Name: Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Lernen Sie die manuelle Synthese von Oligo-peptoiden und deren Sequenzanalyse mittels Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht Einsteigern die Herstellung und Charakterisierung synthetischer Polymere im analytischen Labor.

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Die Autoren möchten Herr Michael Connolly und Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) für Technik-Support in Peptoid Synthese danken. Wir anerkennen die Unterstützung durch die National Science Foundation (CHE-1301505). In der Chemie Mass Spectrometry Einrichtung an der University of the Pacific wurden alle Massenspektrometrie Experimente durchgeführt.

(1) Synthese von Peptoid
Hinweis: Die Synthese beginnt mit Aktivierung der Harz durch Schwellung des Harzes und der Schutzgruppe entfernen. Danach wächst die Peptoid Kette an das Harz durch Monomer Zusatz Zyklen wiederholen. Die ersten Monomer, gekoppelt an das Harz ist der C-terminalen Rückstand. Die Peptoid ist aus dem C-Terminus an den N-Terminus länglich. Sobald die gewünschte Peptoid Sequenz erreicht ist, ist das Harz aus gespalten und das Peptoid Produkt gereinigt.
<ol><li>Vorbereitung der Reagenzien Hinweis: Die flüssige Reagenzien sind mit einer Mikropipette gemessen und die solide Reagenzien sind mit einer Analysenwaage gemessen.<ol>
<li>Mischen von 6,2 mL N, N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) und 43,8 mL N, N-Dimethylformamid (DMF), 0,8 M DIC/DMF Lösung vorzubereiten.</li>
		<li>Lösen Sie 5,56 g des BMA in 50,0 mL DMF, eine 0,8 M BMA/DMF-Lösung vorzubereiten.</li>
		<li>Mischen Sie 2 mL Piperidin (Pip) und 8 mL DMF, 20 % Pip/DMF Lösung zu erreichen.</li>
		<li>Auflösen von 1,9 mL der Npe in 13,1 mL DMF 1.0 zu erreichen M Npe/DMF.</li>
		<li>Auflösen von 1,3 mL Nme in 13,7 mL DMF 1.0 zu erreichen M Nme/DMF.</li>
		<li>Auflösen von 0,32 mL Nae in 2 mL DMF 1.0 erreichen M Nae/DMF. Achtung: Die meisten der in der Synthese verwendeten Chemikalien sind gefährlich. Trifluoroacetic Säure (TFA), DIC, Pip und BMA sind gefährlich für die Haut, Augen und Atemwege. DMF und Dichlormethan (DCM) sind Karzinogene verdächtigt. Alle Reaktionen in einem Abzug durchgeführt werden und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung sollte verwendet werden. Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) alle Chemikalien, die bei der Synthese verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Harz-Aktivierung
	<ol>
<li>Messen Sie, 84 mg Rink Amid Harz (Harz, 0,047 Mmol laden 0.56 Mmol/g) und einem 10 mL Polypropylen Festphasen-Reaktionsgefäß hinzufügen. Legen Sie den Kolben in das Gefäß.</li>
		<li>Das Reaktionsgefäß 2 mL DMF hinzu und verschließen Sie das Gefäß mit einem Druckverschluss. Stellen Sie das Gefäß in einen Shaker geben und schütteln Sie das Schiff bei Raumtemperatur in einem Winkel von Bewegung von ca. 12 Grad und 385 Schwingungen/min für 30 min. abtropfen lassen die Lösung zu einem Abfallbehälter durch Entfernen der Kappe und schieben den Kolben der den Reaktionsbehälter.</li>
		<li>Das Schiff 2 mL 20 % Pip/DMF-Lösung hinzu und verschließen Sie das Gefäß. Auf den Shaker für 2 min schütteln, und die Lösung für den Abfallbehälter entleeren.</li>
		<li>Das Schiff 2 mL 20 % Pip/DMF-Lösung hinzu, Kappe des Schiffes, und schütteln es bei Raumtemperatur für 12 min. Entfernen der Kappe und die Lösung für den Abfallbehälter entleeren.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz durch Zugabe von 1 mL DMF, das Gefäß verschließen und rühren das Schiff für 1 min. die Kappe abnehmen und entwässern die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz mit DMF für 4 weitere Male.</li>
	</ol></li>
	<li>Monomer Addition und N-terminale Acetylierung Hinweis: Jedes Monomer-Zusatz-Zyklus beinhaltet zwei Reaktionsschritte, Bromoacetylation und Vertreibung.<ol>
