Name: Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Lernen Sie die Isolierung, Fixierung und Immunfärbung von 3D-Darmorganoiden mit Formaldehyd-Methanol zur Erhaltung der Architektur und Antigenität für die Zellbiologie.

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Die Autoren danken Paul Thomas für Mikroskop-Beratung und Unterstützung. Dieses hier wurde unterstützt durch die BBSRC (keine zu gewähren. BB/J009040/1, M.M.M. und t.w.).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
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<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
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<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
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<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Isolierung von Darmgewebe Isolierung der kleinen Darm Krypten und Zotten und Kolon Krypten beinhaltet Freilegung der Schleimhautoberfläche, Behandlung mit EDTA Lösung Zellkontakte, Fraktionierung (schütteln) und Zentrifugation lösen. Die vorgestellten intestinalen Darmzotten/Krypta Isolierung Protokoll wurde von Belshaw Et Al. und Whitehead Et Al. modifiziert 17 , 18
Verfügbarmachen der Schleimhautoberfläche Wir haben mit einer Reihe von Ansätzen, die Schleimhautoberfläche des Verdauungstraktes bei der Entwicklung dieses Verfahrens aussetzen experimentiert. Ein klassischer Ansatz soll evert (innen nach außen drehen) das Rohr, in der Regel in Segmente ca. 100 mm lang, mit einem Metallstab, der in einer Falte des Gewebes an einem Ende und dann die restlichen Röhre gefangen ist glitt über die u-19. Für Maus Gewebe eignet sich ein Metallstab (2,4 mm Durchmesser) mit abgerundeten Enden. Dieser Ansatz hat den Vorteil der Schleimhautoberfläche ermöglicht besseren Zugang zu PBS und EDTA zu erweitern. Wir hatten ursprünglich verwendet diesen Ansatz aber zog in die Röhre in kurzen Längen (ca. 5 cm) schneiden und öffnen jeden Abschnitt mit Präparierscheren, wie dies erwies sich einfacher als. Diese Methode eignet sich, wenn nur wenige Darm erforderlich sind; aber wenn mehr Tiere werden in einem Experiment dann ein speziell gebaute Gerät verwendet für aufschneiden das Rohr längs, wie von Yoneda Et Al. beschrieben 14 wäre effizienter.
Ablösung der Zotten und Krypten von der Muskelschicht Zunächst haben wir 3 mM EDTA in PBS und relativ langen Inkubationszeiten von bis zu 60 min um der Schleimhautoberfläche aus den zugrunde liegenden Gewebe17,18zu lösen. Bei dieser Konzentration von EDTA fanden wir eine Inkubationszeit von 30 min ausreichend, Krypten von Maus Colon zu lösen war. Jedoch für die kleinen Darm Krypta/Villus Isolierung haben wir versucht, mit konzentrierter EDTA für eine kürzere Zeit, die einen effizienten Ansatz erwiesen. Alle nachfolgenden Arbeiten erfolgte mit Gewebe extrahiert, mit der 30 mM-EDTA-Technik Generierung von relevanten Fraktionen für Zotten und Krypten. Für Krypten wir gebündelt normalerweise 3-5 Fraktionen vor der Befestigung, aber es ist wichtig zu prüfen, ob diese die entsprechenden Fraktionen sind, wie die Zeiten eine Reihe von Faktoren wie z. B. Position entlang den Darm-Trakt, Alter der Maus, Entzündung, vorherige Diät hängen , etc. in ähnlicher Weise kann die Länge der Zeit, die das Gewebe muss im Anschluss an die EDTA Behandlung effektiv zu geschüttelt werden unter verschiedenen Bedingungen variieren. Das Ergebnis ist isolierte Gewebe Brüche mit einer Mischung aus Zotten und Krypten oder hauptsächlich Zotten oder Krypten (Abbildung 2). Da gibt es keine Zotten im Dickdarm, die Krypta-Extraktion kann erreichbar in einem Schritt durch Schütteln des Gewebes in der Röhre für 30 s. Diese Fraktionen können dann fixiert und für Immuno-Kennzeichnung verarbeitet werden.
