Name: Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Sammlung von postkoitalem Sperma aus dem weiblichen Reproduktionstrakt und zur Messung der Spermaverflüssigung bei Mäusen. Dieses Verfahren liefert wertvolle Einblicke in die Reproduktionsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wird unterstützt vom Anschubfonds College of Veterinary Medicine (WSU), WW. Die Autoren danken Sierra Olsen (WSU) für kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle Tiere und Verfahren, die in dieser Studie wurden nach Washington State University (WSU) Animal Care und Use Committee Richtlinien und unter Einhaltung der WSU zugelassene tierische Protokolle #4702 "und" #4735 bearbeitet.
(1) Mäuse
<ol><li>
Verwenden Sie standard C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen oder anderen Stämmen von Interesse. Tiere unter einer kontrollierter Temperatur und feuchte Umgebung, mit Ad Libitum Zugang von Wasser und Nahrung zu erhalten.
	<ol>
<li>Verwenden Sie männlichen Züchter von 8 Wochen bis 10 Monate alt. Verwenden Sie nur bewährte Züchter in den Experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erwachsene weibliche Mäuse mit einem Gewebe selektives Löschen der Fortpflanzungsorgane Östrogen Rezeptor α (kodiert durch Esr1 gen) in den Epithelzellen10 verwenden (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, Ko- oder "KO" genannt) und Wurfgeschwistern (Esr1f/f, genannt "Strg") in dieser Studie zu kontrollieren.
	<ol>
<li>Verwenden Sie 8 Wochen alten Weibchen. Alter der Weibchen variiert in Abhängigkeit von dem Experiment von Interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die Phasen des Estrous Zyklus morgens um 08:00 h. Verwenden Sie nur die Weibchen in der Brunst Phase des Zyklus. Für detaillierte Methoden der vaginalen verschmieren und zytologische Analyse beziehen sich auf die bisher veröffentlichten Verfahren11.</li>
</ol>2. Paarung und Bewertung copulator Stecker
<ol><li>Am Tag des Östrus (16:00 h) Haus der Frau in einer männlich Käfig.</li>
	<li>Trennen Sie am nächsten Morgen (08:00 h), das Weibchen von der männlichen Maus.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Anpassung eines bereits veröffentlichten Methode12 , um das Vorhandensein oder Fehlen eines vaginalen oder copulator Steckers als Indiz für die Paarung zuzugreifen.</li>
	<li>Halten Sie die weibliche Maus von der Schwanzwurzel kurz anheben der Hintergliedmaßen.</li>
	<li>Finden Sie den copulator Stecker durch die Anwesenheit von ein wollweißer bahnbrechenden Koagulum an die vaginale Öffnung mit einem Zahnstocher. Wenn der copulator Stecker vorhanden ist, werden die Zahnstocher in den Vaginalkanal eingefügt nicht.</li>
</ol>3. Vorbereitung vor dem Gewebe Sammlung
<ol><li>10 mL Leibovitzs L-15 Medien, ergänzt mit 1 % fötalen Rinderserum vorbereiten (namens L15 Medien + 1 % FBS) in einem 15 mL-Tube. Inkubieren Sie die Medien bei 37 ° C für 15 Minuten in ein Wasserbad.</li>
	<li>Um die Lebensfähigkeit des Gewebes und Sperma für downstream-Anwendungen zu erhalten, Rohr aliquoten 2 mL vorgewärmten L15 Medien + 1 % FBS in ein 2 mL Microcentrifuge für Gewebe-Sammlung.</li>
