Name: Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Lernen Sie die In-Utero-Elektroporation zur Induktion von Cre-Lox-Rekombination in Maus-Kortexneuronen. Diese Methode ermöglicht zielgerichtete genetische Mosaikanalysen zur Untersuchung zellautonomer Genfunktionen.

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Die Autoren danken die großzügige Unterstützung der James Madison University Department of Biology und James Madison Universität Licht Mikroskopie und Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele für hilfreiche Ratschläge zur Vorbereitung junger postnatale Gewebe, und DRS. Justin W. Brown und Corey L. Cleland für großzügige Koordinierung der chirurgischen Materialien und Raum. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Collaborative Research Grant durch 4-VA, eine partnerschaftliche Zusammenarbeit zur Förderung der Commonwealth von Virginia (etfolgreich) und durch eine Virginia Akademie der Wissenschaft kleine Projekt Research Grant (etfolgreich) finanziert. Unterstützung hat wurde großzügig zur Verfügung gestellt von einer Betty Jo liebevolle Butler 58 Stiftung für Undergraduate Research Stipendium (K.M.B), ein Sommer-Forschungsstipendium Farrell (auf K.M.B), ein James Madison Universität zweiten Jahrhundert Stipendium (K.M.B), ein James Madison University Centennial Stipendium (C.J.H.), ein James Madison Universität Lucy Robinson Suche 30 Memorial Stipendium (Z.L.H.) und ein James Madison University College von Wissenschaft und Mathematik Fakultät Hilfe gewähren (etfolgreich).

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Hier stellen wir die Kombination von in Utero Elektroporation mit Cre-Rekombinase bei Floxed Mäusen, Mosaik Hirngewebe zu generieren. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass eine neue Mauslinie muss nicht jedes Mal generiert werden ein verschiedenen zellulärer Subtyp wird ins Visier genommen werden: in Utero Elektroporation kann verwendet werden, um exzitatorischen Neuronen, hemmende Neuronen oder Gliazellen je nach Ziel und Lage der Elektroporation15,1...