<li>Führen Sie die ersten Monomer Zusatz Zyklus zu bilden Nme-Harz.</li>
		<li>Führen Sie eine Bromoacetylation Reaktion. Mischen Sie 1 mL von 0,8 M BMA/DMF-Lösung und 1 mL von 0,8 M DIC/DMF-Lösung in ein Becherglas. Übertragen Sie die Mischung in einem Reaktionsgefäß mit Harz und verschließen Sie das Gefäß. Stellen Sie das Gefäß auf den Shaker und schütteln Sie es bei Raumtemperatur für 20 min. Entfernen der Kappe und entleeren Sie die Lösung für den Abfallbehälter.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz, indem 1 mL DMF, Deckelung des Schiffes, für 1 min rühren, und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen von 1 mL der DCM, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung. Waschen Sie das Harz mit DCM noch einmal und dann waschen Sie es mit DMF zweimal.</li>
		<li>Führen Sie eine Verschiebung Reaktion. Fügen Sie 1 mL 1,0 M Nme/DMF-Lösung, verschließen Sie das Gefäß, schütteln Sie dem Schiff bei Raumtemperatur für 60 min. Entfernen der Kappe und abtropfen lassen Sie die Lösung durch Drücken des Kolbens.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen 1 mL DMF, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz von Zeichnung in 1 mL DCM, agitieren für 1 min, und entleeren die Lösung. Waschen Sie DCM nochmals, gefolgt vom Waschen mit DMF zweimal.</li>
		<li>Wiederholen Sie Monomer Zusatz Zyklen von Schritten 1.3.2, 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4zu bilden-Harz. Wenn Sie den Schritt der Verschiebung Reaktion (1.3.4) wiederholen, verwenden Sie eine spezifische Amin Lösung entsprechend der Reihenfolge der Peptoid. Hinweis: Die Peptoid-Kette ist aus dem C-Terminus an den N-Terminus mit der C-terminalen Rückstand an das Harz gebunden länglich.</li>
		<li>Führen Sie N-terminale Acetylierung zu Ac-Nae-(Npe-Nme)4-Harz.</li>
		<li>Mix 92 µL des Essigsäureanhydrid, 43,5 µL von N, N-Diisopropylethylamine (DIPEA) und 2 mL DMF in ein Becherglas, ca. 2 mL der Acetylierung cocktail machen.</li>
		<li>Das Gefäß mit Harz fügen Sie 2 mL der Acetylierung cocktail hinzu, verschließen Sie das Gefäß und bei Raumtemperatur agitieren Sie, für 60 min. die Kappe abnehmen und entwässern die Lösung durch Drücken des Kolbens.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen 1 mL DMF, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen von 1 mL der DCM, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung. Wiederholen Sie waschen des Harzes mit DCM noch einmal, dann waschen mit DMF noch zweimal.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz von 1 mL der DCM hinzufügen, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Wiederholen Sie waschen mit DCM zweimal. Entfernen Sie den Deckel und lassen Sie das Harz in das Reaktionsgefäß für 10 Minuten an der Luft trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dekolleté und Reinigung
	<ol>
<li>Mischen Sie 3,8 mL TFA 100 µL Triisopropylsilane (Tipps) und 100 µL der HPLC-Klasse H2O in ein Becherglas zu 4 mL Spaltung cocktail.</li>
		<li>Fügen Sie 4 mL frisch Spaltung cocktail auf dem Gefäß mit Harz zubereitet, verschließen Sie das Gefäß und schütteln Sie es bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kappe und sammeln Sie die Filtrat Lösung in ein 50 mL Polypropylen Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 mL TFA auf das Schiff und cap sie agitieren für 1 min. sammeln das Filtrat-Lösung in der gleichen Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Verdunsten Sie TFA durch Einblasen in einem Strom von Stickstoffgas sanft bis etwa 1 mL Viskose Lösung übrig ist.</li>
		<li>Die restliche Lösung 15 mL Diethylether hinzu, die Zentrifuge Röhrchen, und in einem Gefrierschrank-20 ° C für 2 h über Nacht inkubieren. Die rohe Peptoid fällt als weißer Körper.</li>