	<li>Die Bühne des Stereomikroskops auf 37 ° c warm Der Heizblock auf 37 ° C festgelegt, und legen Sie einen leere 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch in den Block.</li>
	<li>Wenn die downstream-Anwendungen erfordern imaging der Beweglichkeit der Spermien, warme Objektträger auf 37 ° C.</li>
</ol>(4) Gewebe-Sammlung
<ol><li>Das Gewebe Sammelgebiet bringen Sie vorgewärmten L15 Medien + 1 % FBS aliquoten.</li>
	<li>Das Weibchen einschläfern (~ 08: 30h) mit Kohlendioxid Erstickung gefolgt von zervikale Dislokation. Hinweis: Dies ist etwa 8 Stunden nach der Paarung, geht man davon aus, dass die Paarung um Mitternacht stattfindet.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in Rückenlage, im Bauchbereich verfügbar zu machen.</li>
	<li>Sprühen Sie 70 % Alkohol auf dem Bauch in der Nähe der hinteren Gliedmaßen.</li>
	<li>Verwenden Sie die sezierenden Schere einen kleinen Schnitt (~ 1 cm) zu machen, auf die Haut des Unterleibs.</li>
	<li>Die dominante Hand verwenden, um die Rute (und Hintergliedmaßen ggf.) ziehen während der nichtdominanten Hand zieht die Haut in die entgegengesetzte Richtung (in Richtung zum Kopf), um die Bauchmuskulatur freizulegen. Diese Methode wird verwendet, um Haare Kontamination der viszeralen Organe zu minimieren.</li>
	<li>Schneiden Sie die Bauchmuskulatur in V-Form an der Unterseite des Bauches, angrenzend an die Vagina, die viszeralen Organe aussetzen.</li>
	<li>Verschoben Sie Darm und Bauchfett auf die Seite, die Fortpflanzungsorgane verfügbar zu machen.</li>
	<li>Schneiden Sie Blase und anderen Geweben über den vaginalen Bereich.</li>
	<li>Schneiden Sie Schambeinfuge auseinander, um Zugang zu der vaginalen Gewebe.</li>
	<li>Heben des vaginalen Gewebes an der Scheidenöffnung und mittels Schere um den vaginalen Kanal aus dem rektal Gewebe zu trennen.</li>
	<li>Schneiden Sie sorgfältig die mesenterialen Fett von beiden Seiten der Gebärmutter mit Feder Schere ab. Achtung: Die Gebärmutter ist sehr empfindlich mit den Samen im Inneren. Achten Sie darauf, die Gebärmutter zu durchbohren, sonst werden die Samen verloren gehen.</li>
	<li>Heben Sie den unteren Genitaltrakt und schneiden Sie die Eierstöcke Fettpolster Weg von beiden Seiten.</li>
	<li>Übertragung der gesamten Fortpflanzungsorgane in das Rohr des vorgewärmten Leibovitz L-15 Media + 1 % FBS.</li>
</ol>5. Messung der Samen Verflüssigung (Viskosität) von uterinen Content Collection
<ol><li>Auf der beheizten Bühne des Stereomikroskop, Übertragung, die das Gewebe in einen 35 mm steril Gewebekultur Teller mit 3,5 mL gefüllt vorgewärmt, L-15 Media + 1 % FBS zu die Geweben von Blut und anderen Schadstoffen zu reinigen. Achtung: Beim Waschen, schnappen Sie sich das Gewebe durch das Fett nicht in die Gebärmutter. Zu diesem Zeitpunkt dürfte das Sperma in die Gebärmutter intakt sein.</li>
	<li>Tupfen Sie das Gewebe des überschüssigen Medien mit Labor-Feuchttücher.</li>
	<li>Halten Sie das Gewebe am vaginalen Ende während des Einsetzens der Eierstöcken Ends in den vorgewärmten Microcentrifuge Schlauch. Halten Sie das vaginale Ende, schneiden Sie die uterine Hörner an der Basis der Gebärmutter, so dass die Gebärmutter Hörner in den Microcentrifuge Schlauch fallen.</li>