Generierung von einem genetischen Mosaik ist ein klassischen experimentellen Paradigma zum Verständnis der Funktion eines Gens von Interesse. Um festzustellen, ob ein Gen für eine zelluläre Phänotyp notwendig ist, ist der einfachste Ansatz einen Verlust der Funktion des Gens in den Organismus (z.B. Ko) verursacht. Um festzustellen, ob ein Gen gezielt in einem bestimmten Zelltyp benötigt wird, ist jedoch nicht KO des Gens in den Organismus ein gültiger Ansatz. Stattdessen eine Methode ist erforderlich, dadurch wird den Verlust der Funktion eines Gens in einer bestimmten Zelle während von Wildtyp (d. h. genetisch unbeirrt) Gewebe umgeben ist – in anderen Worten, Mosaik Gewebe zu schaffen. Wenn die mutierte Zelle einen mutierten Phänotyp zeigt, aber umgebenden Wildtyp-Zellen nicht, der Genfunktionen Zelle-autonom. Analyse der Mosaik-Gewebe, in dem Wildtyp Gewebe, mutierte Zellen umgeben sind eignet sich für das Verständnis der Zelle-autonome Funktionen der Gene, vor allem im Gehirn, wo Neuronen und Glia eine große Verbundnetz des Gewebes bilden.
Verschiedene Formen von Mosaik Hirngewebe lieferten leistungsstarke Modelle um Zelle-autonome Funktionen der Gene zu untersuchen. Studien konzentrierten sich auf neuronale Transplantation1weiblichen X-chromosomal Mosaikbildung2,3,4, und endogenen somatische Mosaikbildung5,6 haben ihre Schlußfolgerungen basierend auf Mosaik Hirngewebe. Bedingte Löschung eines Gens durch die Cre Lox Rekombinationssystem ist eine Methode, die die große Verfügbarkeit der transgene Mauslinien nutzt. Bei dieser Methode werden zwei LoxP-Standorten eingeführt, auf beiden Seiten einer erforderlichen Sequenz eines Gens (z. B. ein Exon), flankiert von LoxP-Websites, die beide in die gleiche Richtung ("Floxed") stehen lassen. Cre-Rekombinase beschneidet die Reihenfolge zwischen den LoxP-Websites-7. CRE-vermittelten Rekombination kann durch Kreuzung Floxed Mäuse mit einer anderen Mauslinie mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase zusammen mit einem fluoreszierenden Marker in einer Teilmenge von Zellen ("Cre-Reporter-Linie") erreicht werden. Dies wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten, um die Funktionen eines Gens in Teilmengen von Zellen, wie z. B. exzitatorischen Neuronen oder Astrozyten8aufzudecken nachgewiesen. CRE-Reporter Linien CreERT2 Cre-vermittelten Rekombination sein Medikament-induzierbaren (Single Neuron Etikettierung mit induzierbaren Cre-vermittelten Ko oder glatt) ermöglichen ausdrücken können9. In eine andere Strategie als Mosaik-Analyse mit doppelter Marker (MADM)10,11ermöglicht Cre-vermittelten interchromosomal Rekombination eine homozygote Mutante neben heterozygot Gewebe geschaffen werden. In diesen Ansätzen muss eine neue Linie von Mäusen produziert werden jedes Mal für jeden Kandidaten-gen oder zellulären Subtyp, der überprüft wird. Alternativ kann Cre-Rekombinase postnatal durch Iontophorese12 oder durch virale Vektoren (z.B. Adeno-assoziierten Viren13 oder Lentiviren14 mit zellulären Subtyp-spezifische eingeführt werden Promotoren). Diese Strategie schafft starke und postnatale beschriften. Zu dünn und pränatal zerebrale kortikale Neuronen entwickeln, ist eine ideale Strategie in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase mit einem fluoreszierenden Marker.
Neben der Kombination von Cre Lox Rekombination durch in Utero Elektroporation produzieren Mosaik Gewebe in Vivo, mehrere Anpassungen stellen wir Verfahren aus anderen veröffentlichten Protokolle15,16, 17,18,19,20,21. Wir geben Informationen zum Erfolg in der Zucht timed-trächtige Weibchen zu verbessern. Auch beschreiben wir unsere zwei Strategien einzuführen, spärlich und hellen Kennzeichnung von Neuronen im kortikalen Gewebe: eine Strategie ist, die Ebenen von einem einzigen Konstrukt Codierung für Cre-Rekombinase und einem fluoreszierenden Marker22titrieren. Eine weitere Strategie ist das "Supernova"-System, speziell mit diesen Parametern im Geist23,24verwenden. Darüber hinaus bieten wir Verbesserungen auf die Herstellung von konsistenten Mikroinjektion Pipetten und Vereinfachungen, die in Utero Elektroporation Chirurgie. Zu guter Letzt erläutern wir wichtige Schritte in einem vereinfachten histologischen Präparat, das die Analyse von dendritischen Dornen und dendritischen und axonalen Dorne, ohne weitere Färbung oder Immunohistochemistry ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Siehe "1. Maus-Setup" (Schritt 1.1, "Wildtyp-Mäuse")</td></tr><tr><td>GFP. Cre leerer Vektor</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "einzelnes DNA-Konstrukt, das sowohl für die Cre-Rekombinase als auch für einen Fluoreszenzmarker kodiert"). GFP. Der leere Vektor Cre war ein Geschenk von Tyler Jacks.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "Supernova"-System) und http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) war ein Geschenk von Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "Supernova"-System) und http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) war ein Geschenk von Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.1 "Supernova"-System) und http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) war ein Geschenk von Takuji Iwasato.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>Siehe "2. DNA-Setup" (Schritt 2.3 "Endotoxin-freies Plasmid-Aufreinigungskit")</td></tr><tr><td>Trypanblau-Pulver, BioReagenz-Qualität</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "Trypanblau")</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, ACS, 2,5 kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2,5KG</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, ACS, 500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "KCl")</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>Siehe "2. DNA-Aufbau" (Schritt 2.5 "Na2HPO4")</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch, ReagentPlus, 100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>Siehe "2. DNA-Set-up" (Schritt 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>Salzsäure, ACS-Reagenz, 500</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Siehe "2. DNA-Setup" (Schritt 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.1 "Glaskapillarabzieher")</td></tr><tr><td>3,0 mm breite Rinne Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>FT330B</td><td>Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.1 "Glaskapillarabzieher")</td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren, 4", 1 / 0,75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.1.1 "Glaskapillare")</td></tr><tr><td>Einlagige Soft-Tech Tücher, 4,5"</td> <td>Phenix</td><td>LW-8148</td><td>Siehe "3. Pipetteneinrichtung" (Schritt 3.2.1 "Einlagiges Abwischen der Aufgabe"); Es können auch andere einlagige Tücher (z.B. Kimwipes) verwendet werden.