		<li>Pellet-Volumenkörper mit einer Zentrifuge bei 4.427 x g für 10 min. Entfernen der Kappe die Zentrifugenröhrchen und dekantieren Diethylether in ein Becherglas sorgfältig ohne festen. Achtung: Diethylether ist eine brennbare organische Lösungsmittel. Bitte verwenden Sie eine sicheren Diethylether-Zentrifuge.</li>
		<li>Waschen der Volumenkörper durch Zugabe von 10 mL eiskaltes Diethylether in der Zentrifuge tube mit dem festen, Deckelung der Röhre, und platzieren es in der Zentrifuge. Durchführen Sie Zentrifugation bei 4.427 x g für 10 min. entfernen die Zentrifuge tube aus der Zentrifuge und dekantieren Diethylether in ein Becherglas sorgfältig ohne festen.</li>
		<li>Trocknen Sie das Solid durch sanft weht in einem Strom von Stickstoffgas.</li>
		<li>Fügen Sie 10 mL HPLC-Klasse H2O, getrockneten festen aufzulösen. Ein Nylon-Spritze-Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm die Lösung durchlaufen, und das Filtrat in ein Pre-gewichteten 50 mL Polypropylen Zentrifugenröhrchen sammeln.</li>
		<li>Schale fixieren die Lösung durch platzieren und drehen die Zentrifuge Rohr enthält, die die Peptoid-Lösung in einem 12-Unze-doppelt gestapelt erweiterte Polystyrol Espressotasse 1/3 mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Lyophilize Sie die gefrorenen Lösung über Nacht um solide Peptoid zu erbringen.</li>
		<li>Durch Auflösen der soliden Peptoid in 10 mL HPLC-Klasse H2O Lyophilisierung noch einmal zu wiederholen, Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lyophilisation Übernachtung shell. Die daraus resultierende Peptoid ist ausreichend für Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie rein.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS-Messungen und Sequenzanalyse
Hinweis: MS/MS-Experiment wird in einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung (ESI) durchgeführt. Datenerhebung erfolgt mithilfe der Datenerfassungs-Software mit dem Instrument begleitet. Das allgemeine Verfahren beinhaltet 1) die Durchführung der vollständigen Scan-Massenspektrometrie-Experiment und Aufnahme Massenspektrum, experimentieren (2) Durchführung der CID-MS/MS und Aufnahme der MS/MS-Spektrum, und (3) Vergleich der MS/MS spektralen Daten mit theoretischen Fragmentierung Schema Vorhersagen basierend auf das Strukturmerkmal der Peptoid.
<ol><li>Vorbereitung der Probenlösung
	<ol>
<li>1,0-2,0 mg feste Peptoid in einer 3-5 mL-Glasflasche abwiegen. Fügen Sie 1 mL gemischt Lösungsmittel von Acetonitril und Wasser (ACN/H2O, 1:1, V/V), um die Peptoid zu lösen. Dadurch werden die Lager Probenlösung mit einer Konzentration von etwa 10-3 M.</li>
		<li>20 µL der Stammlösung in eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 1 mL gemischt Lösungsmittel von ACN/H2O zu eine verdünnten Probenlösung von ca. 10-5 M ergeben.</li>
		<li>Entfernen Sie alle mögliche unlösliche Partikel in der verdünnten Probenlösung durch Zentrifugation bei 4.427 x g ausführen, für 3 min. Transfer ca. 700 µL der obere Teil der Lösung in einem anderen 1,5 mL Zentrifuge Rohr zu Peptoid MS funktionierende Lösung mit Konzentration von etwa 10-5 M.</li>
		<li>Passen Sie die Konzentration der MS funktionierende Lösung basierend auf die beobachteten Signalintensität während Massenspektrometrie Messungen.</li>
		<li>Eine alternative Möglichkeit, alle möglichen unlösliche Partikel in der verdünnten Probenlösung zu entfernen ist ein 0,20 µm Spritze Filter die Beispiellösung durchlaufen und das Filtrat in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen Peptoid MS Arbeitslösung von etwa 10-5 zu sammeln M.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufzeichnung von Massenspektren
	<ol>