	<li>Lass das Sperma fließen aus der Gebärmutter Hörner in die Röhre. Verwenden Sie zahnlos Zange, um drücken Sie vorsichtig die uterine Hörner aus dem Eierstock Ende der vaginalen Ende, Vertreibung aus übrig gebliebenen Samen.</li>
	<li>Das Gewebe im Biohazard Beutel entsorgen und verbrennen.</li>
	<li>Kurz spin-down der Samen in ein Minicentrifuge (~ 1-2 s).</li>
	<li>Legen Sie das Rohr parallel zu den beheizten Objekttisch - Sperma wird nicht austreten.</li>
	<li>Den Timer bereit und "aufwärts".</li>
	<li>Die Samenprobe in einem Winkel von 180° (parallel zu der Rohrwand) stecken Sie eine 25 µL Kapillarrohr. Dies ist die Variabilität zwischen jeder Ermittler aus dem Besitz der Kapillare in verschiedenen Winkeln zu minimieren.</li>
	<li>Drücken Sie die Timer, sobald das Kapillarrohr macht Kontakt mit den Samen.</li>
	<li>Notieren Sie die Zeit (s) die es für das Sperma dauert um die 25 µL-Linie zu erreichen.</li>
	<li>Wenn die Messung abgeschlossen ist, legen Sie sofort die Röhrchen mit Sperma zurück in die trockene Hitze-Block für weitere funktionelle Analysen, wie z.B. video Darstellung der Beweglichkeit der Spermien.</li>
	<li>Desinfizieren Sie das Kapillarrohr mit Sperma durch das Rohr in 10 % Bleichmittel-Lösung für 20 min eintauchen und entsorgen Sie das Kapillarrohr in Sharps Container.</li>
</ol>6. video Imaging der Beweglichkeit der Spermien
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop und video-imaging-Software.</li>
	<li>Pipette 20 µL des verbleibenden Spermas auf der vorgewärmten Glas-Folie, während die Objektträger auf den beheizten Objekttisch gelegt wird.</li>
	<li>Mit ein Glas Deckglas abdecken.</li>
	<li>Legen Sie die Folie Deckglas Seite nach unten auf das Mikroskop.</li>
	<li>Verwenden Sie 20 X Objektiv Interessengebiet zu finden.</li>
	<li>Ändern Sie in 100 X Objektiv für video Imaging.</li>
	<li>Nehmen Sie die Video auf 12 Bilder/s (fps) für 30 s.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip Videoaufnahmen Sie die in mindestens 3 verschiedenen Bereichen pro Tier.</li>
	<li>Führen Sie die Bildgebung schnell und Belichtung auf die Folie zu minimieren, um Beweglichkeit der Spermien und Lebensfähigkeit zu erhalten. Hinweis: Dieses bildgebende Verfahren sollte innerhalb von 2 – 3 min. erfolgen.</li>
	<li>Datenanalyse mit ImageJ-Software als zuvor beschriebenen8.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Sammeln von Samen von Maus Uteri bieten Vorteile gegenüber Samen Analyse in Vitro wie die ehemaligen die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den Samen und das Sekret aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane. zeigen können In dieser Studie vorgestellten Techniken erlauben Forschern, Qualität des Spermas sowie Spermien Rentabilität und Motilität in physiologischen Voraussetzungen zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es verschiedene nachgelagerte Auswertungen, die mit den Samen gesammelt aus den Uteri du...