</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette, 7 cm, gerade, 0,7 mm 1x2 Zähne</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.1 "Graefe Pinzette")</td></tr><tr><td>Irisschere, 11,5 cm, gerade, 12er-Pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.1 "Irisschere")</td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Pinzette, 9 cm, gerade, 12er-Pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Hartman-Mückenzange")</td></tr><tr><td>Allzweck-Vliesschwämme, 2" x 2", 4-lagig</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Vlies-Mullschwämme")</td></tr><tr><td>Ringpinzette, 10 cm, gerade, 2,2 mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Ringpinzette")</td></tr><tr><td>Pyrex-Petrischalen komplett, Außendurchmesser & mal; H 100 mm & mal; 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Petrischale")</td></tr><tr><td>Flache Instrumentenablage, Edelstahl, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"</td> <td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>Siehe "4. In utero-Elektroporation" (Schritt 4.1 "Edelstahl-Tablett")</td></tr><tr><td>Platin-Pinzette, 5 mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.3 und 4.16 "Pinzetten-Elektroden")</td></tr><tr><td>ECM 830 Fußpedal</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.3 und 4.17 "Fußpedal")</td></tr><tr><td>ECM 830 Generator</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.3 "Generator")</td></tr><tr><td>Eintierisches Isofluran-Anästhesiesystem mit kleiner Induktionsbox,</td><td>Harvard-Gerät</td><td>#72-6468</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.4 und 4.6 "Nasenkonus", Schritt 4.4 "Induktionskammer")</td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.7 "Veterinär-Augensalbe")</td></tr><tr><td>Space Gel (AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.8 "versiegelter Beutel gefüllt mit übersättigter Salzlösung")</td></tr><tr><td>Haarentferner-Gel-Creme, empfindliche Formel</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.9 "Enthaarungscreme")</td></tr><tr><td>10ul Low Retention Tip Starter (960 Spitzen/Packung)</td><td>Phenix Research Products</td><td>TSP-10LKIT</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.12 "steril 10 & Mikro; L Mikropipettenspitze")</td></tr><tr><td>Aspiratorröhrchen für kalibrierte Mikrokapillarpipetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>Siehe "4. In utero-Elektroporation" (Schritt 4.15 "Montage des Aspiratorschlauchs")</td></tr><tr><td>Geflochtenes resorbierbares Nahtmaterial, 4-0, Nadel NFS-2(FS-2), 27"</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.19 "Resorbierbare Nähte")</td></tr><tr><td>" LiquiVet Rapid" Gewebekleber</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.20 "Gewebeadhäsiv")</td></tr><tr><td>Injektionsspritzen, Polypropylen, Luer-Lock-Spitze, Fassungsvermögen 1,0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.21 "1 mL Spritze")</td></tr><tr><td>BD Precisionglide Spritzennadeln Stärke 26, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.21 "26G, &frac12; &rdquo; </td></tr><tr><td>Nestlets Nesting Material</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>Siehe "4. In-utero-Elektroporation" (Schritt 4.24 "Nistmaterialien")</td></tr><tr><td>Sonnenblumenkerne, Schwarzöl, steril</td><td>Bio-Serv</td><td>S5137</td><td>Siehe "4. In utero Elektroporation" (Schritt 4.24 "Sonnenblumenkerne")</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.1.1 "PFA")</td></tr><tr><td>Economy Pinzette #3, 11 cm, 0,2 x 0,4 mm Spitzen</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.5 "Pinzette")</td></tr><tr><td>Agarpulver</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.8.1 "agar")</td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklingen, #9 Klinge</td><td>Stanley Tools</td><td>#11-515</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.9 "Einschneidige Rasierklinge")</td></tr><tr><td>Probenscheibe S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.9 "vibrierende Mikrotom-Probenscheibe")</td></tr><tr><td>Pufferschale S Montage</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "Pufferschale")</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "vibrierendes Mikrotom")</td></tr><tr><td>Doppelschneidige Rasierklingen</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "Klinge")</td></tr><tr><td>Messerhalter S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.10 "Messerhalter")</td></tr><tr><td>Studio Elements Golden Taklon Rundbürstenset mit kurzem Griff</td><td>Amazon</td><td>B0089KU6XE</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.1 "Pinsel mit feiner Spitze")</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Electron Micron Microscopy Services</td><td>#71869-11</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.1 "Objektträger")</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.3-5.12.4 "Eindeckmittel")</td></tr><tr><td>Deckglas, 24 x 50 mm, Nr. 1</td><td>Phenix Research Products</td><td>MS1415-10</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.12.4 "Deckglas")</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.13.1 "DAPI")</td></tr><tr><td>Festtischmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Lichtmikroskop")</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Konfokalmikroskop")</td></tr><tr><td>4x Objektiv, NA = 0,20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Low-Power-Objektiv")</td></tr><tr><td>20x Objektiv, NA = 0,75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Objektiv mittlerer Leistung")</td></tr><tr><td>60x Objektiv, NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Öl</td><td>Siehe "5. Histologie" (Schritt 5.15 "Hochleistungsobjektiv")</td></tr></tbody></table>

