.

Etablierung eines Mausmodells für Small-Fiber-Neuropathie mit Resiniferatoxin

Neuropathische Schmerzen sind die Folge einer Verletzung oder Erkrankung des somatosensorischen Systems. Die "Manschette Modell" von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen besteht aus der Implantation einer Polyethylen Manschette um den Hauptzweig des Ischiasnervs. Mechanische Allodynie wird mit Hilfe von Frey Filamente getestet.

Der Ischiasnerv cuffing Modell von neuropathischen Schmerzen bei Mäusen

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

Die Messung der Nervenleitgeschwindigkeit ist ein nützliches Instrument zur Maus-Modellen der Neurodegeneration zu beurteilen, aber es ist häufig nur angewendet, um den Ischiasnerv im Hintergliedmaßen zu stimulieren. Hier beschreiben wir eine Technik, um zusammengesetzte Muskel Aktionspotential (CMAP) in Vivo in der Maus vordergliedmaße Muskeln innerviert den Plexus brachialis zu messen.

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der zusammengesetzten Muskel Aktionspotential aus die Vorderbeine in Maus-Modellen der Motor Neuron Degeneration

Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Das Footpad-Impfmodell ist ein wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung viral-induzierter neuroentzündlicher Reaktionen in vivo. Insbesondere bietet es eine klare Bewertung der viralen Kinetik und der damit verbundenen immunpathologischen Prozesse, die im peripheren Nervensystem eingeleitet wurden.

Maus Footpad Inokulation Modell zur Untersuchung viral-induzierte neuroentzündliche Reaktionen

Die modifizierte Operation ist eine vereinfachte Methode für das Modell der Nervenverletzung von Mäusen oder Ratten, die nur eine Ligatur und einen Schnitt erfordern, um sowohl den Nervus peroneus als auch den Nervus suralis zu verletzen.

Modifiziertes Modell der Chirurgie der Nervenverletzung bei neuropathischen Schmerzen bei Mäusen

Die partielle Ligatur des Ischiasnervs induziert lang anhaltende chronische neuropathische Schmerzen, die durch übertriebene Reaktionen auf thermische und mechanische Reize gekennzeichnet sind. Dieses Mausmodell für neuropathische Schmerzen wird häufig verwendet, um innovative Therapien zur Schmerzbehandlung zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt detailliert das chirurgische Verfahren zur Verbesserung der Standardisierung und Reproduzierbarkeit.

Partielle Ischiasnervligatur: Ein Mausmodell für chronische neuropathische Schmerzen zur Untersuchung der antinozizeptiven Wirkung neuartiger Therapien

Eine chronische Einschnürungsverletzung des distalen Nervus infraorbitalis bei Mäusen führt zu Veränderungen des spontanen Verhaltens (erhöhte Aktivität bei der Gesichtspflege) und des nozifensiven Verhaltens als Reaktion auf taktile Stimulation (Überempfindlichkeit auf von-Frey-Haarstimulation), die Anzeichen von anhaltenden Schmerzen und Allodynie sind und als Modell für trigeminale neuropathische Schmerzen dienen.

Chronische Einschnürungsverletzung des distalen Nervus infraorbitalis (DIoN-CCI) bei Mäusen zur Untersuchung von trigeminalen neuropathischen Schmerzen

Dieses Protokoll stellt ein reproduzierbares Rattenmodell vor, das sensorische Nerven verwendet, um menschliche Neuromschmerzen nachzuahmen und chirurgische Behandlungen zu bewerten, und bietet ein wertvolles Werkzeug für die translationale Neuromforschung.

Neuartiges chirurgisches Nagetiermodell zur Untersuchung von Behandlungsmöglichkeiten für Neuromschmerzen mit gezielter Muskelreinnervation durch den Nervus saphenus

Erfahren Sie die Einrichtung eines Mausmodells für kleine Fasern-Neuropathie mit Resiniferatoxin. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Schmerzmechanismen und sensorischen Nervenverletzungen in vivo.

Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1 (Video) | JoVE Journal

Einrichtung ein Mausmodell eine reine kleine Faser Neuropathie mit Ultrapotent Agonisten von transienten Rezeptor Potential Vanilloid Typ 1

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