Die weiblichen Fortpflanzungsorgane besteht aus der oberen und unteren Flächen. Den oberen Genitaltrakt umfasst Eileiter, die Gebärmutter und die Endocervix. Die unteren Genitaltrakt umfasst das Ectocervix und der Vagina. Beim Menschen ist das Sperma ejakuliert an der vorderen Wand der Vagina, angrenzend an das Ectocervix1hinterlegt. Bei Mäusen jedoch wird das Sperma in die Gebärmutter innerhalb von Minuten nach der Paarung2gefegt.
Sperma enthält wegweisende Gel, das ist innerhalb von Sekunden der Ejakulation, verursacht die Spermien zu gefangen werden verfestigt und3immobilisiert. Verflüssigung löst das immobilisierte Sperma indem Sie Sperma aus einem gelartigen in eine wässrige Konsistenz ändern. Dieser Prozess ist unerlässlich für die Beweglichkeit der Spermien und Säugetieren Reproduktion. Kenntnis der Samen Verflüssigung basiert hauptsächlich auf in-vitro- Studien, wo Sperma in der Kulturschale verflüssigt wird. Beim Menschen ist die enzymatische Aktivität der Prostata-spezifisches Antigen oder PSA (auch bekannt als Kallikrein-bezogene Peptidase 3 oder KLK3) den größten Anteil zur Verflüssigung durch Hydrolyse von Semenogelins (Gel-bildende Proteine in der Samenflüssigkeit vorhanden)4 ,5,6. Abbau von Semenogelins befreit die Spermien von der bahnbrechenden Koagulum, zunehmende Mobilität der Spermien. Befreit Spermien schwimmen in Richtung Eileiter auf das Ei zu befruchten. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) Tests sind eines der standard ersten Vorführungen für Spermiogramm in Fruchtbarkeitskliniken männliche Ergiebigkeit7bewerten.
Ein kürzlich erschienenen Artikel zeigt, dass die Analyse der Samenflüssigkeit gesammelt aus der Maus weiblichen Genitaltrakt Post-Verpaarung verwendet werden, um einen Mangel an Verflüssigung zu illustrieren, die anschließend Fruchtbarkeit Defekte8verursachen können. Defekte Verflüssigung wie Sperma Hyperviskosität trägt zur 11,8-32,3 % der unfruchtbaren Fälle Männer9, darauf hindeutet, dass normale Verflüssigung für Säugetier-Wiedergabe unabdingbar ist. Jedoch haben Studien und Behandlung der Verflüssigung Mängel ausschließlich auf die männlichen7konzentriert. Die Möglichkeit, dass die weiblichen Fortpflanzungsorgane eine Rolle bei der Verflüssigung des Samens spielt ist nicht untersucht worden. Daher werden die Methoden zur Samengewinnung und Verflüssigung Messzeit Forscherinnen eine neuartige Diagnose-Tool um festzustellen, ob Verflüssigung eine der Ursachen der Unfruchtbarkeit bei Modellorganismus von Interesse sein könnte.

