Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

Das übergeordnete Ziel dieses Laborverfahrens ist es, die genetische Heterogenität von HER2 innerhalb des Tumors in einer großen Serie heterogen prozessierter Brustkrebserkrankungen mittels Hochdurchsatz-Silber-in-situ-Hybridisierung gleichzeitig zu definieren, zu quantifizieren und zu vergleichen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Translations- und Forschungsfragen für Brustkrebs zu adressieren, wie z. B. die Untersuchung der Heterogenität der HER2-Genamplifikation, einer großen Kohorte von Fällen, die aus pathologischen Archiven abgerufen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Hochdurchsatz-HER2-Schizoanalyse in verschiedenen topographischen Bereichen von multiplen und heterogen verarbeiteten Brustkrebserkrankungen ermöglicht.

Im Allgemeinen werden Individuen, die neu in der In-situ-Hybridisierung sind, Schwierigkeiten haben, da retrospektive Studien in der Regel die Analyse von Archivproben erfordern, die unterschiedlichen Fixierungs-, Verarbeitungs- und Lagerungsverfahren unterzogen wurden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir beschlossen, alle Brustkrebsarten aus unserer institutionellen Datenbank seit 2003 neu zu klassifizieren. Dieses Verfahren wird von Giulia Ercoli, einer Technikerin aus unserem Labor, vorgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Auswahl von Patienten und Gewebeproben, wie im Textprotokoll beschrieben. Erstellen und öffnen Sie eine neue Tabellenkalkulationsdatei, die die Datensätze der verschiedenen Bereiche jedes Falls enthält. Fügen Sie separate Spalten für die Fall-ID, die Block-ID, die Bereichs-ID, den Gewebetyp, die Topographie, die Morphologie, den Biomarker-Status und alle anderen verfügbaren immunhistochemischen Merkmale hinzu.

Erstellen Sie ein TMA-Projekt. Definieren Sie die PMA-Empfängerblöcke, indem Sie zu Datei, Neu, Block navigieren. Klicken Sie auf das erste Feld, um es auszufüllen und die Abmessungen des Paraffinblocks einzugeben.

Erstellen Sie als Nächstes ein Gewebearray-Projekt, indem Sie zu Datei, Neu, Gewebearray navigieren. Klicken Sie auf das Importsymbol und wählen Sie dann die Vorlagendatei des zuvor erstellten Empfängerblocks aus. Klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie dann einen Millimeter als Spotgröße, indem Sie auf die runde Schaltfläche klicken. Wählen Sie 500 Mikrometer als Spotabstand, d. h. den Abstand zwischen zwei Zentren benachbarter Spots. Klicken Sie dann auf das Rechnersymbol, um die Gesamtzahl der erstellten Spots zu berechnen, die 231 betragen sollte.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Definieren, um Raster und Unterraster zu erstellen. Löschen Sie die Spalten acht und 15 sowie die mittlere Zeile. Halten Sie drei Punkte der ersten Linie zur Orientierung aufrecht.

Die endgültige Karte soll eine Gesamtzahl von 183 Spots umfassen. Definieren Sie die Liste der Gewebetypen, indem Sie zu Datei, Neu, Liste der Gewebetypen navigieren. Definieren Sie dann das Projekt, indem Sie zu Datei, Neu, Booster-Projekt navigieren.

Bereiten Sie als Nächstes die Akzeptorblöcke vor. Füllen Sie gereinigte Metallformen mit elastischem Paraffin bei 65 Grad Celsius. Lassen Sie die Paraffinblöcke über Nacht in den Metallformen bei Filmtemperatur abkühlen.

Am nächsten Tag die Paraffinblöcke aus den Metallformen extrahieren. Erstellen Sie die TMA mit einem automatisierten oder halbautomatischen Arrayer, indem Sie zuerst den Arrayer einschalten und dann die Akzeptanzblöcke in das Arrayer-Karussell einfügen. Definieren Sie die Startposition auf jedem Empfängerblock, indem Sie das Laserlicht mit den Pfeiltasten verschieben und an der oberen linken Kante auf dem Paraffin des Empfängerblocks ausrichten.

Klicken Sie auf Weiter und wiederholen Sie den Vorgang für die vertikale Ausrichtung. Klicken Sie erneut auf Weiter, um automatisch ein Loch in der zuvor definierten Koordinate des Empfängerblocks zu erstellen. Leeren Sie den Locher.

Positionieren Sie den Spenderblock für die Probenahme und entnehmen Sie einen Gewebekern aus dem zuvor annotierten Interessenbereich. Führen Sie den Kern des Spendergewebes in das Loch im Empfängerblock ein. Entfernen Sie dann den Donorblock aus dem Arrayer.

Wiederholen Sie diese Schritte, bis die TMA abgeschlossen ist. Legen Sie die Gewebeseite des neu generierten TMA-Blocks auf einen sterilen Objektträger und legen Sie sie für fünf Minuten bei 45 Grad Celsius in den Laborofen. Drücken Sie den Block fünf Sekunden lang vorsichtig auf den Objektträger, um die Gewebekerne abzuflachen.

