Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein genetisches Mosaik in der Großhirnrinde der Maus zu erzeugen, indem die Cre-Lox-Rekombination durch in utero-Elektroporation induziert wird. Diese Methode zur Generierung genetischer Mosaike kann helfen, zentrale Fragen der Neurobiologie zu beantworten. Zum Beispiel die Bestimmung, ob ein Gen für einen bestimmten neuronalen Phänotyp auf zellautonome Weise notwendig ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das effektive Cre-Lox-Rekombinationssystem mit einer ebenso effektiven Gentransfertechnik in utero kombiniert wird. Obwohl sich diese Methode auf die Ausrichtung auf kortikale Neuronen der Schichten zwei bis drei konzentriert, kann sie auch verwendet werden, um Neuronen in anderen kortikalen Schichten zu erreichen. Als wir versuchten, genetische Mosaike in unserem Gehirngewebe zu erstellen, stießen wir auf mehrere Probleme, unsere Versuchstiere dazu zu bringen, nach der Geburt zu überleben, also führten wir mehrere Vereinfachungen und Verfeinerungen in unsere Technik ein.

Bereiten Sie eine Pipette mit einem sehr langen Kegel und einer sehr feinen Spitze vor, wie sie für Pipetten für die Injektion embryonaler Stammzellen oder den Kerntransfer typisch ist, indem Sie zuerst die Glaskapillare in den Pipettenabzieher einführen. Aktivieren Sie nach dem Befestigen der Klemmen das Programm zum Zugprotokoll, wodurch eine Verjüngung der Glaskapillare entsteht. Stellen Sie sicher, dass die Kegellänge zwischen 10 und 15 mm liegt, indem Sie ein Verbundlichtmikroskop verwenden.

Um die Spitze der Pipette zu brechen, wischen Sie dann mit einer einlagigen Aufgabe über einen 50-ml-Becher und dehnen Sie ihn mit einer Hand straff. Schieben Sie mit der anderen Hand die gezogene Pipette mit der verjüngten Seite nach unten senkrecht durch die Mitte des Tuchs, was zu einem sauberen Bruch des Kegels führt. Überprüfen Sie die Größe der Öffnung unter einem Verbundlichtmikroskop.

Kalibrieren Sie dann die Pipette, indem Sie 1 mcL 0,4 % Trypanblau und PBS in eine teilweise gefüllte Pipette aspirieren und die Pipette mit 1-mcL-Markierungen basierend auf der Höhe von 1 mcL in der Pipette graduieren. Verwenden Sie die kalibrierte Pipette, um andere gezogene Pipetten vor dem Verwerfen zu graduieren. Legen Sie die Pipetten frei von Staub und anderen Partikeln in den Pipettenhalter.

Nachdem Sie eine schwangere Maus bei E-15,5 tief betäubt haben, testen Sie den Aufrichtreflex, indem Sie die Induktionskammer vorsichtig kippen und die Reaktion der Maus notieren. Wenn der Aufrichtreflex nicht vorhanden ist, bringen Sie die Maus in den chirurgischen Vorbereitungsbereich und verabreichen Sie inhalatives Isofluran durch einen Nasenkonus, um eine chirurgische Anästhesieebene aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Pedalreflex zu testen, um die Anästhesie zu überprüfen.

Überwachen Sie die Atemfrequenz bei Anstrengung, achten Sie auf eine tiefe, regelmäßige Atmung und darauf, dass die Schleimhäute rosa und feucht sind. Tragen Sie genügend veterinärmedizinische Augensalbe auf die Augen auf, um sie zum Schutz vor dem Austrocknen vollständig zu bedecken. Enthaarungscreme mit Wattestäbchen auf den Bauchbereich einmassieren, bis sich das Bauchfell aufgelöst hat.

Wischen Sie dann das Bauchfell ab. Reinigen Sie vorsichtig alle Rückstände und Enthaarungscreme mit 70%Ethanol und Wattestäbchen. Tragen Sie eine Peelinglösung auf Jodbasis in kreisenden Bewegungen auf den Bauchbereich auf.

Verwenden Sie dann ein OP-Tuch, um den Operationsbereich zu isolieren und sterile Bedingungen zu gewährleisten. Nach einem 2 cm langen Schnitt in der ventralen Mittellinie in der Haut suchen Sie die Linea alba, um die Mittellinie des Rectus abdominis sichtbar zu machen. Ziehen Sie den Muskel nach oben und weg vom Bauch und machen Sie einen 2 cm langen Mittellinienschnitt, um die Bauchhöhle mit aseptischen Techniken freizulegen.

Sie Carprofen mit einer sterilen 10-mcL-Mikropipettenspitze zur Analgesie in die Bauchhöhle ab. Als nächstes klemmen Sie eine Hartmann-Mückenzange an den linken Rand des Schnittes rectus abdominis. Legen Sie die Pinzette auf die umgekippte Petrischale links vom Schnitt und halten Sie die linke Seite des Schnitts offen.

Nachdem Sie die rechte Seite des Schnitts auf ähnliche Weise geklemmt haben, legen Sie einen Mullschwamm um den Bereich des Schnitts. Ziehen Sie mit einer Ringzange ohne angebrachte Begrenzungsschraube an der Gebärmutter zwischen zwei benachbarten Embryonen, ohne Gewebe zu zerquetschen oder zu verletzen. Beginnen Sie, alle Embryonen durch den Schnitt herauszuziehen und legen Sie sie auf den Mullschwamm.