<li>Der Elektrospray-Ionisation (ESI) Quelle durchlaufen Sie gemischte Lösungsmittel von ACN/H2O (1:1, V/V), und richten Sie das Instrument in einem standard positive Ionen, vollständiger Scan Massenspektrometrie Modus mit einer Masse-Ladungs-Verhältnis (m/Z) Reihe von 100-1500. Hinweis: Typische Betriebsparameter: ESI-Nadel-Spannung, 5 kV Kapillare Spannung, 40 V Gas (Stickstoff) Trocknungstemperatur, 200 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie ca. 300 µL Arbeitslösung Peptoid MS (ca. 10-5 M) in 500 µL oder eine 1 mL Spritze und schließen Sie die Spritze mit dem ESI-Einlass mit Kapillare Polyether Ether-Keton (PEEK)-Schläuche. Legen Sie die Spritze auf die Spritzenpumpe und die Durchflussmenge in 10 µL/min auf die Beispiellösung verleihen dem ESI-Einlass.</li>
		<li>Schalten Sie die ESI-Nadel-Spannung um den ESI zu aktivieren, und dann auf den Detektor. Stellen Sie die Anzeige im Profilmodus und m/Z-Bereich von 100-1500. Ein Massenspektrum Profil, im Fenster "Profil" angezeigt. Der Peak bei m/Z 1.265 (dargestellt von 1,264.6 m/Z) entspricht die Peptoid Ion oder protonierten Peptoid.</li>
		<li>Notieren Sie die MS-Spektrum für 2 min. Verwenden Sie in das Fenster"Methoden" 2 min als die "Laufzeit". Öffnen Sie das Aufnahmefenster und füllen in einem richtigen Dateinamen und das Spektrum Aufnahme starten. Hinweis: Die resultierende Massenspektrum ist in Abbildung 3dargestellt.</li>
		<li>Optimieren Sie die Intensität des Peaks bei m/Z von 1.265. 1.150-1.350 m/Z-Bereich gesetzt und passen Sie die Kapillare Spannung beim Betrachten der Peak-Intensität in mV im Fenster "Profil" angezeigt. Beispielsweise erhöhen die Kapillare Spannung bis 50 V oder höher und zeigen die Veränderung der Peak-Intensität. Die optimale Peak-Intensität ist um 150-200 mV. Hinweis: Die Kapillare Spannung einstellen kann die Fülle an bestimmte Ionen wesentlich ändern. Erhöhung der Kapillaren Spannung kann die Intensität des Peptoid Ions verbessern. Allerdings kann eine Kapillare Hochspannung auch Dissoziation des Peptoid Ions in der Ionenquelle zu induzieren und verringern Sie die beobachteten Intensität. Einstellung der Temperatur des Trocknens Gas kann die Intensität des Peaks bei m/Z 1.265 erhöhen, aber es ist weniger wirksam als die Kapillare Spannung einstellen. Wenn der Peak bei m/Z 1.265 nicht die optimale Intensität erreicht, passen Sie die Probe Konzentration (oder beispielsweise verdoppeln die Konzentration von MS funktionierende Lösung).</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät in den MS/MS-Modus. Festlegen des Vorläufer-Ions bei m/Z 1.265 und MS/MS Masse Bereich bei m/Z 100-1400. Im Methode Fenster"," m/Z 1.265 als "Q1 Primiz" verwenden und "Q1 letzte Messe" leer lassen. Verwenden Sie m/Z 100 als "Q3 Primiz" und m/Z 1.400 als "Q3 letzten Messe." Hinweis: Im MS/MS-Modus die ersten Quadrupol Einheit (Q1) Funktionen wie einem Massenfilter, Peptoid Ion als der Vorläufer-Ion zu isolieren ist die zweite Quadrupol-Einheit (Q2) eine Kollision-Zelle und die dritte Quadrupol (Q3) arbeitet als eine Masse Analysator.</li>
		<li>Satz der Aufprallenergie bei 40 eV und der Kollision Gas (Argon, in diesem Fall) auf 1,5 mTorr Druck.</li>
		<li>Ein Massenspektrum Profil, im Fenster "Profil" angezeigt. Der Peak bei von 1.265 m/Z entspricht des Peptoid Ions, und die Spitzen mit niedrigeren m/Z-Werte repräsentieren die Fragmente aus der Peptoid Ion.</li>
		<li>Passen Sie die Aufprallenergie um die Anzeige des Spektrums Fragmentierung zu optimieren. Zum Beispiel erhöhen Sie die Aufprallenergie auf 45 eV und zeigen Sie die Änderung des Profils Spektrum an. Hinweis: erhöhen die Aufprallenergie im Allgemeinen verbessern die Fülle der Fragment-Ionen werden und reduziert die Fülle des Peptoid-Ions. Erhöhung des Kollision Gasdrucks erhöht auch die Fülle der Fragment-Ionen. Achtung: Nicht erhöhen Sie die Kollision Gasdruck über 2 mTorr.</li>