Isolierung der intestinalen Organellen von Keller-matrix Isolierung der Organellen von Keller Matrix Domes kann mithilfe von Zelle-Recovery-Lösung erreicht werden. Die Lösung funktioniert, indem depolymerizing die gelierte Keller-Matrix, sondern die Temperatur um 2 bis 8 ° c betragen. Ein Wort der Warnung ist, dass dynamische Mikrotubuli nicht beibehalten werden können. Also, für Immuno-Kennzeichnung von dynamischen Mikrotubuli und + Tipps, wie die EBs-Zelle, Erholung von Keller-Matrix vor der Fixierung ist nicht zu empfehlen. Jedoch die meisten der Mikrotubuli in den differenzierenden organoide Zellen sind relativ stabil und diese blieben (Abbildung 6). Es funktionierte auch gut für Immuno-Kennzeichnung von centrosomal und Knoten Proteine sowie Zellenmarkierungen.
Fixierung-Protokolle Formaldehyd (frisch hergestellt aus PFA) ist ein relativ schnell wirkende Fixiermittel, die reversible Formen Vernetzungen und 4 % PFA eignet sich gut für z.B. in Immuno-Kennzeichnung Mikrotubuli und Gamma-Tubulin und Färbung Actinfilamente mit Phalloidin. Mehr verdünnen PFA Lösungen wie 1 % funktionierte gut für Immuno-Beschriftung z. B. mit der Stammzell-Marker Lgr5 und Paneth Zelle Marker CD24 innerhalb der Krypta Stammzellnische, während höhere Konzentrationen von PFA nicht funktioniert hat.
Der Zusatz von Glutaraldehyd gibt bessere Konservierung von Mikrotubuli und die so genannte PHEMO Fixierung besteht aus einer Mischung von 3,7 % PFA, 0,05 % Glutaraldehyd und 0,5 % Waschmittel in PHEMO Puffer (68-mM-Rohre, 25 mM HEPES, EGTA 15 mM und 3 mM MgCl2)2 bietet ausgezeichnete Erhaltungszustand der Mikrotubuli ohne Antigenität. Es funktioniert auch gut für Immuno-Kennzeichnung Gamma-Tubulin, β-Catenin und E-Cadherin und Färbung Actinfilamente mit Phalloidin. Jedoch in 3D Gewebe und organoide Kulturen, die PHEMO Fixierung inkonsistente Ergebnisse produziert und wurde deshalb nicht verwendet.
Methanol ist ein Gerinnungsmittel Fixiermittel, das relativ gute Penetration und tendenziell Antigenität zu bewahren. Fixierung mit 100 % Methanol (-20 ° C) führt einige Schrumpfung, gibt moderate Morphologie Erhaltung und arbeitet für Mikrotubuli, + Tipps und viele centrosomal Antikörper einschließlich Ninein in 2D Zellkulturen. Jedoch brach einige Organellen bei Verwendung dieser Methode der Fixierung. Darüber hinaus Eindringen von Antikörpern durch gesamte Krypten, Zotten oder Organellen war zunächst ein Problem aber die Zugabe von 0,1 % Waschmittel der Waschlösung und längeren waschen bessere Ergebnisse erzielt.
Eine Kombination von Formaldehyd und Methanol hatte früher von Rogers Et al. 20 , Immuno-Label EB1 in Drosophila. Eine Fixierung-Protokoll basiert auf einer Mischung aus Formaldehyd und Methanol wurde daher für Darmgewebe und Organellen basierend auf 3 % Formaldehyd und 97 % Methanol,-20 ° C gekühlt, aber weglassen der 5 mM Natriumcarbonat aus der Mischung, die von Rogers verwendet wurde Et Al. 20 Außerdem wurden Proben in der Tiefkühltruhe bei-20 ° c fixiert Dies funktioniert besonders gut für Immuno-Kennzeichnung + Tipps, wie CLIP-170 und der EBs, sondern erwies sich auch hervorragend für die Befestigung und Immuno-Kennzeichnung Mikrotubuli und Aktin in Gewebe und 3D Organellen. Sehr guter baulicher Erhaltung zeigte und Antigenität blieb für mehrere Zellskelett und assoziierte Proteine sowie centrosomal Proteine wie Gamma-Tubulin und Ninein, obwohl Kennzeichnung für Ninein konsequenter mit Methanol gearbeitet. Fixierung.