Schließen Sie eine kalibrierte Pipette an die Aspiratorröhrchenbaugruppe an und injizieren Sie genau 1 μl DNA-Lösung, die durch die Gebärmutterwand hergestellt wurde, in einen Seitenventrikel jedes Embryos. Verwenden Sie Daumen und Zeigefinger, um die Embryonen zu manipulieren, so dass die Embryonen während der Injektion sanft gegen die Gebärmutterwand gedrückt werden können. Die Seitenventrikel erscheinen als zwei dunklere Flecken auf dem dorsalen Telencephalon des Embryos.

Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion, indem Sie beobachten, wie Trypanblau den Seitenventrikel füllt. Nachdem Sie alle Embryonen injiziert haben, platzieren Sie die Kathode der Pinzettenelektroden auf der Gebärmutter, direkt über der medialen und kaudalen Rinde, um die visuelle Rinde zu erreichen. Platzieren Sie die Anode direkt unterhalb und vor dem Kopf des Embryos.

Lösen Sie mit dem Fußpedal die Abgabe von 550-ms-Impulsen von 50 Volt aus, die durch ein 950-ms-Intervall getrennt sind. Nachdem Sie alle Embryonen elektroporiert haben, bringen Sie die Gebärmutter in der gleichen Ausrichtung, in der sie gefunden wurde, in die Bauchhöhle zurück. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um die Gebärmutter zu schmieren, während Sie sie manuell und äußerst sanft führen, und achten Sie darauf, dass die Embryonen nicht aus ihrer Position in der Gebärmutter verschoben werden.

Verschließen Sie die Bauchmuskulatur mit resorbierbaren Nähten. Verwende einen einfachen, unterbrochenen Stich und binde die Enden mit einem Chirurgenknoten zusammen. Verschließen Sie die Hautschicht mit resorbierbaren Nähten.

Tragen Sie eine kleine Menge Gewebekleber auf, um die Wunde zu versiegeln. Tragen Sie Gewebekleber auf die Knoten auf, um ein Lösen zu verhindern. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Gewebekleber um die Wunde herum zu entfernen, der abgesaugt werden kann.

Sobald der Gewebekleber getrocknet ist, entfernen Sie das Tier aus dem Isofluran und lassen Sie das Weibchen sich alleine in einem warmen Käfig erholen. Überwachen Sie die Maus weiterhin, bis sie vollständig wiederhergestellt ist und sich normal verhält. Nach dem Entfernen setzen Sie das Weibchen wieder in den Käfig mit dem Männchen.

Legen Sie den Schädel mit einlagigen Arbeitstüchern, die mit 1-x PBS angefeuchtet sind, auf eine ebene Fläche. Entfernen Sie mit einer Pinzette zuerst das Hinterhauptbein. Entfernen Sie dann vorsichtig die Scheitelknochen, indem Sie die Pinzette herausnehmen und von der Oberfläche des Gehirns entfernen.

Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute, um eine Schädigung der Hirnrinde zu vermeiden. Klemmen Sie die Rückseite der Pinzette unter dem Gehirn entlang des Schädels, um alle Hirnnerven zu durchtrennen und das Gehirn zu entfernen. Verwenden Sie eine einschneidige Rasierklinge, um einen koronalen Schnitt von etwa 0,5 mm rostral zum Bregma und einen weiteren koronalen Schnitt von etwa 0,5 mm kaudal zum interessierenden Gewebe zu machen.

Der Gewebeblock ist nun bereit für den Schnitt. Die Injektion von 1 mcL von 2 mg/ml GFP Cre führt zu einer spärlichen Verteilung der markierten Zellen, von denen einige hell sein können. Da das Gewebe in einer Tiefe von 100 Mikrometern geschnitten wird, bleiben die meisten dendritischen Dorne erhalten.

Wenn die in utero-Elektroporation am Embryonaltag 15.5 durchgeführt wird, erfolgt die Markierung über die kortikalen Schichten zwei und drei. Dendritische Stacheln können bei hohen Vergrößerungen beobachtet werden. Die Injektion von 1,5 mcL von 2 mg/ml GFP Cre führt zu einer sehr dichten Markierung, die suboptimal sein kann, da es schwierig ist, die Quelle von Neuriten und dendritischen Dornen zu verfolgen.

Durch die Auswahl einer hellen Zelle in der Peripherie des markierten Bereichs ist es jedoch immer noch möglich, ein Neuron und seine Prozesse abzubilden. Alternativ führt die Injektion von SuperNova-Konstrukten zu einer spärlichen Verteilung von Neuronen der Schicht zwei bis drei, die sehr hell markiert sind. Sobald die In-utero-Elektroporationsoperation gemeistert ist, dauert sie weniger als 30 Minuten, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren mit anderen DNA-Konstrukten versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, verschiedene Konzentrationen und Volumina auszuprobieren, um die gewünschte Dünnheit der Markierung zu erreichen, die für die Mosaikanalyse erforderlich ist. Unsere repräsentativen Ergebnisse verwendeten entweder ein einzelnes Konstrukt oder ein kürzlich erfundenes SuperNova-Konstrukt. Bei letzterem stellten wir fest, dass wir eine hervorragende spärliche Markierung erreichen konnten, während wir die Helligkeit der Neuronen maximierten.

Diese Technik könnte auf andere Weise angepasst werden, um Mosaikgewebe im Gehirn zu erzeugen. So kann beispielsweise die Geneditierung von CRISPR und Cas9 mit der In-utero-Elektroporation kombiniert werden, oder die Cre-Lox-Rekombination kann mit der intraventrikulären Injektion viraler Vektoren kombiniert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für mehrere vereinfachte und verfeinerte Techniken haben, die verwendet werden, um ein spärliches genetisches Mosaik zu erreichen, damit Sie Cre-Lox-Rekombination und In-utero-Elektroporation miteinander kombinieren können.

Wir wünschen Ihnen viel Glück.