induktion cre lox rekombination in maus großhirnrinde durch elektroporation in utero

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Zelle-autonome neuronale Funktionen der Gene können aufgedeckt werden, indem Sie verursachen Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens in einer kleinen und spärlich Population von Neuronen. Dazu muss erzeugen ein Mosaik in die Neuronen mit Verlust oder Gewinn der Funktion eines Gens von genetisch unbeirrt Gewebe umgeben sind. Hier verbinden wir das Cre-Lox-Rekombinationssystem mit in Utero Elektroporation um Mosaik Hirngewebe zu generieren, die verwendet werden, um die Zelle-autonome Funktion von Genen in Neuronen zu untersuchen. DNA-Konstrukte (erhältlich über Repositories), Codierung für eine fluoreszierende Label und Cre-Rekombinase werden in kortikalen Neuronen mit Genen flankiert mit LoxP-Sites in den Gehirnen von Mäuseembryonen in Utero mit Entwicklung eingebracht Elektroporation. Darüber hinaus beschreiben wir verschiedene Anpassungen, die in Utero Elektroporation-Methode, die Überlebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Diese Methode erfordert auch einen Titer für Cre-vermittelten Rekombination in einer spärlich oder Dichte Bevölkerung der Neuronen. Histologische Präparate von beschrifteten Hirngewebe nicht erforderlich (aber kann angepasst werden) Immunohistochemistry. Die Konstrukte verwendet garantieren, dass das Eindringmittel Neuronen tragen das Gen für Cre-Rekombinase beschriftet. Histologische Präparate können morphologische Analyse von Neuronen durch konfokale Bildgebung der dendritischen und axonalen Lauben und dendritischen Dornen. Weil Verlust oder Gewinn der Funktion im spärlich Mosaik Gewebe erreicht wird, erlaubt diese Methode das Studium der Zelle-autonome Notwendigkeit und Angemessenheit der Gen-Produkte in Vivo.