Bildung von Epithelien mit Apico-basale Polarität ist ein fundamentaler Prozess in der Entwicklung und beinhaltet eine dramatische Reorganisation von Mikrotubuli und centrosomal Proteine. Eine radiale Mikrotubuli Array ausgehend von einer zentral gelegenen centrosomal Mikrotubuli Organisation Zentrum (MTOC) ist prominent in vielen tierischen Zellen, und das ist gut geeignet für relativ flache Zellen. Im Gegensatz dazu montieren säulenartige Epithelzellen, wie diejenigen des Darms, nicht Radial transzelluläre Mikrotubuli-Arrays, die die Form und die spezielle Funktionen dieser Zellen besser zu unterstützen. Diese dramatische Reorganisation der Mikrotubuli wird durch den Umzug in die Spitze und apikalen nicht centrosomal MTOCs (n-MTOCs) bilden, Centrosome erreicht, die verantwortlich für die Verankerung des transzelluläre Mikrotubuli1,2 , 3 , 4 , 5.
Ein Großteil unseres Wissens über epithelialen Differenzierung und der damit verbundenen Mikrotubuli Reorganisation kommt aus Untersuchungen von 2D in Vitro Zellschichten, die die Gewebearchitektur in Vivo nicht angezeigt werden. Entwicklung von 3D in Vitro organoide Kulturen, vorangegangen durch Clevers und Kollegen6, stellt einen großen technologischen Fortschritt dar, wie sie in Vivo Architektur und Entwicklung imitieren. Eine Hierarchie der epithelialen Differenzierung spiegelt sich im Darm; Stammzellen am unteren Krypten geben Anlass zu unreif Transit verstärkt Zellen, die sich vermehren und allmählich zu unterscheiden, da sie die Gruft auf dem kleinen Darm Villus oder Kolon Oberfläche wandern wo sie vollständig vor unterschieden werden Schuppen Sie in das Lumen-7. Wichtig ist, ist dies im Darm Organellen repliziert, wo Zellen aus der Stammzellnische bildende Zysten wuchern, die anschließend Krypta-wie Knospen mit Stammzellen an der Unterseite und Differenzierung allmählich Fortschritte auf dem Weg der Zyste Region erzeugen, die Villus-wie8wird. Der Darm organoide stellt daher ein leistungsfähiges Modell, nicht nur Mikrotubuli und centrosomal Reorganisation bei epithelialen Differenzierung aber zahlreiche andere Proteine, sowie bietet eine ideale Plattform für das Screening von Medikamenten und Lebensmitteln zu studieren Verbindungen des therapeutischen Potentials nutzen9,10.
Organellen sind gut geeignet für live-Aufnahmen von Leuchtstoff-markierten Proteine und beide Knock-in und Knock Out Organellen mit CRISPR/Cas9 gen11,12Bearbeitung erzeugt werden können. Jedoch ist es wichtig, vor allem um das Verhalten der tagged Proteine überprüfen, zur Gründung der Ausdruck und die Lokalisierung der körpereigene Proteine untersucht werden. Immuno-Beschriftung 3D Organellen gewachsen in Keller Matrix oder Ex Vivo isolierte Gewebe ist komplexer als Zellen in Kultur Gerichte in 2D angebaut. Die Fixierung-Protokoll muss die zarte 3D Architektur der Organellen zu erhalten Beibehaltung noch Antikörper Antigenität (d.h. die Epitope für die Bindung von Antikörpern). Beispielsweise 4 % Paraformaldehyd (PFA) wird allgemein als ein Fixiermittel verwendet, aber während es ein relativ schnelles Handeln Fixiermittel ist und guten morphologische Erhaltung gibt, nach unserer Erfahrung es häufig führt zu Verlust der Antigenität und eignet sich nicht für viele centrosomal Antikörper. Die Fähigkeit von Fixativ und Antikörpern 3D Strukturen und Gewebe eindringen sollte auch berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck haben wir modifiziert und entwickelten Protokolle für Gewebe isoliert und indirekte Immuno-Kennzeichnung der 3D in Vitro Organellen und Ex Vivo isoliert Darmgewebe. Wir beschreiben, wie kleine Darm Krypten und Zotten und Kolon Gewebe zu isolieren, und beinhalten ein Protokoll für die Isolierung von 3D Organellen als Alternative zur Festsetzung und Immuno-Kennzeichnung innerhalb der Keller-Matrix. Wir präsentieren Ihnen drei Alternativen Fixierung-Protokolle für die Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli und centrosomal, wie Ninein, und Mikrotubuli Plus-Ende Tracking-Proteine (+ Tipps), wie die EB Proteine und CLIP-170 (siehe auch Referenzen8, 13). Wir diskutieren auch die vor- und Nachteile jedes Protokoll zugeordnet.