Wiederholen Sie dies einmal für insgesamt zwei Mal. Bedecken Sie anschließend die TMA-Gewebeoberfläche mit einer dünnen Schicht elastischem Paraffin bei 65 Grad Celsius. Lassen Sie den TMA-Block zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie schließlich den TMA-Block 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie histochemische und immunhistochemische Analysen durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie die TMA-Objektträger zur Analyse 10 Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Starten Sie dann das Immunstainer-Instrument und die Software.

Klicken Sie in der Startansicht auf die Schaltfläche Protokolle und dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten. Wählen Sie das duale ISH-Cocktail-Verfahren aus, um die Basisvorlage zu ändern. Markieren Sie das Backen in der Boxliste und stellen Sie die Temperatur für 20 Minuten auf 63 Grad Celsius ein.

Dann kennzeichnen Sie die Entparaffinierung. Markieren Sie als nächstes die Zellkonditionierung in der Boxliste. Markieren Sie dann die Zellkonditionierung CC2 und stellen Sie die Temperatur auf 86 Grad Celsius und die Inkubationszeit auf vier Minuten ein.

Flagge für acht Minuten mildes CC2, Standard für 12 Minuten und verlängert um acht Minuten. Markieren Sie ISH-Protease drei in der Boxliste und stellen Sie die Inkubationszeit auf 16 Minuten ein. Wählen Sie das HER2-Dinitrophenyl und das Digoxigenin des Chromosoms 17 der Sonde aus.

16 Minuten inkubieren und dann die Denaturierung für 20 Minuten auf 80 Grad Celsius einstellen. Stellen Sie die Inkubationszeit der Sonde auf sechs Stunden ein. Stellen Sie dann die Inkubationszeit des SHISH-Multimers auf 32 Minuten ein.

Stellen Sie das Silberchromat und die Inkubationszeit auf vier Minuten ein. Stellen Sie als Nächstes die Inkubationszeit des roten Multimers auf 24 Minuten ein. Stellen Sie das rote Chromat und die Inkubationszeit auf acht Minuten ein.

Markieren Sie dann die Gegenfärbung in der Boxliste, wählen Sie Hämatoxylin zwei aus und stellen Sie die Inkubationszeit auf acht Minuten ein. Markieren Sie die Gegenfärbung nach der Färbung in der Boxliste, wählen Sie das Bläuereagenz und stellen Sie die Inkubationszeit auf vier Minuten ein. Führen Sie schließlich eine Schizoanalyse für HER2 durch.

Bewerten Sie die HER2-Genamplifikation als positiv, wenn das Verhältnis der HER2-Chromosomenzählsonde 17 größer oder gleich 2,0 ist und die durchschnittliche HER2-Kopienzahl größer oder gleich 4,0 Signale pro Zelle ist. Als negativ bewerten, wenn das Verhältnis der HER2-Chromosomenzählungssonde 17 weniger als 2,0 beträgt und die durchschnittliche HER2-Kopienzahl weniger als 4,0 Signale pro Zelle beträgt. Hier sind repräsentative Mikroskopaufnahmen zu sehen, die die Silber-in-situ-Hybridisierungsanalyse eines heterogenen HER2-Brustkrebses zeigen.

In diesem paradigmatischen Beispiel zeigen zwei unterschiedliche Bereiche von hochgradigem invasivem Brustkrebs ohne besonderen Typ unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf die HER2-Genamplifikation, visualisiert als schwarze Punkte, verglichen mit der zentromeren Zählsonde 17, die als rote Punkte visualisiert ist. Insbesondere ein Bereich, der zum Tumorkern gehört und ein unregelmäßiges Cytokeratin-7-Färbemuster aufweist, wurde HER2-amplifiziert, während ein einzelner Punkt vor der invasiven Front ein Wildtyp-HER2-Muster aufwies. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine lesbare Schizoanalyse von gewebemarkierten Arrays durchführen können, die mehrere und heterogen verarbeitete Brustkrebsarten umfassen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Werktagen nach der Fallauswahl durchgeführt werden. Obwohl diese Methode für Brustkrebs optimiert ist, kann sie auf andere Krebsarten übertragen werden, bei denen die HER2-Heterogenität von entscheidender Bedeutung ist, wie z. B. Magenkrebs. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die einfache Beurteilung von HER2, da sie für die umfassende Kartierung mehrerer topographischer Bereiche bei größeren Serien von Brustkrebserkrankungen konzipiert ist.

Während dieses Verfahrens ist es wichtig, Risse im TMA-Block zu vermeiden. Selbst ein minimaler Riss im Paraffin lässt auf die Qualität, Reproduzierbarkeit und Gesamtklarheit der in situ Hybridisierung schließen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Proteomik von Brustkrebs zu beantworten, insbesondere im Hinblick auf die Heterogenität innerhalb und zwischen den Tumoren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit TMA-Stempeln und heißem Paraffinwachs gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Einweghandschuhen aus Nitril getroffen werden sollten.