		<li>MS/MS-Spektrum für 2 min aufnehmen. Verwenden Sie 2 min in Methode Fenster"," als die "Laufzeit". Öffnen Sie das Aufnahmefenster und füllen in einem richtigen Dateinamen und das Spektrum Aufnahme starten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Aufnahme von 1 - 2 Mal.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid-Sequenzanalyse Hinweis: Unter der Bedingung der CID, würde das Peptoid Ion an die Amid-Bindungen entlang der Peptoid Rückgrat, eine Reihe von N-terminale Fragmente genannt B-Ionen und eine Reihe von C-terminale Fragmente genannt Y-Ionen zu produzieren fragment<ol>
<li>Die chemische Struktur der Schimmelpilzschäden Peptoid indem der N-Terminus auf der linken Seite und dem C-Terminus auf der rechten Seite zeichnen Sie, und zeichnen Sie eine gestrichelte Linie auf jede Amid-Bindung, eine Fragmentierung Schema zu generieren, wie in Abbildung 2agezeigt. Zeichnen Sie ein Proton mit einem gestrichelten Kreis an der Ladungsträger. Ausgehend von der linken Seite der Struktur, platzieren Sie Beschriftungen auf die gestrichelten Linien um die N-terminale Fragmente als B1, B2, B8anzugeben. Ausgehend von der rechten Seite, platzieren Sie Beschriftungen auf die gestrichelten Linien um die C-terminale Fragmente als Y1Y2, Y8anzugeben. Hinweis: Eine chemische Zeichnung Software kann genutzt werden, um die Peptoid-Struktur zu zeichnen.</li>
		<li>Stellen Sie Fragmentierung bei der 4th Amid-Bindung von der linken Seite vor, und zeichnen Sie die Strukturen der N-terminale Fragment und das C-terminale Fragment mit richtigen formalen Gebühren, wie in Abbildung 2 bdargestellt. Platzieren Sie die Beschriftung der B4 auf das N-terminale Fragment, und die Bezeichnung des Y5 auf das C-terminale Fragment. Berechnen Sie den m/Z-Wert von B4 durch Aufsummieren der nominalen Massen der Elemente in der Struktur zu einem Wert von 580 und das N-terminale Fragment setzen Sie m/Z 580 auf. Berechnen Sie den m/Z-Wert von Y5 und das C-terminale Fragment setzen Sie m/Z 685 auf.</li>
		<li>Berechnen Sie die m/Z-Werte für alle acht B-Ionen und alle acht Y-Ionen, und montieren sie in einer Tabelle, wie in Tabelle 1dargestellt. Hinweis: Die m/Z-Werte der Fragmente können mit Hilfe einer Chemikalie Zeichnung Software berechnet werden.</li>
		<li>Öffnen Sie das aufgezeichnete MS/MS-Spektrum der die Peptoid mit den Daten-Review-Software mit dem Instrument begleitet. Legen Sie die Beschriftung Einstellungen für "Show Ionen-Labels" und Label-Schwelle auf 3 %. Dies erzeugt ein MS/MS-Spektrum mit m/Z-Werten beschriftet auf den Gipfeln.</li>
		<li>Exportieren Sie die MS/MS spektrale Daten als Textdatei im CSV-format und das Spektrum mit Datenverarbeitungs-Software zu rekonstruieren. M/Z-Werte auf den Gipfeln zu platzieren. Das daraus resultierende MS/MS-Spektrum ist in Abbildung 4dargestellt. Hinweis: Einige Massenspektrometer Datenverarbeitungs-Software in der Lage, verfügen über für die Generierung der MS/MS-Spektrum. In diesem Fall ist es nicht notwendig, die MS/MS spektralen Daten exportieren.</li>
		<li>Ordnen Sie die m/Z-Werte gezeigt, auf dem MS/MS-Spektrum zur Ermittlung der entsprechende B und Y-Ionen in Tabelle 1 gezeigt. Beispielsweise wird der Peak bei m/Z 580 identifiziert als B-4-Ionen und m/Z 685 ist identifiziert als die Y-5-Ion. Beschriften Sie die Spitzen mit entsprechenden B und Y Symbole auf dem Spektrum, wie in Abbildung 4dargestellt.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein Nonamer Peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hat unter Verwendung des Protokolls präsentiert synthetisiert. Die Synthese-Apparat beinhaltet eine Spritze wie Polypropylen Festphasen-Reaktionsgefäß und einem mechanischen Schüttler. Die Reaktionsgefäße sind kommerziell verfügbar und kostengünstig. Einem mechanischen Schüttler ist ein gemeinsamen Apparat in Chemie-Laboratorien. Mithilfe einer Spritze wie Reaktionsgefäß werden Lösungen hineingezogen und das Schiff durch manuelles Verschieben des Kolbens v...