<table><tbody><tr><td>Zahnstocher</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoklaviert steril, verwenden Sie einen abgestumpften Zahnstocher. Verwenden Sie keine</td></tr><tr><td>Präparierschere</td> mit spitzem Ende <td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; L Glaskapillarrohr</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz s L-15 media</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>Ergänzung mit 1% FBS</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Trockenblockheizer</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>Zum Erwärmen des Mikrozentrifugenröhrchens vor der Samenentnahme</td></tr><tr><td>Minizentrifuge</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Kulturschale</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Präzision</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop mit beheiztem Tisch</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>Um das Gewebe vor der Entnahme warm zu halten Samenentnahme</td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Optional. Für die Videodarstellung der Spermienmotilität</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>optional. Für die Videodarstellung der Spermienmotilität</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Optional. Zur Videodarstellung der Spermienmotilität</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Optional. Für die Videodarstellung der Beweglichkeit der Spermien</td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>In dH2O auf 10% Konzentration verdünnen</td></tr></tbody></table>

sammlung von post-paarung sperma aus der weiblichen fortpflanzungsorgane und messung von sperma verflüssigung bei mäusen

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Bei Mäusen lagert sich ejakuliert Sperma in die Gebärmutter. Nach der Ejakulation, ändert sich das Sperma von Gel-artige Konsistenz zu wässrig, einen Prozess namens Verflüssigung. In der vorliegenden Studie zeigen wir, wie das Post-ejakuliert Sperma von der weiblichen Fortpflanzungsorgane in einem Mausmodell zu sammeln. Erste, Erwachsene weibliche Mäuse in der Brunst waren über Nacht in einem männlichen Käfig untergebracht. Am nächsten Morgen bestätigte das Vorhandensein von copulator Stecker an die vaginale Öffnung Kopulation. Weibliche Mäuse mit copulator Stecker wurden eingeschläfert, und jeder Fortpflanzungsorgane wurden als Ganzes (Scheide, Gebärmutter, Eileiter, Eierstöcke), gewährleistet ein geschlossenes System, das Sperma enthalten. Die Fortpflanzungsorgane in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde, und die Scheide war, lassen Sie das Sperma in das Rohr abgeschnitten. Um maximale Samenvolumen für die Analyse zu gewährleisten, dienten zahnlose Zange, die uterine Hörner vom Eierstock Ende vaginalen Ende wegtreiben restlichen Sperma zu quetschen. Die gesamte Fortpflanzungsorgane wurde dann verworfen. Die Sperma-haltigen Röhre wurde kurz nach unten gesponnen. 25 μL Kapillare Pipette wurde in das Rohr in einem Winkel von 180° (Parallel zur Rohrwand) gelegt. Die Zeit genutzt, um das Kapillarrohr, 25 μL Linie zu füllen wurde aufgezeichnet. Sperma von einem bewährten männlichen Züchter dauert in der Regel ca. 60-180 s, ein 25 μL Kapillarrohr zu füllen. Diese Samen-Kollektion-Technik kann auch in anderen downstream-Anwendungen wie Bildbearbeitung und Motilität Spermiogramm verwendet werden.

Sperma wurde von Strg und KO Weibchen ca. 8 h gesammelt, nach der Paarung mit fruchtbaren Strg-Männchen. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) wird durch den Zeitaufwand für die 25 μL Kapillarrohr mit Sperma füllen quantifiziert. Samen gesammelt von Strg Uteri 2.06 ±0.12 min nahm (mean±S.E.M, n = 5), das Kapillarrohr (Abbildung 1) zu füllen. Die Samen gesammelt von KO Uteri dauerte jedoch länger als 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentelle Zeit. Diese Daten deut...

Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Das Ziel dieser Studie ist es, herauszufinden, wie Sperma nach der Paarung aus dem weiblichen Fortpflanzungstrakt entnommen und wie die Samenverflüssigung bei Mäusen gemessen werden kann. Die in dieser Studie verwendeten Tiere wurden gemäß den Richtlinien des Washington State University Animal Care and Use Committee und in Übereinstimmung mit den von der WSU zugelassenen Tierprotokollen 4702 und 4735 behandelt. Beim Menschen wird der ejakulierte Samen an der Vorderwand der Vagina neben dem Ektozervix abgelagert.Bei Mäusen hingegen wird der Samen innerhalb von Minuten nach der Paarung in die Gebärmutter gespült. Sperma enthält Samengel, das sich innerhalb von Sekunden nach der Ejakulation verfestigt und dazu führt, dass die Spermien immobilisiert werden. Durch den Verflüssigungsprozess wird das Sperma von einer gelartigen zu einer wässrigen Konsistenz verändert.Dieser Prozess ist für die Beweglichkeit der Spermien und die Fortpflanzung von Säugetieren unerlässlich. Die enzymatische Aktivität des prostataspezifischen Antigens oder PSA ist der Hauptfaktor für die Verflüssigung durch Hydrolyse des im Sperma vorhandenen Samengels oder gelbildenden Proteins. Der Abbau des gelbildenden Proteins befreit die Spermien vom Samenkoagulum und erhöht die Beweglichkeit der Spermien, so dass die Spermien in Richtung des oberen weiblichen Fortpflanzungstrakts schwimmen, um die Eizelle im Eileiter zu befruchten.Die in dieser Studie vorgestellte Methode zur Samengewinnung aus dem weiblichen Fortpflanzungstrakt und die Messung der Verflüssigungszeit werden den Forschern ein neuartiges diagnostisches Instrument an die Hand geben, um festzustellen, ob die Verflüssigung eine der Ursachen für Unfruchtbarkeit im Modellorganismus von Interesse sein könnte. Als nächstes folgen die Verfahren, bei denen die Mäuse verpaart und der Vaginalpfropfen bestimmt wird. Es können adulte männliche Mäuse des Typs C57BL/6 oder andere interessante Stämme verwendet werden.Es wurden nur weibliche Tiere im Brunststadium des Zyklus verwendet. Für die detaillierte Methode für den vaginalen Abstrich und die zytologische Analyse verweisen wir auf die zuvor veröffentlichten Verfahren. Um vier Uhr nachmittags.Am Tag der Brunst wurde das Weibchen im Käfig des Männchens untergebracht. Am nächsten Morgen um acht Uhr wird das Weibchen vom Käfig des Männchens getrennt. Mit einem sterilen flachen Zahnstocher wurde das Vorhandensein oder Fehlen einer Ablagerung eines Vaginal- oder Kopulationsplugs als Hinweis auf eine Paarung mit einem Verfahren beurteilt, das an eine zuvor veröffentlichte Methode angepasst war.Als nächstes folgt das Verfahren zur Vorbereitung vor der Gewebeentnahme. Bereiten Sie 10 Milliliter des L-15-Mediums von Leibovitz zu, ergänzt mit 1 % fötalem Rinderserum oder L-15-Medium plus 1 %FBS in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Erwärmen Sie das Medium 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Um die Lebensfähigkeit des Gewebes und der Spermien für nachgeschaltete Anwendungen zu erhalten, aliquotieren Sie zwei Milliliter des Mediums in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen für die Gewebeentnahme. Erwärmen Sie den Tisch des Stereomikroskops auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie den Heizblock auf 37 Grad Celsius ein.Legen Sie ein leeres Rohr in den Heizblock. Erwärmen Sie den Objektträger auch auf 37 Grad Celsius, wenn die nachgeschaltete Anwendung eine Bildgebung der Spermienmotilität erfordert. Als nächstes folgen die Verfahren zur Gewebeentnahme.Hier sind die Werkzeuge, die für die Gewebeentnahme verwendet werden. Euthanasieren Sie das Weibchen sofort nach der Überprüfung des Pfropfens durch Kohlendioxid-Erstickung, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Bringen Sie das Tier in Rückenlage, um den Bauchbereich freizulegen.Sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch. Machen Sie einen kleinen Schnitt von etwa einem Zentimeter auf der Haut am Unterbauch. Ziehe den Schwanz und die Haut in entgegengesetzte Richtungen, um den Bauchmuskel freizulegen.Schneiden Sie den Bauchmuskel V-förmig an der Basis des Bauches ein. Bewegen Sie Darm und Bauchfett zur Seite, um den Fortpflanzungstrakt freizulegen. Schneiden Sie die Blase und anderes Gewebe über dem Vaginalbereich ab.Schneide