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>Wasch- und PFA-Zellrückgewinnungslösung</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Isolierung von Organoiden</td></tr><tr><td>Lobind Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>Verhinderung des Anhaften von Zellen</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA-Lösung, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Crypt-Isolierung</td></tr><tr><td>70 &mu; m-Zell-Sieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Isoliert Krypten aus Zotten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergens</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>Blockierungsmittel</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>als Antihaftmittel</td></tr><tr><td>verwendet Paraformaldehyd, 4% in PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung (36,5&ndash; 38 % in H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>als Fixiermittel</td></tr><tr><td>Methanol 99,9 % Fisher</td><td></td><td>M/4000/17</td> in analytischer Qualität <td>als Fixiermittel MaxFluor</td></tr><tr><td>Maus auf Maus Immunfluoreszenz-Detektionskit</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>kommerzielles Immunfluoreszenz-Kit; zur Reduzierung unspezifischer Markierung</td></tr><tr><td>Rotator SB2 oder SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>Rotator für Mikrozentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Rückgewinnung von Natriumcitrat-Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>Eindeckmittel</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>Anti-Fade-Mittel</td></tr><tr><td>Permanent positiv geladen, vorgewaschen, 90 Grad geschliffene Kanten</td><td>Klarheit</td><td>N/C366</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Glasdeckglas - Dicke Nr. 1, 22 x 50 mm</td><td>Reinheit</td><td>NQS13/2250</td><td>Deckgläser</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Sockelmatrix für 3D-Organoidkulturen</td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>für die Aufbereitung von Gewebe/Organoiden</td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>für die Aufbereitung von Gewebe/Organoiden</td></tr><tr><td>1,5 mL LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>für isolierte Organoide</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Anti-E-Cadherin-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Primärantikörper 1:500</td></tr><tr><td>Ratte monoklonaler Anti-Tubulin YL1/2-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>Primärantikörper 1:100</td></tr><tr><td>Kaninchen-Alpha-Tubulin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>Primärantikörper 1:100</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Beta-Aktin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>Primärantikörper 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-p150 Ratte Geklebter Antikörper</td><td>BD</td><td>Bioscience 610473/4</td><td>Primärantikörper 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonaler EB3KT36 Antikörper Ratte</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>Primärantikörper 1:200</td></tr><tr><td>Monoklonaler EB1-Antikörper der Maus</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>Primärantikörper 1:200</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Lgr5-Antikörper</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>Primärer Antikörper 1:100</td></tr><tr><td>Dylight Anti-Ratte 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>Seconday Antikörper 1:400</td></tr><tr><td>Dylight Anti-Maus 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>Seconday Antikörper 1:400</td></tr><tr><td>Dylight Anti-Kaninchen 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>Seconday Antikörper 1:400</td></tr></tbody></table>