Die einzelnen Konstrukt GFP. CRE (siehe Materialliste) war elektroporiert bei E15.5 und visualisiert auf P14. Abhängig von der Konzentration des Konstrukts und das Volumen der Injektion erhalten Sie ein spärliches oder dichtes Ergebnis22,26. Beispiel: Injektion von 1 µL von 2 mg/mL GFP. CRE-Ergebnisse in eine spärliche Verteilung der markierten Zellen, von die einige helle (Abbildung 1A) und lokalisie...

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein genetisches Mosaik in der Großhirnrinde der Maus zu erzeugen, indem die Cre-Lox-Rekombination durch in utero-Elektroporation induziert wird. Diese Methode zur Generierung genetischer Mosaike kann helfen, zentrale Fragen der Neurobiologie zu beantworten. Zum Beispiel die Bestimmung, ob ein Gen für einen bestimmten neuronalen Phänotyp auf zellautonome Weise notwendig ist.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das effektive Cre-Lox-Rekombinationssystem mit einer ebenso effektiven Gentransfertechnik in utero kombiniert wird. Obwohl sich diese Methode auf die Ausrichtung auf kortikale Neuronen der Schichten zwei bis drei konzentriert, kann sie auch verwendet werden, um Neuronen in anderen kortikalen Schichten zu erreichen. Als wir versuchten, genetische Mosaike in unserem Gehirngewebe zu erstellen, stießen wir auf mehrere Probleme, unsere Versuchstiere dazu zu bringen, nach der Geburt zu überleben, also führten wir mehrere Vereinfachungen und Verfeinerungen in unsere Technik ein.Bereiten Sie eine Pipette mit einem sehr langen Kegel und einer sehr feinen Spitze vor, wie sie für Pipetten für die Injektion embryonaler Stammz

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Dieser Artikel beschreibt im Detail, ein Protokoll zur in utero elektroporieren die Hirnrinde und im Hippocampus bei E14.5 bei Mäusen. Wir zeigen auch, dass dies eine wertvolle Methode, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen ist.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In diesem Video wird ein genetisch veränderter Mauswelpe, der das Ccm2-Gen trägt, flankiert von loxP-Stellen und Cre-Rekombinase, die an einen Östrogenrezeptor fusioniert ist, verwendet, um zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) zu induzieren. Die Verabreichung von 4-Hydroxytamoxifen aktiviert Cre in Endothelzellen, was zur Deletion von Ccm2 und zur Bildung von CCMs im Gehirn führt.

Cre-LoxP-vermittelte Induktion von zerebralen kavernösen Malformationen in einem Mausmodell

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Die Migration von Neuronen wird durch zahlreiche zellautonome und nicht-zellautonome Faktoren reguliert.  Dieses Protokoll zeigt, wie die In-utero-Elektroporation verwendet werden kann, um festzustellen, ob ein Phänotyp in einer transgenen Maus auf eine Störung eines zellinternen Mechanismus oder eine Beeinträchtigung der Interaktion zwischen dem Neuron und seiner Umgebung zurückzuführen ist.

Induktion der Protein Deletion Durch In Utero Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Astrozyten kacheln die Großhirnrinde gleichmäßig, was die Analyse ihrer komplexen Morphologie auf zellulärer Ebene schwierig macht. Das hier bereitgestellte Protokoll verwendet eine mehrfarbige Etikettierung basierend auf der in utero Elektroporation, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und deren Volumen und Morphologie mit einer benutzerfreundlichen Bildanalyse-Pipeline zu analysieren.

In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

Lernen Sie die In-Utero-Elektroporation zur Induktion von Cre-Lox-Rekombination in Maus-Kortexneuronen. Diese Methode ermöglicht zielgerichtete genetische Mosaikanalysen zur Untersuchung zellautonomer Genfunktionen.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

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