Peptoids sind eine Klasse von Sequenz-gesteuerte Polymere mit Rückgrat Strukturen imitiert die Struktur von Peptiden. Peptoids können aus verschiedenen Aminen synthetisiert werden, ermöglicht Peptoids, höchst abstimmbaren Eigenschaften1,2auszustellen. Peptoids wurden als molekulare Modelle für biophysikalische Forschung, als Therapeutika und konzipiert als Liganden für Proteine3,4,5,6verwendet. Peptoids wurden in einer Vielzahl von biologisch aktiven Verbindungen, wie z. B. Anti-fouling und Antikörper-mimetischen Materialien, antimikrobielle Wirkstoffe und Enzym-Inhibitoren7,8,9entwickelt. Mit einer sehr geordnet und abstimmbaren Natur haben Peptoids auch als eine Art von molekularen Informationen Speicher10gedacht. Die Entdeckung dieser vielfältigen Anwendungen erfordert die Entwicklung von effizienten Analysemethoden zur Charakterisierung der Sequenzablaufs und Struktur des Peptoids. Tandem mass Spectrometry-basierte Techniken haben Versprechen als die Methode der Wahl für die Analyse der Sequenz Eigenschaften der Sequenz-gesteuerte Polymere, einschließlich Peptoids11,12,13gezeigt, 14,15. Jedoch systematische Studien korrelieren die Peptoid Ion Fragmentierung Muster aus mass Spectrometry Studien und die Strukturinformationen von Peptoids sind sehr begrenzt.
Peptoids können leicht mit einem festen Phase Verfahren synthetisiert werden. Die gut entwickelte Methode beinhaltet eine Iteration einer zweistufigen Monomer Zusatz Zyklus16,17. In jedem Zyklus zusätzlich ein Harz-gebundene Amin ist durch eine Halogenessigsäuren Säure (in der Regel Bromoacetic Säure, BMA) acetyliert, und dies ist gefolgt von einer Versetzung Reaktion mit ein primäres Amin. Obwohl automatisierte Synthese Protokolle für Peptoid Synthese routinemäßig angewendet wurden, können Peptoids manuell mit sehr guten Ausbeuten in einem standard Chemie Labor16,18,19, synthetisiert werden 20.
Unser Labor hat hat die Methode der manuellen Peptoid Synthese und vereinfacht das Gerät in die bestehenden Methoden verwendet. Wir haben vorher die Fragmentierung Muster aus einer Reihe von Peptoids mit MS/MS Techniken21,22,23studiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Peptoids charakteristische Fragmentierungen produzieren, wenn sie einer Kollision-induzierte Dissoziation (CID)21,23 unterliegen oder Elektroneneinfang Dissoziation (ECD)22 Experimente. In diesem Artikel zeigen wir wie Oligo-Peptoids in einem standard Chemielabor synthetisiert werden kann, wie mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer CID-Experimente durchführen und wie die spektralen Daten analysieren. Die Peptoid synthetisiert und charakterisiert ist ein Nonamer mit N-terminale Acetylierung und C-terminalen Amidierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Die Struktur der Peptoid ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>ESI-Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>Das Massenspektrometer wurde von Varian, Inc. erworben.</td></tr><tr><td>Varian MS Workstation, Version 6.9.2, eine Software zur Datenerfassung und Datenüberprüfung</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>Die Software ist Teil des Varian 320L-Pakets</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Handgelenk-Action-Shaker, Modell 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle-Zentrifuge, Modell Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Festphasenreaktionsbehälter, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Druckkappen für Reaktionsgefäße</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter, Porengröße 0,2 & mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter, Porengröße 0,45 & mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Zentrifugenzieher, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Zentrifugenzieher, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft ist jetzt Teil von PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styropor-Becher, 12 Unzen</td><td>Gemeinsamer Supermarkt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinsamidharz</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Hochgiftig</td></tr><tr><td>N, N'-Diisopropylcarbodiimid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Hochgiftig</td></tr><tr><td>Bromacessigsäure</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Hochgiftig</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamin</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamin</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-Ethylendiamin</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-Dimethylformamid</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Weitere Destillation vor der Verwendung</td></tr><tr><td>N, N-Diisopropylethylamin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilan</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Hochgiftig</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Akademisches Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>Zur Gewinnung von HPLC-Qualitätswasser</td></tr><tr><td>HPLC-Qualitätswasser</td><td></td><td></td><td>Produziert von Millipore MILLI-Q&reg; Akademisches Wasseraufbereitungssystem</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC-Grad</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC-Grad</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Weitere Destillation vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Dichloromethan</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Weitere Destillation vor der Verwendung</td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>Fresno Sauerstoff/Barnes Versorgung</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultrahohe Reinheit, 99,9995 %</td></tr><tr><td>Argongas</td><td>Fresno Sauerstoff/Barnes Versorgung</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultrahohe Reinheit, 99,9995 %</td></tr></tbody></table>