die Schamsymphyse auseinander, um Zugang zum Vaginalgewebe zu erhalten. Ziehen Sie mit einer Schlauchzange an dem an die Schamsymphyse gebundenen Teil, um den Vaginalkanal freizulegen. Heben Sie das Vaginalgewebe an der Vaginalöffnung an und trennen Sie mit einer Schere den Vaginalkanal vom darunter liegenden Rektumgewebe.Schneiden Sie das mesenteriale Fett von beiden Seiten der Gebärmutter vorsichtig mit einer Federschere ab. Die Gebärmutter ist sehr zerbrechlich mit dem Sperma im Inneren. Daher sollte der Untersucher darauf achten, die Gebärmutter nicht zu punktieren, da sonst der Samen verloren geht.Schneiden Sie das Eierstockfettpolster von beiden Seiten der Eierstöcke ab. Übertragen Sie den gesamten Fortpflanzungstrakt in die Tube mit dem vorgewärmten Medium. Als nächstes folgt die Methode zur Messung der Samenverflüssigung.Hier sind die Werkzeuge für die Samenentnahme. Übertragen Sie drei Milliliter des warmen Mediums in eine 3,5 Zentimeter große Schale. Übertragen Sie das Taschentuch in die Schüssel.Waschen Sie das Taschentuch mehrmals, indem Sie das Fettpolster greifen. Zu diesem Zeitpunkt sollte das Sperma in der Gebärmutter noch intakt sein. Tupfen Sie das Taschentuch auf Kimwipes ab, um überschüssige Medien zu entfernen.Halten Sie das Gewebe am vaginalen Ende und legen Sie das Gewebe in den vorgewärmten Schlauch, indem Sie die Eierstockenden in einen leeren Schlauch heben. Schneide beide Gebärmutterhörner zwischen der Vagina und der Gebärmutter ab. Lassen Sie das Sperma aus den Gebärmutterhörnern in die Eileiter fließen.Verwenden Sie eine zahnlose Pinzette, um Samenreste in den Gebärmutterhörnern sanft herauszudrücken und auszustoßen. Schleudern Sie das Sperma kurz ein bis zwei Sekunden herunter. Verlegen Sie das Rohr parallel zur beheizten Stufe.Führen Sie ein 25-Mikroliter-Kapillarröhrchen in einem Winkel von 180 Grad in die Samenprobe ein. Dies dient dazu, die Variabilität zwischen den einzelnen Untersuchern zu minimieren, die das Kapillarrohr in unterschiedlichen Winkeln halten. Notieren Sie die Zeit, die das Sperma benötigt, um die 25-Mikroliter-Linie zu erreichen.Die Verflüssigungszeit wird durch die Zeit quantifiziert, die benötigt wird, um das 25-Mikroliter-Kapillarröhrchen mit Sperma zu füllen. Es dauerte etwa zwei Minuten, bis das Sperma aus der Kontrolluteri gefüllt war. Der aus der Knockout-Gebärmutter entnommene Samen benötigte jedoch mehr als 60 Minuten Versuchszeit.Diese Daten deuten darauf hin, dass das Sperma in der Kontrolle im Vergleich zur Knockout-Gebärmutter signifikant stärker verflüssigt ist. Hier ist eines der Beispiele für eine nachgelagerte Anwendung mit Videobildgebung der Spermienmotilität. Pipettieren Sie mit einer Pipettenspitze 25 Mikroliter des restlichen Samens auf den vorgewärmten Objektträger, während der Objektträger auf den Heiztisch gestellt wird.Decken Sie die Folie mit einem Glasdeckglas ab. Übertragen Sie den Objektträger auf das Mikroskop, indem Sie das Objektträgerdeckglas nach unten legen. Verwende ein 20-faches Objektiv, um das Sperma zu finden.Wechseln Sie dann zum 100-fach-Objektiv für die Videoaufnahme. Nehmen Sie das Video 30 Sekunden lang mit 12 Bildern pro Sekunde auf. Der aus der Kontrolluteri entnommene Samen zeigt frei schwimmende Spermien im mikroskopischen Feld.Das aus der Knockout-Gebärmutter entnommene Sperma zeigte jedoch, dass der Großteil der Spermien mit minimaler Beweglichkeit zusammengeballt war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Sperma, das acht Stunden nach der Paarung aus dem weiblichen Fortpflanzungstrakt entnommen wurde, für weitere Analysen verwendet werden kann. Zusätzlich zu diesen nachgelagerten Anwendungen können die Forscher auch die Wirkung der Inhibitoren oder Verbindungen von Interesse bewerten, die in verschiedene Prozesse des Spermientransports eingreifen, Prozesse wie die Spermienverflüssigung, die Spermienzahl im Trakt, die Spermienmotilität oder die Spermienmigration in verschiedenen Bereichen des weiblichen Fortpflanzungstrakts.Die Verbindungen können vor der Paarung im weiblichen Fortpflanzungstrakt appliziert werden. Dann kann die Wirkung dieser Inhibitoren oder Verbindungen anhand von Samenproben nach der Paarung beurteilt werden. Diese Methode kann nützlich sein, um die Praktikabilität von Verhütungsmitteln zu testen, die den Spermientransport hemmen.

