Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Dieses Protokoll zeigt die wichtigen aufeinander folgenden Schritte erforderlich, um die Relevanz der Überwachung Vitalität Parameter und DNA-Reparaturprozesse in Bacillus Subtilis Sporen nach der Behandlung mit Niederdruckplasma Wiederbelebung durch tracking Fluoreszenz-markierten DNA-Reparatur Proteine über zeitaufgelösten konfokalen Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie.

Das übergeordnete Ziel dieser konsekutiven Methoden ist es, Vitalitätsparameter bei der DNA-Reparatur bei der Wiederbelebung von Bacillus subtilis-Sporen nach einer Niederdruck-Plasmabehandlung mit zeitaufgelöster konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie sichtbar und zu überwachen. Unsere Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der mikrobiellen Inaktivierung und Sterilisation zu beantworten. Es hilft uns, die schädliche Wirkung der Niederdruckplasmabehandlung auf biologische Indikatoren wie Bacillus subtilis-Sporen zu analysieren.

Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass wir mehrere Methoden kombinieren: die Ansichtsbestimmung, die Rasterelektronenmikroskopie und die Überwachung der DNA-Reparatur mit Hilfe der Zeitergebnis-Fluoreszenzmikroskopie, um die schädliche Wirkung der Niederdruckplasmabehandlung zu überprüfen. Um die Sporenproduktion durchzuführen, wird eine Fünf-Milliliter-Übernachtkultur des jeweiligen B.subtilis-Stammes, die mit geeigneten Antibiotika ergänzt ist, auf 200 Milliliter Flüssigschäfer-Sporulationsmedium mit doppelter Stärke überführt und unter kräftiger Belüftung bei 37 Grad Celsius für mindestens 72 Stunden oder länger kultiviert, bis mehr als 95 % der Kultur sporuliert sind. Ernten Sie die Sporen in 15-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation bei 3000 g für 15 Minuten und reinigen Sie die Proben mit steril destilliertem H2O in wiederholten Waschschritten.

Überprüfen Sie die Reinheit und den Keimstatus durch Gesichtskontrast-Miskopie und stellen Sie sicher, dass die Sporensuspensionen zu mehr als 99 % aus phasenhellen Sporen bestehen und frei von vegetativen Zellen, gekeimten Sporen und Zelltrümmern sind, da sonst weitere mikroskopische Experimente gestört werden können. Bestimmen Sie den Sporentiter, indem Sie 50 Mikroliter zehnfacher Serienverdünnungen auf LB-Agar plattieren, um die KBE zu berechnen, und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der KBE-Bestimmung wird die Probe auf 10 bis 9 Sporen pro Milliliter eingestellt, indem die Proben konzentriert oder mit sterilem Wasser verdünnt werden.

Legen Sie einen Probenträger in Form von sterilisierten mikroskopischen Objektträgern oder runden 25-Millimeter-Deckgläsern in das elektrisch betriebene Aerosol-Sprühgerät in Übereinstimmung mit der Düse. Übertragen Sie die Sporenkultur in den Düsenflüssigkeitseinlauf und starten Sie das Sprühen bei 0,15 Sekunden mit einem Druck von 1,3 bar. Die gesprühte Sporensuspension bildet auf dem mikroskopisch kleinen Objektträger einen dünnen Film, der innerhalb von Sekunden schnell trocknet und eine gleichmäßig verteilte Sporenmonoschicht bildet.

Lagern Sie die behandelten Probenträger in einem sterilen Behälter bei Raumtemperatur. Um alle Oberflächen in der Plasmaanlage zu reinigen und zu erwärmen, starten Sie die Anlage bei fünf Pascal mit Argonplasma bei 500 Watt für fünf Minuten. Die Vorbehandlung reduziert das Anhaften von Molekülen aus der Umgebungsluft wie Stickstoff, Sauerstoff und Wasser während der Entlüftung der Kammer.

Nachdem Sie die Kammer entlüftet haben, legen Sie die Proben vorsichtig auf Glasgestelle in der Mitte des Reaktorbehälters. Schließen Sie die Kammer und evakuieren Sie sie. Anschließend wird die Kammer mit dem gewünschten Prozessgas gefüllt und der Druck im System auf fünf Pascal geregelt.

Starten Sie dann den Plasmaprozess. Schalten Sie nach der definierten Prozesszeit die Strom- und Gaszufuhr aus und entlüften Sie das System vorsichtig, um ein Ausblasen der Proben aus dem Probenhalter zu verhindern. Entnehmen Sie die Proben nach der Beatmung und lagern Sie sie in einem sterilen Behälter.

Bei nicht plasmabehandelten Kontrollen sind die Proben nur in Gegenwart des Prozessgases einem Vakuum auszusetzen, das der längsten angewendeten Plasmazeit entspricht. Bereiten Sie eine Lösung aus autoklaviertem 10%igem Polyvinylacetat oder PVA vor und verwenden Sie 500 Mikroliter davon, um die Probenträger sorgfältig abzudecken. Nachdem Sie sie vier Stunden lang an der Luft trocknen ließen, entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette die getrocknete PVA-Schicht, in der sich nun die Sporenprobe befindet, und überführen Sie sie in ein 2-Milliliter-Reaktionsröhrchen.