synthese- und massenspektrometrie der oligo-peptoids

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids sind Sequenz-gesteuerte Peptid imitiert Oligomere bestehend aus N-alkyliert Glycin Einheiten. Unter vielen möglichen Anwendungen haben Peptoids als eine Art molekulare Informationsspeicherung gedacht. Massenspektrometrie-Analyse ist die Methode der Wahl für die Sequenzierung Peptoids betrachtet worden. Peptoids können über feste Phase Chemie mit einer sich wiederholenden zweistufigen Reaktionszyklus synthetisiert werden. Hier präsentieren wir eine Methode, Oligo-Peptoids manuell zu synthetisieren und die Reihenfolge der Peptoids mit Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) Techniken zu analysieren. Die Probe Peptoid ist ein Nonamer bestehend aus abwechselnd N-(2-Methyloxyethyl) Glycin (Nme) und N-(2-Phenyl) Glycin (Npe) sowie eine N-(2-Aminoethyl) Glycin (Nae) am N-Terminus. Die Sequenz-Formel von der Peptoid ist Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, wo Ac die Acetyl-Gruppe. Die Synthese erfolgt in einem handelsüblichen Festphasen-Reaktionsgefäß. Die Eisbahn Amid Harz dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem Amid-Gruppe am C-Terminus zu erzielen. Das resultierende Peptoid Produkt unterliegt Sequenzanalyse mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung Quelle. Die MS/MS-Messung erzeugt ein Spektrum der Fragment-Ionen aus der Dissoziation des geladenen Peptoid. Der Fragment-Ionen sind je nach den Werten ihrer Masse-Ladungs-Verhältnis (m/Z) sortiert. Die m/Z-Werte der Fragment-Ionen werden gegen die nominalen Massen der theoretisch vorhergesagten Fragment-Ionen, nach dem Schema der Peptoid Fragmentierung verglichen. Die Analyse erzeugt eine Fragmentierung Muster der geladenen Peptoid. Die Fragmentierung Muster ist der Monomer-Reihenfolge der neutralen Peptoid korreliert. In diesem Zusammenhang liest MS-Analyse die Sequenzinformation von der Peptoids.

Die Struktur von einem 9-Mer Peptoid mit N-terminale Acetylierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, ist in Abbildung 1dargestellt. Die Peptoid wurde manuell in einem fritted Polypropylen Reaktionsgefäß über Festphase Ansatz synthetisiert. Eisbahn Amid Harz (0,047 Mmol, 84 mg mit be-0.56 Mmol/g) dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem niedrigmethylierte C-Terminus zu erzielen. Die Peptoid-Kette ist durch mehrere Zyklen von Monomer Z...

Ein Protokoll wird für die manuelle Synthese von Oligo-Peptoids gefolgt von Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie beschrieben.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie man Oligo-Peptoide manuell synthetisiert und wie man deren Monomersequenz mittels Massenspektrometrietechniken analysiert. Die Methode kann Anfängern helfen, Schlüsselfragen in einem Peptoidfeld zu beantworten, wie zum Beispiel wie man Peptoide herstellt und wie man deren Monomersequenz charakterisiert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Peptoide mit speziellen Monomerresten im Standardlabor der analytischen Chemie synthetisiert und analysiert werden können.Obwohl sich diese Methode auf Oligo-Peptoide konzentriert, kann sie auch auf andere Systeme wie Peptide und Oligo-Nukleotide angewendet werden. Im Allgemeinen haben Neulinge dieser Technik Schwierigkeiten, da optimale Massenspektrometriebedingungen ohne visuelle Demonstration schwierig sind. Wir hatten die Idee für diese Methode, als wir die strukturellen Merkmale von Peptoiden mit Tandem-Massenspektrometriemethoden charakterisieren wollten.Zuerst wiegen Sie 84 Milligramm Rink-Amidharz ab und geben Sie es in ein 10-Milliliter-Polypropylen-Festphasenreaktionsgefäß. Dann setzen Sie einen Kolben in das Gefäß ein. Anschließend gibt man zwei Milli