immuno-fluoreszierende etikettierung von mikrotubuli und centrosomal proteine in ex vivo darmgewebe und 3d in-vitro- darm organellen

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Das Aufkommen von 3D in-vitro- Organellen, die in Vivo Gewebearchitektur und Morphogenese imitieren hat die Fähigkeit, wichtige biologische Fragestellungen in Zell- und Entwicklungsbiologie stark vorangetrieben. Darüber hinaus verspricht Organellen zusammen mit technischen Fortschritten in gen bearbeiten und virale gen Lieferung, medizinische Forschung und Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Krankheiten zu gelangen. Organellen in Vitro im Keller Matrix gewachsen bieten leistungsstarke Modellsysteme für das Studium, das Verhalten und die Funktion von verschiedenen Proteinen und eignen sich gut für live-Aufnahmen von Leuchtstoff-markierten Proteine. Allerdings ist zur Gründung der Ausdruck und die Lokalisierung der körpereigene Proteine in Gewebe Ex Vivo und in Vitro Organellen wichtig, das Verhalten der tagged Proteine zu überprüfen. Zu diesem Zweck haben wir entwickelt und modifiziert Gewebe Isolierung, Fixierung und Immuno-Kennzeichnung Protokolle für die Lokalisierung von Mikrotubuli, centrosomal und damit verbundenen Proteine im Darmgewebe Ex Vivo und in Vitro Darm Organellen. Das Ziel war, dass das Fixiermittel, 3D-Architektur der Organellen/Gewebe zu bewahren und auch gleichzeitig Antikörper Antigenität und ermöglicht gute Penetration und Räumung von Fixativ und Antikörper. Kälteexposition depolymerizes alle, aber stabilen Mikrotubuli und dies war ein Schlüsselfaktor, wenn Sie die verschiedenen Protokolle ändern. Wir fanden, dass die Erhöhung der Ethylenediaminetetraacetic Säuren (EDTA) Konzentration von 3 mM bis 30 mM effiziente Ablösung der Zotten und Krypten im Dünndarm gab, während 3 mM EDTA für Kolon Krypten ausreichte. Die entwickelten Formaldehyd/Methanol-Fixierung-Protokoll gab sehr guten baulichen Erhaltung Beibehaltung auch Antigenität für wirksame Kennzeichnung von Mikrotubuli, Actinfilamente und Ende-Bindeproteine (EB). Er arbeitete auch für das centrosomal Protein-Ninein, obwohl das Methanol-Protokoll konsequenter gearbeitet. Wir ergab weiter, dass Fixierung und Immuno-Kennzeichnung der Mikrotubuli und damit verbundenen Proteine mit Organellen von isoliert oder im Keller Matrix bleibt erreicht werden konnte.

Wir präsentieren Protokolle zur Isolierung der intestinalen 3D-Strukturen aus in-Vivo -Gewebe und in-vitro- Keller-Matrix eingebettet, Organellen, und Detail verschiedene Fixierung und Färbung Protokolle für Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli optimiert, centrosomal und Knoten Proteine sowie Handy-Marken einschließlich des Stammzell-Proteins Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in 3D in vitro in die Basalmatrix eingebettete Darmorganoide zu isolieren und anschließend die Mikrotubuli und zentrosomalen proteins. 3D in vitro Organoide zu fixieren und immunzu markieren. Die Lokalisierung endogener Proteine und Strukturen in 3D-Modellen ist jedoch komplexer als in 2D-Kulturen.Wichtig ist, dass das Fixiermittel die empfindliche 3D-Architektur und gleichzeitig die Antigenität des Antikörpers bewahrt. Die vorgestellten Methoden umfassen die Isolierung, Fixierung und Immunmarkierung von 3D-in-vitro-Darmorganoiden. Die Fixierungs- und Immunmarkierungsprotokolle können aber auch in ex vivo isoliertem Gewebe verwendet werden.Der Hauptvorteil des vorgestellten Formaldehyd-Methanol-Fixierungsprotokolls besteht darin, dass es die 3D-Strukturen bei gleichzeitiger Beibehaltung der Antigenität bewahrt. Es ermöglicht eine gute Penetration und Clearance von postfixierten Tevel-Antikörpern für eine effektive Markierung von Mikrotubuli, Aktinfilamenten und Bindungsproteinen sowie mehreren zentrosomalen Proteinen, einschließlich Ninein. Das Verfahren wird von Dr. Deborah Goldspink, einer formellen Postdoktorandin in