Geben Sie einen Milliliter steriles Wasser in das Röhrchen und wirbeln Sie es vortexen, um die PVA-Schicht aufzulösen und mehr als 95 % der keimfähigen Sporen zurückzugewinnen. Verwenden Sie steriles Wasser, um die Probe in einer 96-Well-Platte nacheinander bei eins bis 10 zu verdünnen. Nachdem Sie 50 Mikroliter jeder Verdünnung auf LB-Agar plattiert und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, zählen Sie die Anzahl der Kolonien und bestimmen Sie die KBE pro Milliliter.

Bereiten Sie für Keimexperimente ein einen Millimeter dickes 1,5 Pfund Agarpad vor, indem Sie 700 Mikroliter Medium kochen und in eine sterile Mikroskopie-Petrischale pipettieren. Schneiden Sie nach 10 Minuten mit einem sterilen Skalpell ein acht Millimeter mal acht Millimeter mal einen Millimeter großes LB-Agarpad aus und übertragen Sie das Agar vorsichtig auf die Sporenmonoschichten, die auf 25-Millimeter-Glasdeckgläsern ruhen, die bereits in einer Bildgebungskammer montiert sind. Die Agar-Put-Methode kombiniert zwei spezifische Funktionen.

Es stabilisiert die Proben in der optischen Ebene während der Lasermikroskopie und schränkt die seitliche Zellbewegung ein. Neben der Verwendung für Keimaufsätze kann diese Methode sowohl auf andere Mikroorganismen als auch auf eukaryotische Zellen angewendet werden. Nachdem Sie die Probe mit Agar bedeckt haben, übertragen Sie den Glasdeckglas schnell in eine Bildgebungskammer.

Halten Sie die Probe während des gesamten Bildgebungsprozesses auf einem beheizten Tisch bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie mindestens drei biologische Replikate für jede Erkrankung. Im Anschluss an die Bildgebung der Proben durch automatisiertes konfokales Laserscanning und Hellfeldmikroskopie nehmen Sie Zeitrafferreihen mit einer Laserleistung von 2,6% auf und stellen die konfokale Apertur je nach Experiment auf fünf aer-Einheiten und eine Probenfrequenz von einem Bild pro 30 Sekunden von null bis fünf Stunden ein.

Die Anwendung hoher Dosen monochromatischen Lichts kann die Sporenkeimung während der Lasermikroskopie vollständig hemmen. Verwenden Sie daher die Laserintensität und nur längere Intervalle, um Einzelbilder zu erhalten. Im Falle einer Sporenaggregation, einer mehrschichtigen Sporenverteilung oder einer Kontamination durch Staubpartikel kann es zu einer Verstopfung der Plasmabehandlung oder Abschattung kommen, die die Keimung von abgeschatteten Sporen ermöglicht.

Um die Rasterelektronenmikroskopie durchzuführen, werden die Proben, nachdem die Sporenmonoschichten mit Gold-Palladium kodiert wurden, mit dem Feldemissions-REM abgebildet, das bei einer Beschleunigungsspannung von fünf Kilovolt betrieben wird, einschließlich eines Inlan-Sekundärelektronendetektors, um den Topographiekontrast sichtbar zu machen. Wie in dieser Grafik gezeigt, führt die Plasmabehandlung der B.subtilis-Sporen zu einer Abnahme des Überlebens mit zunehmender Dauer der Plasmabehandlung. Diese REM-Aufnahmen zeigen charakteristische longitudinale gratartige Strukturen, die bei allen behandelten und unbehandelten Sporen ständig sichtbar sind.

Die Plasmabehandlung bis zu 30 Sekunden führt zu keinen signifikanten Veränderungen der Morphologie der Sporenoberfläche im Vergleich zu Kontrollen. Die zunehmende Dauer der Plasmabehandlung führt zu einer körnigeren Oberfläche und kleine Risse und Risse können bei Sporen beobachtet werden, die 120 oder 240 Sekunden lang behandelt werden. In diesen zeitaufgelösten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie-Experimenten keimen fast alle mit Vakuum als Kontrolle behandelten Sporen und entwickeln eine stäbchenförmige Zellmorphologie mit einer eher einheitlichen Länge der einzelnen Zellen.

Im Gegensatz dazu zeigen Sporen, die 15 Sekunden lang mit Plasma behandelt wurden, bereits eine verminderte Keimfähigkeit von weniger als 75 plus oder minus vier Prozent. Außerdem wachsen die Zellen entweder zu großflächig langen Stäbchen heran oder bleiben klein und bleiben in der Sporenhülle stecken. Nach 30 Sekunden Plasmabehandlung keimen nur noch 25 oder minus sechs Prozent der Sporen und die vegetativen Zellen sind deutlich verzögert im Wachstum und variieren in der Länge.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Qualität der Sporenmonoschichten mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie zu bestätigen, um sicherzustellen, dass keine überlappenden oder keimenden Sporen vorhanden sind. Die Agar-Pad-Methode zur Bildstabilisierung ebnete nach ihrer Entwicklung den Weg für Forscher in der Plasmasterilisation und der Lebendzellmikroskopie. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man Sporen-Monoschichten auf Objektträgern vorbereitet, die Bestimmung der Verwendung von Plasmabehandlungen zur Sporeninaktivierung und die Durchführung von Lebendzell- und Rasterelektronenmikroskopie durchführt.

Im Gegensatz zu anderen Dekontaminationsmethoden, wie z.B. Ethylenoxid oder Gammastrahlung, ist die Plasmasterilisation ein effizienter und sicherer Ansatz, um eine Reihe unerwünschter Mikroorganismen auf nahezu jeder Art von Oberfläche zu reduzieren.