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Eine schnelle Art und Weise beschrieben, Einblicke in die Struktur der Polysaccharide in einer extrazellulären Matrix zu gewinnen. Die Methode nutzt die Spezifität von Glykosylhydrolasen und die Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht winzige Mengen von Materialien analysiert werden. Diese Technik ist anpassungsfähig, um direkt auf das Gewebe selbst verwendet werden.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine ​​liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Eine einfache und allgemeine manuelle Peptoid Syntheseverfahren mit Grundausstattung und kommerziell erhältlichen Reagenzien beschrieben, so dass Peptoide problemlos in den meisten Labors synthetisiert werden. Die Synthese, Reinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptoid 36mer beschrieben, sowie deren Selbstorganisation zu hoch geordneten Nanoschichten.

Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Peptid tertiäre Amide (PTA) sind eine Superfamilie von Peptidmimetika umfassen, sind aber nicht auf Peptide, Peptoide und N-methylierten Peptide beschränkt. Hier beschreiben wir eine Synthesemethode, die sowohl Split-and-Pool-und Sub-Monomer-Strategien kombiniert, um eine ein-Bead-one-Verbindung Bibliothek von PTAs synthetisieren.

Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Festkörper-Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und die Festkörper-Photolytische Markierungs-Massenspektrometrie (ssPL-MS) für Proteine in festen Pulvern. Die Methoden liefern hochauflösende Informationen über die Proteinkonformation und -wechselwirkungen im amorphen Festkörper, die für das Formulierungsdesign nützlich sein können.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken, die für die strukturelle Charakterisierung von Glykosylsequenz(en) im reduzierenden Endbereich (RE) und Glykosylsequenz(en) im internen Bereich von Heteroxylanen verwendet werden, indem das RE vor der enzymatischen Hydrolyse (Endoxylanase) mit 2 Aminobenzamid markiert und dann die resultierenden Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)  analysiert werden.

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Dieser Artikel liefert ein detailliertes Verfahren zur Festphasensynthese, -reinigung und -charakterisierung von an der C2'- O- Position modifizierten Dodecamern von RNA. UV-vis- und zirkuläre Dichroismus-photometrische Analysen dienen zur Quantifizierung und Charakterisierung von Strukturaspekten, dh Einzelsträngen oder Doppelsträngen.

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Ein Protokoll wird für die Synthese von informationscodierten Peptoid-Oligomeren und für die sequenzgesteuerte Selbstmontage dieser Peptoide in molekulare Leitern unter Verwendung von Ainen und Aldehyden als dynamische kovalente Reaktantenpaare und Lewis-saure Seltenerd- Metalltriflate als Mehrzweckreagenzien.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Dieses Protokoll beschreibt einen iSCAT-basierten Bildverarbeitungs- und Einzelpartikel-Tracking-Ansatz, der die gleichzeitige Untersuchung der Molekülmasse und des diffusiven Verhaltens von Makromolekülen ermöglicht, die mit Lipidmembranen interagieren. Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Probenvorbereitung, die Konvertierung von Masse in Kontrast, die Filmaufnahme und die Nachbearbeitung werden zusammen mit Anweisungen bereitgestellt, um mögliche Fallstricke zu vermeiden.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Oligonukleotid-5′-Triphosphate sind allgegenwärtige Bestandteile in essentiellen biologischen Signalwegen und werden zunehmend in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Hier beschreiben wir Techniken zur routinemäßigen Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotid-5′-Triphosphaten, ausgehend von Oligonukleotiden, die durch automatisierte Standardsynthesetechniken hergestellt werden.

Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden

Lernen Sie die manuelle Synthese von Oligo-peptoiden und deren Sequenzanalyse mittels Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht Einsteigern die Herstellung und Charakterisierung synthetischer Polymere im analytischen Labor.

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

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