meinem Labor, und Dr. Zoe Matthews, einer Co-Autorin, demonstriert.Nach der Isolierung von Darmkrypten und -zotten können isolierte Epithelstrukturen für die Immunfärbung fixiert werden. Die isolierten Krypten können abwechselnd in Matrixkuppeln platziert werden, die dann Organoide bilden. Nach etwa fünf bis sieben Tagen Inkubation haben sich Organoide gebildet.Verwenden Sie 500 Mikroliter RT-PBS, um die Vertiefungen, die die Matrixkuppeln des Untergeschosses enthalten, mit Organoiden zu waschen. Geben Sie dann 250 Mikroliter Kaltzellen-Rückgewinnungslösung in jede Vertiefung. Kratzen Sie anschließend mit einer P1000-Mikropipette die Kuppeln der Kellermatrix ab und pipettieren Sie vorsichtig in der Vertiefung auf und ab, um die Kellermatrix aufzubrechen und aus dem Kunststoff zu entfernen.Stellen Sie sicher, dass die Wiederherstellungslösung kalt ist, um die Matrix aufzubrechen. Verwenden Sie beim Schaben nur eine P1000-Mikropipette, damit Sie die Organoide nicht aufbrechen und sie intakt bleiben. Sammeln Sie den Überstand in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung.Drehen Sie dann das Röhrchen mehrmals um und überprüfen Sie unter einem Mikroskop bei manchmal 50-facher Vergrößerung, ob die Organoide isoliert wurden, sich frei bewegen und nicht in Klumpen liegen. Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 1.000 g und Raumtemperatur fünf Minuten lang pelletiert. Entfernen Sie dann das Wiederherstellungsreagenz und fahren Sie sofort mit der Fixierung fort.Um zuvor isolierte Organoide mit Formaldehyd und Methanol zu fixieren, resuspendieren Sie die Organoide in einer Formaldehyd-Methanol-Fixierlösung von minus 20 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Organoide bei minus 20 Grad Celsius in einem Gefrierschrank für 15 Minuten, wobei Sie das Röhrchen alle fünf Minuten umdrehen. Dann pelletieren Sie die Organoide durch Zentrifugation bei 1.000 g für fünf Minuten.Entfernen Sie das Fixiermittel und fügen Sie dann die Waschlösung hinzu, die entweder aus PBS mit 1 % Serum aus sekundären Antikörperspezies oder PBS mit 0,1 % Reinigungsmittel und 1 % Serum besteht. Nachdem Sie die Probe wie zuvor pelletiert haben, entfernen Sie die Waschlösung und resuspendieren Sie die Probe in frischer Waschlösung. Waschen Sie die Zellen mit einem Röhrenrotator insgesamt eine Stunde lang, indem Sie die Organoide alle 15 Minuten durch Zentrifugation pelletieren und die Waschlösung austauschen.Um die Darmorganoid-Proben zu blockieren, fügen Sie PBS 10 % Serum mit sekundären Antikörperspezies hinzu. Die Organoide werden fünf Minuten lang mit 1.000 g pelletiert und der Überstand entfernt. Geben Sie eine Milliliter-Blockierungslösung zu jeder Probe, die in den verschiedenen Antikörpern inkubiert werden soll.Inkubieren Sie dann die Proben und die Blocklösung eine Stunde lang auf einem Röhrchenrotator bei Raumtemperatur. Als nächstes verdünnen Sie die primären Antikörper in PBS mit 10 % Serum und 0,1 % Detergens. Nachdem Sie die Proben gedreht und die Blockierungslösung entfernt haben, verwenden Sie die primäre Antikörperlösung, um das Organoid-Pellet zu resuspendieren.Drehen Sie die Röhrchen über Nacht bei 20 U/min und vier Grad Celsius, um die Organoide in der Schwebe zu halten. Am nächsten Tag bringen Sie die Proben auf dem Röhrchenrotator für eine Stunde wieder auf Raumtemperatur. Entfernen Sie nach dem Schleudern der Probe die primäre Antikörperlösung, geben Sie einen Milliliter Waschlösung in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Organoid-Pellets.Entfernen Sie dann sofort die Lösung durch Zentrifugieren. Fügen Sie einen Milliliter frische Waschlösung hinzu und mischen Sie die Zellen auf einem Röhrchenrotator bei 20 U/min für zwei Stunden. Als nächstes verdünnen Sie die Sekundärantikörper in PBS mit 1 % Serum und 0,1 % Detergens.Nach dem Pelletieren des Gewebes werden die Pellets in 200 Mikrolitern Sekundärantikörperlösung resuspendiert. Inkubieren Sie die Röhrchen auf einem Röhrchenrotator eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Schleudern und Entfernen des Überstands wird das Pellet in Waschlösung resuspendiert und die Proben sofort zentrifugiert, um die Organoide zu pelletieren.Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischer Waschlösung. Mischen Sie die Proben auf einem Röhrchenrotator bei Raumtemperatur für 1,5 bis zwei Stunden und wechseln Sie die Waschlösung alle 20 bis 30 Minuten wie zuvor beschrieben. Um die Organoide zu fixieren, geben Sie nach dem Schleudern und Entfernen der gesamten Waschlösung zwei Tropfen harthärtendes Einbettmittel mit Antifade-Reagenz zu dem Pellet.Schneiden Sie das Ende einer P200-Mikropipette ab und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig wieder im Eindeckmedium. Achten Sie bei der Resuspendierung von fixierten und gefärbten Organoiden in Einbettmedium darauf, keine Blasen einzuführen. Wenn Blasen vorhanden sind, lassen Sie sie an der Oberfläche schwimmen und vermeiden Sie dann, sie auf die Rutsche zu übertragen.Verwenden Sie die Mikropipette, um die Organoide mit Eindeckmedium in einer Linie entlang der Mitte eines Objektträgers zu dosieren. Platzieren Sie dann vorsichtig ein Deckglas über die Oberseite und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Legen Sie den Objektträger in ein Objektträgerbuch und bewahren Sie ihn über Nacht im Kühlschrank auf, damit das Eindeckmedium vor der Analyse mit einem konfokalen Mikroskop aushärten kann.Hier sind Bilder von Fraktion zwei von isoliertem Dünndarmgewebe, das sowohl Zotten als auch Krypten enthält, und einer Probe von Fraktion drei, die hauptsächlich Krypten enthält. Wie in diesen Bildern zu sehen ist, wurde eine gute Konservierung und Markierung von Mikrotubuli und Aktin sowohl in Zotten als auch in Krypten mit dem in diesem Video beschriebenen Formaldehyd-Methanol-Fixierungs- und Immunmarkierungsprotokoll erreicht. Dünndarm-Organoide wurden erzeugt und drei Wochen oder länger in der Basalmatrix gezüchtet und dann isoliert, wie in diesem Video gezeigt.Die differenzierten Zellen innerhalb der organoiden Zottendomänen enthalten stabile apikobasale Mikrotubuli, die in den meisten Fällen gut markiert waren. EB1 war auch entlang des Mikrotubuli-Gitters zu sehen. Hier ist ein Organoid im Zystenstadium und in einem frühen Stadium der Kryptenentwicklung zu sehen.Beide Proben wurden in Formaldehyd-Methanol fixiert und immunmarkiert für Mikrotubuli und Ninein, was eine gute Konservierung und Markierung der Mikrotubuli in apikalen nicht-zentrosomalen Mikrotubuli-Organisationszentren zeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik mit mehreren Samples und über einen Zeitraum von zwei Tagen durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Vertiefungen beim Sammeln von Organoiden sorgfältig abzukratzen, um ihre 3D-Struktur nicht zu stören.Seien Sie auch vorsichtig, wenn Sie Lösungen hinzufügen oder entfernen, um den Verlust von Organoiden während des Färbevorgangs zu verhindern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie isolierte Organoide und andere Epithelstrukturen wie Darmkrypten fixiert, immunmarkiert und montiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixierreagenzien bei diesem Verfahren äußerst gefährlich sein kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten Risikobewertungen durchgeführt und immer geeignete Eindämmungsmaßnahmen und PSA mitgenommen werden.

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung und maschinelle Lernanalyse von Darmorganoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie

Lernen Sie die Isolierung, Fixierung und Immunfärbung von 3D-Darmorganoiden mit Formaldehyd-Methanol zur Erhaltung der Architektur und Antigenität für die Zellbiologie.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen (Video) | JoVE Journal

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

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