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll zeigt Methoden zur Gewinnung von Spermien aus den Hoden der Männchen und dann Besamung weiblichen Mäusen. Dieses Verfahren ist nützlich, wenn die genaue Zeit in entwicklungspsychologischen Studien sowie transgene Arbeit benötigt wird.

Harvesting Sperma und künstliche Besamung von Mice

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Viele Behandlungen und genetische Mutationen beeinflussen den Zeitpunkt der Geschlechtsreife und Fruchtbarkeit. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur Evaluierung der pubertären Ausbruch bei Mäusen und Ratten vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Studie bei geschlechtsreifen Tieren.

Bestimmung der reproduktive Kompetenz durch Bestätigung pubertären Beginn und Durchführung eines Fruchtbarkeit Assays bei Mäusen und Ratten

Uteruskontraktionen sind wichtig für das Wohlbefinden von Frauen. Jedoch, pathologisch erhöhte Kontraktilität kann zu Dysmenorrhoe führen, vor allem bei jüngeren Frauen. Hier beschreiben wir eine einfache Ex-vivo-Zubereitung, die eine schnelle Beurteilung der Wirksamkeit von glatten Muskelrelaxantien ermöglicht, die zur Behandlung von Dysmenorrhoe verwendet werden können.

Ex Vivo-Methode zur Beurteilung der spontanen Motilität des Mausreproduktivtrakts und eines MATLAB-basierten Uterus Motion Tracking Algorithmus für die Datenanalyse

Dieser Artikel beschreibt, wie sexuelle Verhaltenstests bei männlichen Mäusen durchzuführen.

Bewertung des Sexualverhaltens männlicher Mäuse

Die vorgestellte Methode zur Manipulation des Gebärmutterhalses kann bei Mäusen eine Pseudoschwangerschaft induzieren, ohne dass Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart werden müssen. Die Induktion einer Pseudoschwangerschaft ist Voraussetzung für den Erfolg des nicht-chirurgischen Embryotransfers und der nicht-chirurgischen künstlichen Befruchtung, die beide ebenfalls vorgestellt werden.

Induktion einer Pseudoschwangerschaft bei weiblichen Mäusen, ohne dass vasektomierte Männchen vor einem nicht-chirurgischen Embryotransfer oder einer künstlichen Befruchtung erforderlich sind

Hier stellen wir eine Methode zur Durchführung der runden Spermatideninjektion (ROSI) bei Mäusen vor, eine Technik mit vielversprechenden klinischen Anwendungen und Nutzen für die Untersuchung der Mechanismen, die der Embryonalentwicklung zugrunde liegen.

Runde Maus-Spermatiden-Injektion

Dieses Verfahren zielt darauf ab, Metaboliten zu identifizieren, die während der Befruchtung von Spermien auf Eizellen übertragen werden, indem stabile Isotopenmarkierungen mit 2H,2O oder U13C Glukose verwendet werden, gefolgt von einer metabolomischen Analyse. Deuterium-markierte Bullen werden mit unmarkierten Müttern verpaart. Gesammelte Präimplantationsembryonen werden mittels Massenspektrometrie analysiert, um väterliche (deuterierte) von mütterlichen (nicht deuterierten) Metaboliten zu...

In-vivo-Markierung stabiler Isotope zur massenspektrometrischen Identifizierung von väterlichen Metaboliten, die während der Befruchtung von Spermien auf die Eizelle übertragen werden

Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

Erfahren Sie die Methode zur Sammlung von postkoitalem Sperma aus dem weiblichen Reproduktionstrakt und zur Messung der Spermaverflüssigung bei Mäusen. Dieses Verfahren liefert wertvolle Einblicke in die Reproduktionsbiologie.

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Weitere Videos entdecken